聚羥基丙烯酸和Van-clear替代傳統(tǒng)試劑在FISH法檢測宮頸hTERC基因中的應(yīng)用比較

陳志強，王　瑩，米賢軍，陳　昂，黃華勇，鐘守軍，鄧文同，劉超凡，徐秀梅，代新珍

(南方醫(yī)科大學附屬中山博愛醫(yī)院病理科， 廣東中山　528400)

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·技術(shù)方法·

聚羥基丙烯酸和Van-clear替代傳統(tǒng)試劑在FISH法檢測宮頸hTERC基因中的應(yīng)用比較

陳志強△，王瑩，米賢軍，陳昂，黃華勇，鐘守軍，鄧文同，劉超凡，徐秀梅，代新珍

(南方醫(yī)科大學附屬中山博愛醫(yī)院病理科， 廣東中山528400)

[摘要]目的：觀察環(huán)保固定液(聚羥基丙烯酸、環(huán)保透明脫蠟液Van-clear單獨或聯(lián)合)替代傳統(tǒng)固定液[4%(體積分數(shù))中性緩沖甲醛、傳統(tǒng)透明脫蠟液二甲苯]應(yīng)用于熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)法檢測宮頸組織中人端粒酶核糖核酸組分(human telomerase RNA component，hTERC)基因擴增的差異。方法： 收集2013年3月到2015年4月于中山市博愛醫(yī)院婦科住院部送檢的255例宮頸組織標本，同一病變部位切取4個樣本，分為4組，命名為A、B、C、D組:A組采用4%中性緩沖甲醛固定、二甲苯透明脫蠟制作切片；B組采用聚羥基丙烯酸固定、二甲苯透明脫蠟制作切片；C組采用4%中性緩沖甲醛固定、Van-clear透明脫蠟制作切片；D組采用聚羥基丙烯酸固定、Van-clear透明脫蠟制作切片。采用FISH技術(shù)檢測4組宮頸標本中hTERC基因。結(jié)果： 在FISH法檢測宮頸各級病變組織hTERC基因時，熒光顯微鏡下，A、B、C、D四組的組織輪廓和背景均清晰，探針定位準確，可見耀眼的紅/綠熒光信號。B、C、D組與A組陽性率相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且FISH結(jié)果符合率高。結(jié)論： 環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸、Van-clear有潛在的可能單獨或聯(lián)合替代4%中性緩沖甲醛、二甲苯應(yīng)用于FISH法檢測宮頸hTERC基因。

[關(guān)鍵詞]病理學，臨床；組織固定；石蠟包埋；原位雜交，熒光；末端轉(zhuǎn)移酶端粒RNA

臨床疾病的診斷和相關(guān)的實驗室病理研究越來越依賴于石蠟包埋的樣品，而固定與透明、脫臘是制作石蠟包埋樣品的重要步驟。眾所周知，使用甲醛作為固定劑一直是組織病理學檢查的傳統(tǒng)做法，但甲醛具有致癌性[1-2]，甲醛固定組織可改變核酸與蛋白質(zhì)，限制了分子診斷技術(shù)在石蠟包埋組織中的應(yīng)用[3]，因此，尋找一個環(huán)保的固定液已迫在眉睫。歐洲的大學和生物技術(shù)公司將環(huán)保固定劑(非交聯(lián)固定劑PaxGene)應(yīng)用于可溶性有機化合物和生物大分子的形態(tài)快速保存[4]已取得了良好效果。在石蠟包埋的樣品中，二甲苯傳統(tǒng)上被大量用于組織處理和染色，但有研究顯示二甲苯可對身體造成多種健康危害[5-9]，所以尋找一個更安全的替代品是十分必要的。Premalatha等[10]利用生物環(huán)保精制礦物油作為二甲苯替代品脫蠟，在蘇木精和伊紅染色獲得了滿意效果。張進華等[11]應(yīng)用環(huán)保樣本處理液制作石蠟切片，提取DNA進行熒光定量PCR擴增，并與常規(guī)方法制作的石蠟切片進行比較，結(jié)果證實環(huán)保樣本處理液能較好地保存組織中的DNA。

多年來有關(guān)環(huán)保固定液、透明脫蠟液的國內(nèi)外相關(guān)報告和文獻報道已有不少，大部分都是應(yīng)用于病理常規(guī)染色、冰凍切片染色以及免疫組織化學染色，鮮見環(huán)保固定液、透明脫蠟液應(yīng)用于FISH法檢測宮頸hTERC基因差異的報道。本研究應(yīng)用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸、Van-clear單獨或聯(lián)合替代傳統(tǒng)試劑4%(體積分數(shù))中性緩沖甲醛、二甲苯，比較FISH法檢測宮頸各級病變的人端粒酶核糖核酸組分(human telomerase RNA component，hTERC)基因擴增陽性率的差異，以獲得環(huán)保固定、透明脫蠟液未來在臨床應(yīng)用的實驗依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年3月至2015年4月中山市博愛醫(yī)院婦科住院部送檢的255例宮頸組織標本，患者年齡23.2～72.6歲，平均年齡(48.5±2.7)歲；經(jīng)病理確診，其中宮頸炎性患者55例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級患者65例、CINⅡ級患者54例、CINⅢ級/原位癌患者51例，宮頸浸潤癌患者30例；所有腫瘤患者術(shù)前均未接受化療或放療，同一病變部位切取4個樣本，大小均為1.0 cm×0.5 cm×0.2 cm。根據(jù)固定、透明脫蠟液的不同分成A、B、C、D組，A組采用4%中性緩沖甲醛固定、二甲苯透明脫蠟制作切片，B組采用聚羥基丙烯酸固定、二甲苯透明脫蠟制作切片，C組采用4%中性緩沖甲醛固定、Van-clear透明脫蠟制作切片，D組采用聚羥基丙烯酸固定、Van-clear透明脫蠟制作切片。

1.2試劑與設(shè)備

聚羥基丙烯酸固定液購自廣州市艾發(fā)生物醫(yī)學技術(shù)工程有限公司，Van-clear環(huán)保透明脫蠟劑購自華爍科技股份有限公司葛店分公司。探針：hTERC基因探針由中國北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供，為TERC/CSP3 DNA探針。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自動密閉式組織脫水機為日本櫻花檢驗儀器株式會社生產(chǎn)；HistoStarTMEmbedding Workstation包埋機、ShandonTMFinesseTM325手動石蠟切片機為德國Thermo生產(chǎn)，切片厚度2～3 μm；S500-24熒光原位雜交儀為美國Thermobrit公司生產(chǎn)；蔡司熒光顯微鏡(Zeiss，德國熒光顯微鏡公司)配備相應(yīng)的波長濾波器、CCD攝像機、圖像采集和分析系統(tǒng)。研究中所用的聚羥基丙烯酸是單純固定液，固定速度是1 mm/h，于10～30 ℃溫度下保存。

1.3組織學分組

根據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年發(fā)布的宮頸上皮內(nèi)病變新的分類體系，宮頸上皮腫瘤包括低級別/高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low- and high-grade intra-epithelial lesions，LSIL/HSIL)，新分類的LSIL包括原來的CINⅠ，HSIL包括原來的CINⅡ及CINⅢ/原位癌[12]。CINⅠ級(輕度非典型增生)：異型細胞局限于上皮層的下1/3區(qū)；CINⅡ級(中度非典型增生)：異型細胞占上皮層的1/3～2/3；CINⅢ級(重度非典型增生及原位癌)：異型細胞超過上皮層的2/3但還未累及上皮全層。一般重度非典型增生具有惡變危險，故可將重度非典型增生視為癌前病變；原位癌指癌細胞局限于上皮全層內(nèi)，尚未突破基底膜、間質(zhì)無浸潤；浸潤癌指癌細胞突破基底膜，間質(zhì)有浸潤。

1.4組織標本采集及制片

陰道鏡下采集宮頸活體組織標本，分別經(jīng)聚羥基丙烯酸或4%中性緩沖甲醛固定12 h以上，用Van-clear或二甲苯透明，梯度酒精脫水、石蠟浸蠟流程和時間按中華醫(yī)學會病理學會病理技術(shù)相關(guān)規(guī)程在全自動組織脫水機中進行[13]，常規(guī)石蠟包埋，2～3 μm厚切片，裱片于防脫片載玻片上。

1.5FISH相關(guān)操作及結(jié)果判讀

玻片預(yù)處理后放入56 ℃恒溫箱烤片過夜。Van-clear或二甲苯脫蠟后，胃蛋白酶K消化8 min，室溫下氯化鈉檸檬酸鈉緩沖液(sodium chloride-citric sodi，SSC)洗脫，體積分數(shù)為70%、85%和100%的乙醇梯度脫水固定，自然干燥。于暗室滴加雜交液，蓋上蓋玻片，橡皮膠封邊，73 ℃變性5 min，42 ℃雜交過夜；移去蓋玻片，溫度46 ℃，玻片置于50%(體積分數(shù))甲酰胺/(2×SSC)溶液10 min × 3，再置于2×SSC溶液中10 min，最后于2×SSC/0.1%(體積分數(shù))NP40溶液中5 min，室溫70%乙醇中漂洗3 min，干燥后滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)封固，于熒光顯微鏡下觀察。

FISH結(jié)果判定參考探針試劑盒說明和相關(guān)文獻[14]。信號判定：TERC探針為橘紅色信號，CSP3探針為亮綠色信號。CSP3探針所標熒光顏色與TERC位點不同，作為對照探針參與對TERC位點的檢測。閾值判定：正常細胞綠、紅信號均≤2個，異常細胞綠、紅信號>2個。選取正常宮頸組織20例，每例隨機觀察100個細胞，統(tǒng)計異常TERC信號細胞數(shù)的百分比。異常閾值=平均數(shù)+3×標準差[15-16]，本實驗閾值為7.29%，取整數(shù)7%。每例樣本隨機計數(shù)100個細胞核，若異常信號細胞數(shù)的檢測值大于異常閾值，判定為陽性結(jié)果；小于異常閾值，判定為陰性結(jié)果；等于異常閾值，則加大觀測樣本細胞數(shù)目，以判斷最后結(jié)果。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0完成統(tǒng)計分析，F(xiàn)ISH結(jié)果陽性率的差異用配對χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。FISH結(jié)果的符合率定義為以A組實驗診斷結(jié)果為參照，B、C、D組實驗診斷結(jié)果與其符合情況。

2結(jié)果

2.1熒光顯微鏡下的大體情況

在熒光顯微鏡下，A、B、C、D四組的組織輪廓和背景均清晰，探針定位準確，可見深藍色細胞核及耀眼的紅/綠熒光信號(圖1)，隨病變程度加重，異常雜交信號數(shù)量明顯增加，出現(xiàn)多種不同的異常雜交表現(xiàn)，說明異常擴增及多體細胞比例顯著增加。

A, The cervicitis cells are thediploid ones, in which the numbers of both the red and green signals are less than or equal to 2; B, The amplified or polysomic cells are seldom seen in the tissue at CINⅠ level; C, The number of the amplified and polysomic cells have obviously increased in the tissue at CINⅡ level; D, The proportion of the abnormally amplified and polysomic cells has obviously increased in the tissue at CINⅢ level. E, It is proved to be the cervical invasive carcinoma.

圖1hTERC基因DNA雙色FISH圖像：亮綠色為CSP3信號數(shù)，橘紅色為hTERC信號數(shù)，藍色為細胞核(×1 000)
Figure 1 Bicolor FISH image of hTERC genes in DNA, in which the green ones are the CSP3 signals, the red ones are hTERC
signals, and the blue ones are the cell nucleus (×1 000)

2.2hTERC基因陽性率

A、B、C、D組試劑制片，F(xiàn)ISH法檢測宮頸各級病變組織hTERC基因陽性率結(jié)果見表1，可見B、C、D組與A組hTERC基因陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)， 且FISH結(jié)果符合率高，最小值為96.36%(表2)，說明新型環(huán)保試劑與傳統(tǒng)試劑一致性好。

3討論

宮頸癌是女性癌癥死亡的第二大原因，一般經(jīng)10年左右會從癌前病變發(fā)展為浸潤性宮頸癌，因此，有效篩選癌前病變是非常重要的。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸非典型異常增生到宮頸癌轉(zhuǎn)化的過程中，幾乎所有的宮頸上皮細胞都會出現(xiàn)hTERC基因的異常擴增[17-19]。應(yīng)用FISH技術(shù)檢測宮頸細胞內(nèi)的遺傳信息有望應(yīng)用于宮頸癌的診斷[20-21]，因此，利用FISH技術(shù)進行hTERC基因擴增不僅可作為宮頸癌的重要篩查手段，而且還可能是預(yù)測惡性CIN的重要指標。

價格低廉的甲醛與二甲苯依然是迄今為止保存組織標本、透明脫蠟最常用的試劑，但其刺激性、毒性、致癌性已經(jīng)引起人們的重視。本研究中所用的環(huán)保型固定液聚羥基丙烯酸是由多羥基丙烯酸聚合而成，性質(zhì)穩(wěn)定，對人體無害；Van-clear是一種從桔皮或其他植物中提取的生物透明劑，不含芳香族化合物，性質(zhì)穩(wěn)定，是對人體無危害的有機溶劑。

甲醛固定組織的機制為醛基與氨基基團形成可逆的羥甲基衍生物和穩(wěn)定的亞甲基橋，從而使甲醛和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)，但甲醛固定過程中可以改變許多生物分子，包括核酸和蛋白質(zhì)。聚羥基丙烯酸固定組織的機制可能是羥基和羧基基團發(fā)生可逆的酯化反應(yīng)，與此同時羧基和氨基集團發(fā)生中和反應(yīng)；前者生成穩(wěn)定的酯化物、硬化組織，后者維系穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境，從而使蛋白質(zhì)凝固、生物大分子快速保存[22]。圖1背景清晰、探針定位準確，說明聚羥基丙烯酸固定組織效果良好，但較甲醛而言，因聚羥基丙烯酸固定過程中沒有改變核酸和蛋白質(zhì)，對核酸蛋白質(zhì)的檢出率可能更高。

透明脫蠟的主要作用機制是遵循相似相溶規(guī)律，通常的說法是“極性相似的兩者互溶度大”，即分子間作用力的類型和大小相近的物質(zhì)往往可以互溶。石蠟主要組分為直鏈烷烴，還有少量帶個別支鏈的烷烴和帶長側(cè)鏈的單環(huán)環(huán)烷烴。二甲苯是苯環(huán)上兩個氫被甲基取代的芳香烴。Van-clear是由C8～C12的飽和直鏈烷烴組合的混合物構(gòu)成。從圖1可知，兩種透明脫蠟液的實際效果均良好，但與二甲苯相比，Van-clear的直鏈烷烴與石蠟組織結(jié)構(gòu)更為相似，因此，其與石蠟的分子間結(jié)合得更緊密，更易互溶，為FISH法檢測宮頸hTERC基因中探針的進入提供了更為有利的條件。

本研究選用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸、Van-clear環(huán)保透明脫蠟劑單獨或聯(lián)合替代傳統(tǒng)試劑4%中性緩沖甲醛、二甲苯制作切片。從表1實驗數(shù)據(jù)來看，4組hTERC基因擴增陽性率均與宮頸疾病的嚴重程度顯著相關(guān)，且炎癥、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ/原位癌、宮頸浸潤癌的陽性率與梅平等[23]報道基本上一致。時姍姍等[24]利用Van-clear透明脫蠟液代替二甲苯用于分子病理檢測，結(jié)果證實環(huán)保透明脫蠟液能較好地保存組織中的DNA，且對FISH法檢測DNA結(jié)果無明顯影響，與本文檢測出的A組和C組hTERC基因陽性率無統(tǒng)計學差異這一結(jié)論相符。時姍姍等[24]研究的是5例乳腺癌HER2基因及5例肺癌EGFR基因，而本研究針對宮頸hTERC基因，且囊括了不同程度的宮頸病變，實驗樣本量更大。此外，本研究還對不同試劑制作切片后FISH檢測hTERC基因的陽性率差異做了統(tǒng)計學分析，從多角度保證了研究的嚴謹性與可信度。

表1　4組FISH法檢測宮頸各級病變組織hTERC基因的陽性率

Group A used 4% neutral buffered formalin fixed and xylene dewaxing; Group B used poly hydroxy acrylic fixed and xylene dewaxing;Group C used 4% neutral buffered formalin fixed and Van-clear transparent dewaxing to make slices; Group D used poly hydroxy acrylic fixed and Van-clear transparent dewaxing. CIN, cervical intraepithelial neoplasia.

表2　B、C、D組與A組FISH結(jié)果符合率

The abbreviations and groupings are shown in Table 1.

本研究以當前病理學界廣泛使用的傳統(tǒng)試劑(4%中性緩沖甲醛固定、二甲苯透明脫蠟)制作切片作為參考，應(yīng)用于FISH法檢測不同宮頸病變組織hTERC基因，結(jié)果表明，不論哪種宮頸病變，B、C、D組與傳統(tǒng)試劑間hTERC基因陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(表1)，且FISH檢測結(jié)果符合率高(表2)，說明環(huán)保固定液、透明脫蠟液可以單獨與傳統(tǒng)透明脫蠟液、固定液搭配使用，也可聯(lián)合使用，均不影響應(yīng)用FISH技術(shù)進行hTERC基因擴增的檢測。

環(huán)保固定液、透明脫蠟液單獨或聯(lián)合用于檢測宮頸各級病變組織hTERC基因，其陽性率均不低于傳統(tǒng)試劑組，從環(huán)保角度考慮，我們提倡聯(lián)合使用環(huán)保固定液和環(huán)保透明脫蠟液。當然，本研究并未考慮假陽性問題，進一步的實驗可以考慮對同一標本采用不同試劑進行hTERC基因陽性率檢測，或者通過多次重復性實驗排除手工操作存在差異的可能，以還原實驗的真實結(jié)果，效果會更佳。

總之，對于日益發(fā)展的臨床病理診斷和病理實驗研究來說，在相關(guān)技術(shù)中用多病種、大樣本去優(yōu)化環(huán)保試劑的相關(guān)檢測流程，將會是大勢所趨。

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(2015-08-09收稿)

(本文編輯：趙波)

Comparison between poly hydroxy acrylic acid and Van-clear replacing the tradi-tional reagents to detect the cervicalhTERCgenes by adopting FISH technique

CHEN Zhi-qiang△, WANG Ying, MI Xian-jun, CHEN Ang, HUANG Hua-yong, ZHONG Shou-jun, DENG Wen-tong, LIU Chao-fan, XU Xiu-mei, DAI Xin-zhen

(Department of Pathology， Zhongshan BOAI Hospital Affiliated to Southern Medical University, Zhongshan 528400, Guangdong, China)

ABSTRACTObjective：To observe the difference of the human telomeres RNA component (hTERC) genes’ amplification in the cervical tissue by applying the environment-friendly fixative poly hydroxy acrylic acid and the transparent dewaxing solution Van-clear separately or jointly to replace the traditional fixative 4% (volume fraction) neutral buffered formalin and the conventional transparent dewaxing solution xylene in the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection. Methods: In the study, 255 cases of cervical tissue specimens submitted by the Department of Gynecology in Zhongshan Boai Hosipital were collected from Mar. 2013 to Apr. 2015. Four samples were taken from the same lesion site. All the cases were divided into 4 groups and named group A, B, C, and D. Group A used 4% neutral buffered formalin fixed and xylene dewaxing to make slices. Group B used poly hydroxy acrylic fixed and xylene dewaxing to make slices. Group C used 4% neutral buffered formalin fixed and Van-clear transparent to make slices. Group D used poly hydroxy acrylic fixed and Van-clear transparent dewaxing to make slices. The amplification of hTERC genes in the four groups of cervical specimens was also detected by FISH technique. Results: When the hTERC genes were detected by FISH method under the fluore-scence microscope, it was obvious that the tissue profile and the background of group A, B, C and D were all clear. The probe was fixed in the accurate position so that the bright red or green fluorescence signals were easily found in these four groups. Compared with the positive rate of group A, there was no statistical significance in that of group B, C and D (P>0.05). At the same time, the coincidence rate of the FISH results was high, which showed that the new environment-friendly reagent had no significant difference in the detection of cervical hTERC genes by FISH technique. Conclusion: It is possible for the environment-friendly reagent poly hydroxy acrylic acid and Van-clear to replace 4% neutral buffered formalin and xylene separately or jointly to detect the cervical hTERC genes by adopting FISH technique.

KEY WORDSPathology, clinical; Tissue fixation; Paraffin embedding; In situ hybridization, fluorescence; Telomerase RNA

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.02.033

[中圖分類號]R365

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-167X(2016)02-0356-05

Corresponding author△’s e-mail, 765228687@qq.com

基金項目:中山市衛(wèi)生局醫(yī)學科研立項課題(2014J128)資助Supported by the Medical Science and Research Project of Zhongshan Municipal Health Bureau (2014J128)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-2316：33：37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160323.1633.010.html