干旱脅迫對嫁接烤煙生長及生理特性的影響

謝 冰，向金友，饒在生，曹躍強，唐 明,袁繼超,易 蔓

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，四川 成都 611130；2.四川省煙草公司宜賓市公司，四川 宜賓 644002；3.四川省宜賓市農(nóng)業(yè)科學院，四川 宜賓 644600)

干旱是影響煙草生長發(fā)育的重要因子之一[1]，其對煙株基因表達[2-4]、生理指標[5-7]、生長發(fā)育[8-9]、產(chǎn)量和品質(zhì)[10-12]都有顯著影響。前人研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下烤煙生長發(fā)育受阻，根系發(fā)育不良，葉片超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性降低，丙二醛含量升高，受干旱脅迫的煙株生長發(fā)育遲緩，株高、莖圍等農(nóng)藝性狀變差，葉綠素含量降低，有效留葉數(shù)降低，葉片的長、寬不能得到有效生長，開片效果差，內(nèi)在的煙堿、總糖、總氮等各種化學成分的協(xié)調(diào)性下降，各種致香物質(zhì)發(fā)生變化，其產(chǎn)量和品質(zhì)下降明顯[6-7，13]。烤煙是我國重要的經(jīng)濟作物，對優(yōu)化農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，增加煙農(nóng)收入、推動煙區(qū)發(fā)展起到了積極作用[1]，因此，開展煙草抗旱性、降低干旱對烤煙的影響研究備受重視。

圍繞煙草抗旱栽培煙草科技工作者作了大量的研究工作，并獲得了大批科學結(jié)論，主要集中在耕作制度的調(diào)整，元素營養(yǎng)合理搭配的調(diào)控，外源生化藥劑的調(diào)控以及通過選用抗旱品種、蹲苗煉苗、合理密植等栽培措施的調(diào)控對煙草抗性的影響方面[1,14-15]。而嫁接作為一項傳統(tǒng)且成熟的栽培措施，其既能同時發(fā)揮砧木和接穗的優(yōu)勢，又可以保持品種內(nèi)在風格特點，還能提高品種抗性，因而常被用于提高作物抗性及改善花卉、果木的品質(zhì)[16]。目前，關(guān)于嫁接誘導或改變煙草的抗性以及產(chǎn)質(zhì)形成規(guī)律方面的系統(tǒng)研究報道還比較少[17-19]，且為嫁接苗與自根苗(非嫁接苗)的對比，而關(guān)于異種嫁接與同種嫁接的對比研究報道更是鮮見報端，有鑒于此，本研究擬通過研究干旱脅迫下烤煙同種、異種嫁接的生長發(fā)育、抗性生理及干物質(zhì)形成變化規(guī)律，以期為進一步完善烤煙嫁接技術(shù)研究、豐富烤煙抗逆栽培提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗地點

試驗于2015-2016年在四川省宜賓市大壩煙草科技示范園區(qū)進行。采用盆栽試驗，盆內(nèi)徑30 cm，深40 cm，每盆裝干土15 kg，栽煙一株，株行距120 cm×60 cm，施肥量按75 kg/hm2純氮，N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3，施肥方式按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)方案執(zhí)行。盆栽土為壤土，有機質(zhì)28.8 g/kg，全氮1.6 g/kg，堿解氮186.3 mg/kg，全磷1.1 g/kg，速效磷21.4 mg/kg，全鉀26.1 g/kg，速效鉀153.6 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗品種：接穗為抗旱性弱的品種KRK26，砧木為抗旱品種K326和Anyan 2[20-22]，試驗品種分別由玉溪中煙種子有限責任公司和安徽農(nóng)科院提供。

異根嫁接：指砧木接穗為不同品種：KRK26/K326、KRK26/Anyan 2；自根嫁接：指砧木接穗為同品種：KRK26/KRK26。

烤煙嫁接：接穗和砧木按濕潤育苗技術(shù)規(guī)程育苗，接穗品種按正常的育苗時令播種，砧木比接穗早播種7 d。烤煙嫁接采用劈接法，即選取砧木，平切去頂芽，并在平切口中部向下垂直切開1.0～1.5 cm；同時選取接穗，從生長點向下3 cm左右切去，從兩邊切長度1 cm左右的平滑楔形，插入砧木切口內(nèi)，將嫁接夾沿切口夾入，放回濕潤盤內(nèi)，及時遮蔭保濕，嫁接苗長出1片新葉后即可移栽。

干旱處理[23]：試驗采用盆栽防雨控水栽培，稱重法人工控制土壤含水量。在烤煙生長的團棵期、旺長期、成熟期等幾個關(guān)鍵生育期進行干旱處理，處理后5 d進行取樣測定相關(guān)指標，共設(shè)3個處理水平：正常灌水(dr0)：土壤含水率為最大田間持水量的70%～80%；輕度干旱(dr1)：土壤含水率為最大田間持水量的50%～60%；嚴重干旱(dr2)：土壤含水率為最大田間持水量的30%～40%，采用稱重法進行控水處理。試驗共3個品種，各品種每一處理20株，3次重復，共540株煙。4月28日移栽，5月28日進入團棵、6月12日進入旺長、7月12日進入成熟。

1.3 測定項目及方法

葉綠素相對含量采用SPAD測定儀測定，在最大葉片上隨機選擇5個點進行測定；分別于團棵期、旺長期和成熟期取樣測定，每次每處理取樣5株，將煙株根系部分放入網(wǎng)袋在水中浸泡18 h，去除雜質(zhì)、泥土，采用WinRHIZO-2008根系分析系統(tǒng)分析掃描測定不同試驗處理的根系形態(tài)；成熟期株高、節(jié)距、莖圍等農(nóng)藝性狀分別用米尺和游標卡尺測定，葉片長寬用米尺測定，葉面積=長×寬×0.634 5；取最大葉片的葉肉用于各種酶活性測定，過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[24]；過氧化氫酶活性采用紫外吸收法測定[24]；超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑(NBT)法測定[24]；脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS statistics 20等進行整理、作圖和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱對嫁接烤煙根系形態(tài)的影響

2.1.1 對嫁接烤煙根系長度的影響 隨著煙株的生長，根系長度增加(表1)，成熟期根系的總長度是團棵期的3.18倍。干旱脅迫使煙株生長受阻，根系長度變短，干旱程度越重，根系長度越短，各嫁接組合和生育時期均表現(xiàn)為dr0>dr1>dr2。不過干旱脅迫下不同嫁接組合和生育時期間根系長度變短的幅度存在一定差異，如團棵期干旱脅迫，品種間嫁接組合根系總長度下降的幅度均小于自嫁苗。

表1 干旱脅迫對嫁接煙株根系長度的影響Tab.1 Effects of drought stress on root length of grafting flued-tobacco cm

注：數(shù)字后不同字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。表2-7同。

Note：There was significant difference among the data after numbers(P<0.05).The same as Tab.2-7.

2.1.2 干旱對嫁接烤煙根系根數(shù)的影響 不同生育期干旱脅迫下，團棵期，異根嫁接KRK26/Anyan 2的根數(shù)小于自嫁苗KRK26/KRK26的，而KRK26/K326除輕度干旱根數(shù)較大外、其他均小于自嫁苗KRK26/KRK26，而成熟期，異根嫁接的根數(shù)卻大于自嫁苗KRK26/KRK26(表2)，這可能與生育前期異根嫁接烤煙接穗、砧木不同品種的親和性較自根嫁接的差，其根系根數(shù)的生長發(fā)育受到限制，而隨生育進程推進，砧木、接穗進一步融合，至成熟期異嫁苗遺傳砧木、接穗的優(yōu)勢得到體現(xiàn)[5,18-19]，導致異嫁苗根數(shù)超過自嫁苗；從干旱脅迫程度來看，各嫁接煙株根數(shù)大都以輕度干旱(dr1)脅迫下異根嫁接的最多，其次是正常灌水(dr0)處理，重度干旱(dr2)處理的最少，即輕度干旱對煙株發(fā)生新根有一定的促進作用，但重度干旱則抑制了新根的發(fā)生，導致根數(shù)降低。

表2 干旱脅迫對嫁接烤煙根數(shù)的影響Tab.2 Effects of drought stress on the number of root of grafting flued-tobacco

2.1.3 干旱對嫁接烤煙根系表面積的影響 干旱脅迫處理的烤煙根表面積變化規(guī)律與根長度的基本類似(表3)。不同生育時期，干旱脅迫處理的根系表面積均小于正常灌水處理，其中以重度干旱(dr2)處理的表面積最小，嫁接烤煙KRK26/K326、KRK26/Anyan 2的降低幅度小于自嫁烤煙KRK26/KRK26，特別是重度干旱脅迫下。在根系的3個形態(tài)指標中，以表面積受干旱脅迫的影響最大，3個嫁接組合平均，團棵期和成熟期輕度與重度干旱下根系表面積的下降幅度分別為10.3%，19.5%和11.4%，24.5%，而根數(shù)相應的平均升降幅度分別為10.2%與5.2%和9.7%與3.1%，根系總長相應的平均降幅分別為3.6%，11.4%和9.5%，21.5%?？傮w而言，KRK26/Anyan 2 3個根系指標受干旱脅迫程度的影響最小，自嫁苗KRK26/KRK26受影響程度最大，特別是根系表面積。

表3 干旱脅迫對嫁接烤煙根系表面積的影響Tab.3 Effects of drought stress on root surface area of grafting flued-tobacco cm2

2.2 干旱對嫁接烤煙成熟期地上部農(nóng)藝性狀的影響

不同干旱脅迫條件下，3個嫁接組合的有效葉數(shù)不存在顯著差異，除有效葉數(shù)外，無論是異根嫁接烤煙還是自根嫁接的株高、節(jié)距、莖圍、葉面積指數(shù)等性狀指標均隨干旱程度的加重而呈下降趨勢，即干旱脅迫對植株形態(tài)的影響順序為dr2>dr1>dr0(表4)。除葉面積指數(shù)、有效葉數(shù)外異根嫁接烤煙KRK26/K326、KRK26/Anyan 2的農(nóng)藝性狀指標變化幅度小于自嫁苗KRK26/KRK26，表明通過選擇抗性強的品種作砧木與弱抗性品種進行異根嫁接能降低干旱脅迫對弱抗接穗品種農(nóng)藝性狀的影響。

表4 干旱脅迫對嫁接烤煙地上部植株農(nóng)藝性狀的影響Tab.4 Effects of drought stress on the agronomic shape of the upper part of grafting flued-tobacco

2.3 干旱對嫁接煙株生理指標的影響

2.3.1 干旱對葉片SPAD值的影響 烤煙葉片葉綠素含量能反映煙株營養(yǎng)狀況和煙葉成熟度，而SPAD值是表征葉綠素含量最直接、有效的指標[25]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，利用快捷、無損監(jiān)測對象的SPAD儀可跟蹤研究烤煙生長狀況及判斷成熟度。干旱脅迫下隨著生育期的推進，煙葉SPAD值呈下降趨勢(圖1)，而正常灌水時，SPAD值在旺長期出現(xiàn)峰值，到成熟期降低，呈現(xiàn)先升高后降低的倒馬鞍形。團棵期干旱處理，葉片SPAD值有下降趨勢，降低幅度小。到旺長期輕度干旱時，與正常灌水相比自嫁苗SPAD值降幅最大為28.7%，KRK26/Anyan 2降幅最低為25.8%；到成熟期嚴重干旱時，KRK26/K326、KRK26/Anyan 2、KRK26/KRK26分別下降了34.4%，30.5%，38.1%。在各生育期干旱脅迫條件下，異根嫁接苗的SPAD值高于自嫁苗，其中KRK26/Anyan 2最高，KRK26/K326次之。

**、*.差異達極顯著、顯著水平。圖2同。**.The difference was extremely significant level；*.The difference was significant level.The same as Fig.2.

2.3.2 干旱對葉片脯氨酸含量的影響 脯氨酸是一種重要滲透保護物質(zhì)，其含量的高低反映了植物抗干旱脅迫的能力。脯氨酸能與蛋白質(zhì)結(jié)合，在蛋白表面與水分子形成一層保護膜，束縛水分子向細胞外流動，減少水分散失，親水性增強，從而增強作物的保水能力，增強其抗性[26-27]。由圖2可知，在本研究中嫁接烤煙的各生育時期，脯氨酸含量隨著干旱程度的加重而增加。從團棵期到成熟期，全生育期干旱處理脯氨酸含量呈增長趨勢，尤其以旺長期增加幅度較大，而正常灌水增加不明顯。其中，自嫁苗增加幅度明顯小于其他2種嫁接苗，KRK26/Anyan 2增加幅度最大，KRK26/K326次之。成熟期嚴重干旱時KRK26/K326、KRK26/Anyan 2增加明顯，分別較正常灌水提高6.1，6.3倍。干旱脅迫下，異根嫁接更能促進煙株脯氨酸的形成。

2.3.3 干旱對葉片SOD活性的影響 SOD是植物抵御活性氧侵害的一類重要酶，能清除超氧陰離子自由基，減少羥基自由基的形成[28]。隨著煙株的生長，正常灌水的SOD活性呈拋物線變化，在旺長期達到最高值，而干旱脅迫下，其葉片的SOD活性逐漸降低，以團棵期最高，成熟期最低(表5)，與自嫁苗相比，異嫁接苗的SOD活性均較高，其中以KRK26/Anyan 2提高幅度較大，與KRK26/KRK26相比，KRK26/Anyan 2在干旱處理下的SOD活性的平均提高幅度為20.9%(團棵期)，36.7%(成熟期)，66.2%(成熟期)，而KRK26/K326相應的升幅為13.5%，27.7%，52.7%，表明與抗旱性強的品種嫁接可提高弱抗性品種對活性氧侵害的抵御能力。

圖2 干旱脅迫對嫁接煙葉脯氨酸含量的影響Fig.2 Effects of drought stress on proline content of grafting flue cured-tobacco

表5 干旱脅迫對嫁接煙葉SOD活性的影響Tab.5 Effects of drought stress on SOD activity of grafting flue-cured tobacco U/(g·min)

2.3.4 干旱對葉片CAT活性的影響 CAT能清除植物體內(nèi)過氧化氫，是與抗病力密切相關(guān)的酶類[29]。為此，研究該酶對闡明干旱脅迫對煙株生長發(fā)育的影響具有重要作用。在干旱脅迫時CAT活性隨生長發(fā)育呈現(xiàn)下降的趨勢(表6)。在各生育期KRK26/K326、KRK26/Anyan 2的活性均高于同品種自嫁苗，而KRK26/K326和KRK26/Anyan 2活性差異不顯著。在團棵期和旺長期，CAT活性除團棵KRK26/K326的偏大外，總體表現(xiàn)為KRK26/Anyan 2>KRK26/K326>KRK26/KRK26；在成熟期嚴重干旱時，KRK26/Anyan2、KRK26/K326、KRK26/KRK26的CAT活性分別降為正常水平的70.3%，72.8%，66.5%。

表6 干旱脅迫對嫁接烤煙CAT活性的影響Tab.6 Effects of drought stress on CAT activity of grafting flue-cured tobacco U/(g·min)

2.3.5 干旱對葉片POD活性的影響 POD廣泛存在于植物細胞中，在清除酚類、過氧化氫，促進醌類物質(zhì)生成方面起到重要作用[30]。POD能增加細胞壁強度，進而形成一道結(jié)構(gòu)屏障，增強對外界病原菌的抵抗力。從表7可以看出，在團棵期，POD活性隨干旱程度的加重而增加，其中，KRK26/Anyan 2活性最高，自根苗最低，KRK26/K326居中；到旺長期時，各嫁接組合的酶活性隨脅迫程度的加劇而降低。嚴重干旱條件下與正常灌水相比，3個嫁接組合在成熟期分別下降了14.9%，16.3%，23.3%。KRK26/K326和KRK26/Anyan 2的POD活性下降幅度較大，但其活性均高于KRK26/KRK26。

2.4 嫁接烤煙植株生長與抗旱生理指標的關(guān)系

烤煙長勢、地上地下等外部形態(tài)指標作為表征內(nèi)在生理特性變化的表征，干旱脅迫下，二者具有基本相同的變化趨勢[31]。由表8，9可知，不同生育期，嫁接烤煙根系形態(tài)指標與SPAD值的相關(guān)性明顯強于其他抗性指標，其中根系長度與SPAD值呈顯著正相關(guān)，根表面積與SPAD值呈正相關(guān)關(guān)系。由表10可知，LAI與SOD、CAT呈顯著正相關(guān)，與SPAD、POD呈極顯著正相關(guān)，莖圍、株高與SPAD呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與SOD、CAT、POD相關(guān)性不顯著。說明通過嫁接的烤煙地上地下形態(tài)指標與抗性指標的關(guān)系與非嫁接烤煙的變化大體一致[31]。

表7 干旱脅迫對嫁接烤煙POD活性的影響Tab.7 Effects of drought stress on POD activity of grafting flue-cured tobacco ×104U/(g·min)

表8 嫁接烤煙團棵期根系與抗性指標相關(guān)分析Tab.8 Correlation analysis of root system and resistance index of grafting flue-cured tobacco in the rosette stage

注：**. 0.01 水平上顯著相關(guān)；*.0.05 水平上顯著相關(guān)。表9-10同。

Notes：**.Significant correlation at 0.01 level；*.Significant correlation at 0.05 level.The same as Tab.9-10.

表9 嫁接烤煙成熟期根系與抗性指標相關(guān)分析Tab.9 Correlation analysis of root system and resistance index of grafting flue-cured tobacco in the mature stage

表10 嫁接烤煙形態(tài)指標與抗性指標的相關(guān)分析Tab.10 Correlation analysis of morphological indexes and resistance indexes of grafting flue-cured tobacco in the mature stage

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫能嚴重影響烤煙的生長發(fā)育，導致產(chǎn)質(zhì)量不同程度降低，是烤煙生長過程中的重要限制因子之一，而由于不同品種烤煙抗性、脅迫方式及強度的不同，煙株生長發(fā)育過程會存在一定差異[8,13,32]，本研究表明，干旱脅迫下，嫁接烤煙的形態(tài)指標、生理指標變化規(guī)律與非嫁接烤煙規(guī)律大體一致[31]，但在生育前期，根系長度、根數(shù)等指標變化規(guī)律存在差異，這可能與砧木、接穗的特性不同有關(guān)，也可能與本試驗處理為多次干旱脅迫，而前人抗旱研究時水分脅迫處理次數(shù)較少有關(guān)[13,19,21,32]。

烤煙根系形態(tài)變化能表征品種的抗旱性[33]，本研究表明，干旱脅迫對嫁接烤煙根系長度、表面積的影響規(guī)律大體一致，均隨著干旱程度的加重而呈變短、變小趨勢，但變化幅度大小與嫁接組合砧木品種的抗性強弱緊密相關(guān)，嫁接烤煙的根數(shù)在適度干旱脅迫下，有增多趨勢，而重度干旱脅迫下，根數(shù)又表現(xiàn)為降低趨勢，這與前人研究結(jié)果基本相同[34-35]，不同的是本研究采取的是固定灌溉設(shè)計，且在幾個烤煙關(guān)鍵時間節(jié)點上進行水分脅迫處理，這可能是造成根數(shù)等變化差異的原因。煙株葉綠素含量的變化指示植物對脅迫的敏感性，同時影響光合產(chǎn)量[33]。本研究中干旱條件下嫁接烤煙煙葉SPAD值(葉綠素相對含量)呈下降趨勢，這可能是由于干旱脅迫導致葉綠素合成受阻，另一方面，脅迫致使活性氧累積，造成葉綠素分解破壞。而異根嫁接的SPAD值高于自嫁苗，說明以抗性強的品種作砧木可減輕干旱脅迫導致的接穗品種葉綠素的降低程度，從而保持異根嫁接苗較高的葉綠素含量，確保植株光合作用，促進煙株株高、節(jié)距、莖圍、葉片長寬等的生長發(fā)育，這與霍勇錦等[19]研究結(jié)果大體一致，但與梅芳等[5]以選擇氮高效品種作砧木來提高接穗的葉綠素含量不同，表明可以通過不同的材料組合、不同的外源措施，來達到相同的目標。

Pro、SOD、CAT、POD是植物體內(nèi)的重要保護性物質(zhì)，在滲透調(diào)節(jié)、自由基清除、保護細胞等抗性生理中發(fā)揮著重要的作用[19,21,32,36-37]。本試驗中，嫁接煙葉脯氨酸的大量積累說明在干旱脅迫下煙株能集聚滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、改變細胞結(jié)構(gòu)，進而增強吸水、保水能力。脯氨酸含量KRK26/Anyan 2>KRK26/K326>KRK26/KRK26，表明以Anyan 2、K326作砧木異根嫁接苗能提高植株脯氨酸含量，改善煙株滲透調(diào)節(jié)細胞，降低水分的流失，減輕干旱脅迫對煙株造成的傷害。有研究表明，干旱脅迫能打破植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除平衡，致使自由基大量積累，造成煙葉受損[21]。本試驗團棵期SOD和CAT活性隨著干旱程度的加劇而增加，減輕了干旱脅迫造成的影響。隨著生長發(fā)育和再次干旱脅迫，SOD和CAT活性逐漸下降，表明煙株自身調(diào)節(jié)能力降低，細胞膜遭受傷害，這2種酶活性的變化趨勢與前人的研究結(jié)果基本一致[38-39]。與正常灌水相比，隨著生長發(fā)育，干旱脅迫下以Anyan 2和K326作砧木的嫁接苗的SOD和CAT活性降低幅度小于自根苗的降幅，說明選擇抗性較強的品種做砧木進行異根嫁接較抗性弱的品種自根嫁接能更好地清除自由基和過氧化氫，保護煙葉細胞膜。此外，POD活性亦以KRK26/KRK26最低，而以Anyan 2、K326做砧木嫁接的相對較高，表明以抗性強的品種作砧木的異根嫁接能積累更多木質(zhì)素、木栓質(zhì)，以促進細胞壁的交聯(lián)，同時降低細胞壁的伸展，以形成更強的保護屏障，從而提高其抗旱性，其外在栽培表現(xiàn)為對水分需求降低，但煙株體內(nèi)的水分卻保持一個平衡狀態(tài)。本試驗中Pro、SOD、CAT、POD等幾種酶活性在不同組合、不同生育期產(chǎn)生的差異，可能與異根嫁接能充分傳承砧木的優(yōu)勢特性，激發(fā)了砧木、接穗的潛在抗性有關(guān)，前人關(guān)于嫁接抗旱對比研究，是基于嫁接苗與非嫁接苗[17-19]，而本研究不同之處是基于異種與同種嫁接的對比，處理的平臺更一致，但這可能也是部分指標與前人研究存在差異的原因。

通過嫁接能將砧木的優(yōu)勢特性傳導給接穗品種，促進接穗的生長發(fā)育、提高抗性、改善品質(zhì)[5，18-19，40]，嫁接植株對干旱脅迫響應規(guī)律受砧木的影響較大[35]。本研究表明，在干旱脅迫下，利用嫁接換根莖原理，抗性較強的烤煙品種作砧木的嫁接苗能形成較強大的根系，以利于吸收水分，維持較高葉綠素相對含量以保證光合作用，同時增大脯氨酸積累量，并提高SOD、CAT、POD等關(guān)鍵酶高活性，從而提高嫁接烤煙抗旱能力。綜合評價本試驗中不同嫁接組合的各種形態(tài)指標、抗性生理指標，抗旱能力從強到弱依次為KRK26/Anyan 2、KRK26/K326、自根苗KRK26/KRK26。因此，科學篩選抗旱性強的品種作砧木，可以達到改善接穗苗生理特性，可為烤煙抗旱栽培提供一定參考。

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