基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)模式生物釀酒酵母接合型的鑒定—PCR法

劉超，韓雅婷，楊冰，孫琰，王璽

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，天津300070）

論著

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)模式生物釀酒酵母接合型的鑒定—PCR法

劉超，韓雅婷，楊冰，孫琰，王璽

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，天津300070）

目的：利用PCR法鑒定釀酒酵母a、α單倍體或a/α雙倍體三種接合型。方法：根據(jù)釀酒酵母a、α或a/α三種接合型MAT基因座及附近序列信息，分別設(shè)計(jì)特異的寡核苷酸引物。提取釀酒酵母DNA作為模版和利用單菌落PCR法，進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。結(jié)果：MATa基因座特異性引物能在a和a/α接合型中擴(kuò)增出特異性條帶；MATα基因座特異性引物則能在α和a/α接合型中擴(kuò)增出特異性條帶。結(jié)論：利用PCR鑒定釀酒酵母接合型是一種操作簡單、準(zhǔn)確靈敏的方法，為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)單細(xì)胞真核模式生物的研究提供方便。

釀酒酵母；接合型；MAT基因座；PCR鑒定；單菌落PCR

在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種低等的單細(xì)胞真核生物，具有易培養(yǎng)、生長速度快、遺傳背景清楚、基因工程操作簡便等特點(diǎn)，廣泛用于真核細(xì)胞的研究，包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、染色體結(jié)構(gòu)與功能、DNA復(fù)制與修復(fù)、基因表達(dá)與信號通路調(diào)控、自噬等生物過程以及線粒體相關(guān)疾病、抗癌藥物的研發(fā)和篩選等[1-5]。因此，釀酒酵母是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中重要的研究工具。釀酒酵母具有單倍體a或α、二倍體a/α三種接合型，由位于III號染色體長臂上的MAT基因座決定，不同接合型的釀酒酵母具有性別特異的基因表達(dá)。傳統(tǒng)檢測酵母接合型的方法是通過觀察其是否能與已知接合型的測試菌株雜交。但是這種方法操作繁瑣，耗時(shí)要至少1 d，結(jié)果準(zhǔn)確率低，易受細(xì)胞狀態(tài)、環(huán)境因素和遺傳背景影響[6]。MAT基因座位于III號染色體長臂上，距中心粒約100 kb，分為5個區(qū)域（W,X,Y,Z1和Z2），Ya和Yα分別包含有性別特異基因的啟動子和開放讀碼框[7-8]。本研究計(jì)劃根據(jù)基因組中性別決定的MAT基因座及附近序列信息分別設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR法鑒定菌株的接合型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 釀酒酵母菌種YPH499（MATa）、YPH500（MATα）和YPH501（MATa/α）（天津醫(yī)科大學(xué)發(fā)育與腫瘤發(fā)生表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室)，含2%葡萄糖YPD培養(yǎng)基，Taq DNA聚合酶、dNTP（美國Thermo Fisher Scientific公司），DNA HyperLadder I（美國Gentuar公司）。

311系列 CO2培養(yǎng)箱（美國 Thermo Fisher Scientific公司），ZWY-240全溫型多振幅軌道搖床（上海智城公司），S1000梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司），D30核酸蛋白測定儀、Centrifuge 5427R冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），SynGene Gene Genius全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國SynGene公司），EPS 200電泳儀（上海天能公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中釀酒酵母性別決定的MATa和MATα基因座及附近基因序列，設(shè)計(jì)并委托生物工程(上海)有限公司合成引物（表1）。

表1 PCR引物Tab 1 PCR primers

1.2.2 酵母基因組的提取 提取酵母基因組DNA方法參照文獻(xiàn)[9]。接種酵母到2.5 mL酵母試管培養(yǎng)基中（YPD培養(yǎng)基），30℃培養(yǎng)16～18 h（OD600=0.4）；取200μL酵母培養(yǎng)液，室溫下，1500×g離心5～10min收集菌體；菌體用滅菌水洗1次，1500×g離心5min。用100 μL CH3COOLi（0.2 mol/L醋酸鋰，1%SDS）重懸細(xì)胞，70℃孵育5 min，加入300 μL無水乙醇，充分混勻，15 000×g離心3 min，將沉淀用70%的酒精洗滌1次后風(fēng)干。風(fēng)干后的DNA溶于100 μL H2O或TE緩沖液中，15 000×g離心15 s去除細(xì)胞碎片，轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中，-20℃保存。

1.2.3 單菌落PCR模板制備 取直徑為1 mm的單菌落，用5 μL水懸浮，95℃處理5 min[10]。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為25 μL，包括：10× PCR緩沖液（含Mg2+）2.5 μL，提取的酵母基因組或單菌落PCR模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（2.5 μmol/L）各2.5 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。

PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1.5 min，21個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，并照相保存。

2 結(jié)果

位于III號染色體長臂上的MAT基因座，長約2 500 bp，其中Ya長約700 bp，Yα長約850 bp，含有各自性別特異的基因序列。III號染色體上還具有另外兩個具有Y區(qū)的基因座，分別為位于短臂上的HMLα基因座和長臂上MAT基因座與端粒之間的HMRa基因座，這兩個基因座通常是沉默的，在接合型突變中作為基因重組的供體（圖1）。根據(jù)MAT基因座Ya和Yα的序列差異分別設(shè)計(jì)接合型特異的引物，P1為MAT基因座下游公共的下游引物，P2和P3分別為Ya和Yα序列特異的上游引物（圖1）。引物序列見表1。

圖1 III號染色體上的MAT基因座Fig 1 The MAT locus in chromosome III

從電泳圖譜可以看出，常規(guī)PCR和單菌落PCR中，陰性對照無條帶，P1和P2作上下游引物時(shí)能夠在a接合型和a/α接合型酵母中擴(kuò)增出約864 bp的條帶，而在α接合型酵母中則無條帶（圖2）；P1和P3作上下游引物時(shí)能夠在α接合型和a/α接合型酵母中擴(kuò)增出約864 bp的條帶，而在a接合型酵母中則無條帶（圖3）。兩組引物擴(kuò)增出的條帶均與期望的條帶大小一致。

單菌落PCR和提取基因組進(jìn)行常規(guī)PCR的結(jié)果相似，都獲得了大小一致且清晰的條帶，證明設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增效率高、特異性好。由于單菌落PCR的方法成本低、操作快速簡便，實(shí)用性更強(qiáng)。

圖2 P1和P2作引物PCR檢測MATaFig 2 Identification of MATa by PCR with P1 and P2

圖3 P1和P3作引物PCR檢測MATαFig 3 Identification of MATα by PCR with P1 and P3

3 討論

釀酒酵母是主要的生物乙醇和釀酒業(yè)發(fā)酵菌株，而且作為研究真核細(xì)胞的模式生物，在闡明許多生物過程和機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，對于細(xì)胞自噬作用分子機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因重組機(jī)制、衰老與凋亡機(jī)制等的了解，幾乎都來源于對酵母的研究。例如，對于釀酒酵母接合型轉(zhuǎn)換的研究，從這一高度精細(xì)調(diào)控的生物過程中，了解了基因表達(dá)調(diào)控、染色體結(jié)構(gòu)、同源重組機(jī)制的許多方面，如Sir蛋白家族通過嚴(yán)格調(diào)控HO基因的表達(dá)，并以HMLα或HMRa作為同源重組的供體，調(diào)節(jié)接合型之間的轉(zhuǎn)換[11]。在利用酵母進(jìn)行研究的過程中，經(jīng)常需要測定菌株接合型。傳統(tǒng)測定酵母接合型的方法主要是通過觀察待測菌株是否能與已知接合型的單一營養(yǎng)缺陷型測試菌株雜交。例如以MATa（thr4-）或MATα（thr4-）作為測試菌株，而待測菌株通常為野生型，可能具有多種營養(yǎng)缺陷但不包含thr4-，這樣測試菌株和待測菌株都不能單獨(dú)在基本培養(yǎng)基上生長，只有發(fā)生異性接合相互彌補(bǔ)各自的營養(yǎng)缺陷所形成的二倍體菌體，才能在基本培養(yǎng)基上生長，由此實(shí)現(xiàn)待測菌株接合型的鑒定。但是這種方法操作過程繁瑣，耗時(shí)長，結(jié)果易受多種因素影響，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。例如細(xì)胞狀態(tài)、培養(yǎng)板和溫度等環(huán)境因素可能會影響雜交的效率，菌株間的遺傳背景可能會發(fā)生營養(yǎng)缺陷并不互補(bǔ)情況等[6]。而且有時(shí)為了獲得合適的酵母菌株，往往需要篩選數(shù)十個甚至上百個重組子，使得鑒定釀酒酵母接合型的工作量增加、實(shí)驗(yàn)成本升高。

本研究利用PCR方法，根據(jù)酵母單倍體a、α或二倍體a/α三種接合型中III號染色體性別決定的MATa和MATα基因座及其附近序列信息，分別設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MATa的特異性引物能在a和a/α接合型中擴(kuò)增出864 bp特異性條帶；MATα的特異性引物則能在α和a/α接合型中擴(kuò)增出864 bp特異性條帶。通過使用不同引物進(jìn)行PCR并觀察結(jié)果的條帶位置，一般不超過6 h，便能鑒定出釀酒酵母的接合型。本方法的特點(diǎn)是：首先，本研究是根據(jù)釀酒酵母基因組序列設(shè)計(jì)并合成的寡核苷酸引物，具有序列特異性；第二，這是一種新建的利用PCR鑒定釀酒酵母結(jié)合型的方法，與傳統(tǒng)方法相比，具有耗時(shí)少，結(jié)果準(zhǔn)確，不受細(xì)胞狀態(tài)、遺傳背景、環(huán)境因素等影響的優(yōu)點(diǎn)。第三，本研究采用的單菌落PCR法，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與提取酵母基因組作為模板的常規(guī)PCR法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，也有效地?cái)U(kuò)增出了目的條帶。但是單菌落PCR省去了提取基因組步驟，不僅實(shí)驗(yàn)成本低，而且進(jìn)一步節(jié)省了約18 h的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，具有更加簡單、經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)[12-13]。

綜上所述，本文提供利用設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸引物新建的PCR法能夠直接快速地鑒定釀酒酵母的接合型，在釀酒酵母研究中具有較大的應(yīng)用前景。這種設(shè)計(jì)并利用特異性寡核苷酸引物進(jìn)行PCR用于鑒定單細(xì)胞真核模式生物性別的方法為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究提供了方便。

[1] Wang R,Mozziconacci J,Bancaud A,et al.Principles of chromatin organization in yeast:relevance of polymer models to describe nuclear organization and dynamics[J].Curr Opin Cell Biol,2015,34: 54

[2] Ren J,Wang C L,Sternglanz R.Promoter strength influences the S phase requirement for establishment of silencing at the Saccharomyces cerevisiae silent mating type Loci[J].Genetics,2010, 186（2）:551

[3] Feng Y,He D,Yao Z,et al.The machinery of macroautophagy[J]. Cell Res,2014,24（1）:24

[4] Lasserre J P,Dautant A,Aiyar R S,et al.Yeast as a system for modeling mitochondrialdisease mechanismsand discovering therapies[J].Dis Model Mech,2015,8（6）:509

[5] Matuo R,Sousa F G,Soares D G,et al.Saccharomyces cerevisiae as a model system to study the response to anticancer agents[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2012,70（4）:491

[6]Sherman F.Getting started with yeast[J].Methods Enzymol,1991, 194:3

[7] Astell C R,Ahlstrom-Jonasson L,Smith M,et al.The sequence ofthe DNAs coding for the mating-type loci of Saccharomyces cerevisiae[J].Cell,1981,27（1 Pt 2）:15

[8] Haber J E.Mating-type genes and MAT switching in Saccharomyces cerevisiae[J].Genetics,2012,191（1）:33

[9] L?oke M,Kristjuhan K,Kristjuhan A.Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications[J].Biotechniques,2011,50 (5):325

[10]陳忠翔，房志家，陳婷，等.一種簡單高效的酵母單菌落PCR方法[J].生物技術(shù)通訊，2013（2）:225

[11]Li J,Co?c E,Lee K,et al.Regulation of budding yeast matingtype switching donor preference by the FHA domain of Fkh1[J]. PLoS Genet,2012,8（4）:e1002630

[12]Güssow D,Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Res，1989，17（10）:4000

[13]徐麗，蔡俊鵬.菌落PCR方法的建立及其與常規(guī)PCR方法的比較[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，32（5）:51

（2015-10-27收稿）

Identification of the mating-type of model organism S.cerevisiae in basic medical science by PCR

LIU Chao，HAN Ya-ting，YANG Bing，SUN Yan，WANG Xi
（Department of Cell Biology,School of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective：To identify S.cerevisiae mating-type to be a,α haploid or a/α diploid by PCR.Methods：Specific PCR primers were designed according to the MAT locus and its nearby sequence of the three mating-types,and applied in specific PCR reaction using genome DNA as template or the method of colony PCR.Results：A specific band was obtained in a or a/α mating-type when specific primers were used on MATa,while a specific band was obtained in α or a/α mating-type by using specific primers on MATα.Conclusion：With specific primers,PCR may be a convenient,fast and precise method to identify S.cerevisiae mating-type,which could facilitate the study of monocellular eukaryotes model organism in basic medical science.

S.cerevisiae;mating-type;MAT locus;PCR identification;colony PCR

Q2

A

1006－8147（2016）03-0256-03

劉超（1990-），男，碩士在讀，研究方向：腫瘤表觀遺傳學(xué)；通信作者：王璽，E-mail：wangxi@tijmu.edu.cn。