載脂蛋白E基因多態(tài)性與阿爾茨海默病的相關(guān)性研究

劉建強，王晴，井超

載脂蛋白E基因多態(tài)性與阿爾茨海默病的相關(guān)性研究

劉建強，王晴，井超

目的：探討載脂蛋白E（ApoE）的多態(tài)性與阿爾茨海默?。ˋD）的相關(guān)性。方法：選取老年AD患者75例為AD組，另選取同期體檢的健康老年人86例為對照組，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法（PCR-RFLP）對2組的ApoE基因多態(tài)性進行鑒定，并分析其與AD患病的相關(guān)性。結(jié)果：AD組ε3/ε4基因型頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.27，P＜0.05），ε3/ε3是最常見的基因型；AD組ε4等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.40，P＜0.05），ε3是最常見的等位基因。相關(guān)危險度分析顯示，ApoE的三個等位基因中ApoE ε4基因與AD有相關(guān)性（RR=3.76，P＜0.05），Apo ε2和Apo ε3基因與AD無相關(guān)性（RR=0.64、0.32，P＞0.05）。ε4基因為1或2個的患者AD患病率更高（χ2=3.87、4.62，P＜0.05）。結(jié)論：ApoE ε 4基因是AD患病的重要危險因素。

載脂蛋白E；阿爾茨海默??；基因多態(tài)性；相關(guān)性

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是多發(fā)于高齡人群的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。目前的研究僅表明AD的發(fā)病與遺傳因素有一定聯(lián)系，但其具體病因尚無定論[1]。近年來，越來越多的研究顯示AD患病可能與載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）有關(guān)。由于ApoE基因處于19號染色體，其本身具有多態(tài)性，故ApoE與AD的具體聯(lián)系仍需分析[2]。為此，本研究比較AD患者與正常老年人的ApoE基因多態(tài)性，分析其與AD的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2015年5月我院收治的老年AD患者75例為AD組，均符合美國精神病學(xué)會制定的DSM-Ⅳ中有關(guān)AD的診斷標準，男31例，女44例；年齡66～82歲，平均（74.8±8.5）歲；排除因外傷、心腦血管疾病等所致癡呆。另選取同期來院體檢的健康老年人86例為對照組，男35例，女51例；年齡65～84歲，平均（75.1±8.3）歲。所有受試者之間均不存在血緣關(guān)系。2組的年齡、性別等相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

采集受試者外周靜脈血3 mL，并加入ACD液抗凝待檢，而后通過常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA。將基因組DNA作為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）對ApoE多態(tài)性進行檢測。引物由上海Invitrogen生物工程公司提供，引物序列：上游引物A為5’-ATGCCATGACCTGCAGAATT-3’，上游引物B為5’-ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3’，上游引物C為5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’,上游引物C為5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，上游引物D為5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，公共下游引物E為5’-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3’。50 μL的PCR反應(yīng)體系中，包含5 μL 10×緩沖液、1 μL乙酰胺、2.5 U Taq聚合酶、40 pmol引物P1、40 pmol引物P2、5 μL二甲亞砜、2.5 μL dNTP（2 mmol/L）、5 μL DNA。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min，之后依95℃ 1 min→65℃ 1 min→72℃5 min共進行35次循環(huán)[3]。擴增產(chǎn)物長度為169 bp，使用2%瓊脂糖凝膠電泳確認擴增成功后（圖1），加入限制性內(nèi)切酶Hha I對擴增進行酶切，所得產(chǎn)物再通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用溴化乙錠染色成功后置于紫外透射反射儀中觀察片段，并對ApoE基因進行分型[4]。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用率（%）表示，χ2檢驗，采用相對危險度（relative risk，RR）對ApoE等位基因與AD患病的相關(guān)性進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組ApoE基因型與等位基因多態(tài)性比較

2組ApoE基因型多態(tài)性相比，AD組ε3/ε4基因型頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.27，P＜ 0.05），ε3/ε3是最常見的基因型；等位基因多態(tài)性相比，AD組ε4等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.40，P＜0.05），ε3是最常見的等位基因，見表1。

2.2 ApoE等位基因與AD的相關(guān)性

對照組和AD組中含ε4例數(shù)分別為13、31例，RR分析顯示，ApoE的3個等位基因中ApoE ε4基因與AD相關(guān)（RR=3.76，P＜0.05），Apo ε2和Apo ε3基因與AD無相關(guān)性（RR=0.64、0.32，P＞0.05）。

2.3 ApoE ε4基因與AD患病率的相關(guān)性

全部受試者依據(jù)含ApoE ε4基因的個數(shù)，分為無ε 4基因組（n=144）、1個ε4基因組（n=13）和2個ε4基因組（n=4），分別發(fā)生AD 63例（43.8%）、9例（69.2%）、3例（75.0%），進一步分析ε4基因個數(shù)與AD患病的關(guān)系。結(jié)果顯示，1個ε4基因組和2個ε4基因組的AD患病率更高（χ2=3.87、4.62，P＜0.05）。

3 討論

AD是一種以智力衰退、認知障礙等為特征的異質(zhì)性神經(jīng)失調(diào)疾病，是導(dǎo)致老年人出現(xiàn)認知障礙的最主要原因。研究表明，影響AD患病的基因位點共4個，分別處于第1、14、19和21號染色體，但唯一得到證實的僅有ApoE基因[5]。ApoE是人體中重要的載脂蛋白，在腦中主要作為膽固醇的載體，參與機體組織修復(fù)、血漿脂蛋白代謝、神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)等過程。ApoE基因處于第19號染色體長臂13區(qū)2帶，包含有ε2、ε3和ε4三類等位基因，其中以ε3最為常見，而ε3/ε3則是最常見的一類基因型。為了進一步探明ApoE與AD患病間的關(guān)系，本研究著重比較AD患者與正常老年人的ApoE基因多態(tài)性[6]。

表1 2組ApoE基因型與等位基因多態(tài)性比較[n(%)]

相關(guān)研究曾對AD患者與健康者的ApoE基因資料進行回顧性分析，結(jié)果顯示AD患者的ε4基因頻率明顯更高，提示其與AD可能存在相關(guān)性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，2組ApoE基因型多態(tài)性相比，AD組ε3/ε4基因型頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.27，P＜0.05），ε3/ε3是最常見的基因型；等位基因多態(tài)性相比，AD組ε4等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.40，P＜0.05），ε3是最常見的等位基因。這一結(jié)果支持ApoE ε4基因與AD患病存在可能聯(lián)系。有研究表明，AD的病理特征為神經(jīng)細胞外存在淀粉樣蛋白沉淀、神經(jīng)細胞消失以及細胞內(nèi)存在神經(jīng)元纖維纏結(jié)，其中淀粉樣蛋白沉淀的出現(xiàn)主要與腦內(nèi)乙酰膽堿含量的下降有關(guān)[8,9]。結(jié)合相關(guān)文獻，筆者分析ε4基因會對人淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因產(chǎn)生一定作用，通過影響APP基因的水解位點從而使淀粉樣蛋白沉淀增加，導(dǎo)致乙酰膽堿含量的減少，促使AD發(fā)生[10,11]。

本研究還對ApoE ε4基因與AD患病間的相關(guān)性進行危險度分析，結(jié)果顯示ApoEε4基因與AD相關(guān)（RR=3.76，P＜0.05），Apo ε2和Apo ε3基因與AD無相關(guān)性（RR=0.64、0.32，P＞0.05）。相關(guān)文獻表明，ε2基因與ε4基因作用相反，前者對AD主要起保護作用，后者則增加了AD患病的可能。但也有研究發(fā)現(xiàn)，許多攜帶ε4基因，甚至基因型為純合子的高齡老人到90歲仍未發(fā)生AD，這提示除ε4基因外也存在其他因素影響AD的發(fā)病。本研究還顯示，ε4基因為1或2個的患者AD患病率更高（P＜0.05）。有報道稱，發(fā)現(xiàn)AD的患病率與ε4基因的個數(shù)呈正相關(guān)，家族性的AD患者中隨著ε4基因的個數(shù)增加，AD的患病率甚至可增至90%，這與本研究結(jié)果相似[12,13]。此外，某些學(xué)者還發(fā)現(xiàn)患者的年齡與AD的發(fā)病存在聯(lián)系，攜帶ε4基因者在56～74歲時更有可能發(fā)生AD，其余年齡段發(fā)病則主要由其他因素決定，結(jié)論符合AD發(fā)病的多因素影響理論[14,15]。

綜上所述，ApoE ε4基因是AD患病的重要危險因素，ε4基因個數(shù)的增加會提高AD的患病率。

[1]許紹武.多奈哌齊明顯改善老年癡呆病人的睡眠呼吸暫停[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2010,13:1 345- 1 346.

[2]Youngshi NL,victoria MK,edward BL,et al.α-Syn suppression reverses synaptic and memory defects in a mouse model of dementia with Lewy bodies[J].J Neurosci,2011,31:1007-1008.

[3]周勇杰,張蕙實.喹硫平與利培酮治療老年癡呆精神行為癥狀的臨床對照研究[J].中國民康醫(yī)學(xué),2012,24:1434-1436.

[4]任婷婷,鄧凇,王錦支.老年癡呆患者載脂蛋白E增強子基因多態(tài)性分析[J].貴州醫(yī)藥,2012,36:34-35.

[5]金范瑩,張寶榮.老年癡呆的遺傳機制研究進展[J].生命科學(xué),2014, 26:346-347.

[6]許坤.老年骨代謝衰退和認知功能障礙的中醫(yī)病機相關(guān)性的研究[D].南京中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[7]宼嘉燁.奧氮平聯(lián)合多奈哌齊治療老年癡呆精神行為障礙的對照研究[J].中國基層醫(yī)藥,2012,19:2193-2194.

[8]張榮.阿立哌唑與奧氮平治療老年癡呆精神行為障礙對照研究[J].中外醫(yī)療,2011,30:123-124.

[9]郭宏敏.ApoE基因與老年癡呆癥中醫(yī)證型的相關(guān)性研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,27:90-91.

[10]王長福,肖陽,武立華.APP轉(zhuǎn)基因小鼠及其在抗老年癡呆中藥研究中的應(yīng)用[J].哈爾濱醫(yī)藥,2012,32:909-910.

[11]于嵩.姜黃素對帕金森病及阿爾茨海默病神經(jīng)元保護作用[D].中國醫(yī)科大學(xué),2010.

[12]陳國華,梅瑰,邱昕,等.黃連解毒湯對APP/PSI雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦組織IL-6、IL-1β水平及SP、NETs數(shù)量的干預(yù)作用[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2011,18:909-910.

[13]張?zhí)m青.老年認知功能損害危險因素分析及臨床治療探討[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2013,8:119-120.

[14]霍云翔,王敏.奮乃靜與喹硫平治療老年期癡呆伴精神行為癥狀的療效比較[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2014,9:345-346.

[15]李曉華.阿爾茲海默病β-淀粉樣蛋白清除相關(guān)基因的研究進展[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2010,5:45-46.

（本文編輯：王晶）

Correlation between Apolipoprotein E Gene Polymorphisms and Alzheimer’s Disease

LIU Jianqiang,WANG Qing,JIN Chao.
Department of Neurology,Central Hospital of Zibo,Shandong 255036,China

Objective:To explore the correlation between the polymorphisms of apolipoprotein E(ApoE)and alzheimer's disease(AD).Methods:Total 75 AD patients were enrolled as AD group,and 80 healthy old people were enrolled as control group.The polymorphisms of ApoE gene were identified with the method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Its correlation with AD was analyzed.Results:ε3/ε4 genotype frequency in the AD group was higher than that in the control group,with significant difference(χ2=4.27,P＜0.05).ε3/ε3 was the most common genotype.The frequency of ε4 alleles polymorphism in the AD group was higher than that in the control group,with significant difference(χ2=4.40,P＜0.05).ε3 alleles polymorphism was the most common.Related risk analysis showed that ε4 gene were associated with AD(RR= 3.76,P＜0.05),while ε3 and ε2 were not associated with AD(RR=0.64,0.32,P＞0.05).The prevalence of AD with one or two ε4 gene was higher(χ2=3.87,4.62,P＜0.05).Conclusion:ε4 gene of the ApoE is an important risk factor forAD.

apolipoprotein E;Alzheimer's disease;genetic polymorphism;correlation

R741;R741.02;R742

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.013

淄博市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

山東 淄博 255036

2015-11-18

劉建強

liujqjianqiang@163. com