栽培種花生EST—SSR引物的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

吳曉

摘 要：由于對(duì)農(nóng)作物的要求不斷提高，栽培種花生在產(chǎn)量和應(yīng)用開(kāi)發(fā)上實(shí)現(xiàn)了有效的實(shí)施。河南省內(nèi)鄉(xiāng)縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心在本文中利用相關(guān)材料，通過(guò)對(duì)EST-SSR引物和應(yīng)用效果進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)了最佳的引物效果，實(shí)現(xiàn)了野生種子的有效性和擴(kuò)展效果。

關(guān)鍵詞：花生；EST-SSR；開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160333102

花生作為一種豆類食品，在栽培過(guò)程中，它屬于野生種子。這種野生性的花生能抵抗一些病蟲害，還能形成高質(zhì)量的油類。所以，為了保證花生在栽培期間形成良好的資源基礎(chǔ)，就要利用SSR引物來(lái)實(shí)現(xiàn)完善性的開(kāi)發(fā)和利用。

1 EST-SSR的概述

EST-SSR是一種新型的分子標(biāo)記方式，在種植的多種作物上都能建立良好的標(biāo)記效果，也能對(duì)物種進(jìn)行有效的遺傳分析。由于EST數(shù)據(jù)的不斷增長(zhǎng)，SSR成為主要的引物來(lái)源，所以EST-SSR引物開(kāi)發(fā)成為花生作物主要的研究途徑。從EST中體現(xiàn)的EST-SSR引物改變了傳統(tǒng)的SSR引物開(kāi)發(fā)形式，對(duì)一些基因建構(gòu)和DNA復(fù)雜文庫(kù)進(jìn)行了優(yōu)化，而且在表達(dá)基因上也得到間接和直接的聯(lián)系，在遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)展中得到有效的利用。EST-SSR具有3種特殊優(yōu)勢(shì)：實(shí)現(xiàn)的信息量比較大，如果EST在某一處的標(biāo)志發(fā)生連鎖效應(yīng)，EST就會(huì)與控制形狀的相關(guān)基因有聯(lián)系；通用性也比較好，由于EST是轉(zhuǎn)錄區(qū)的來(lái)源方式，具有較高的保守型，所以在親緣物種之間具有明顯的利用價(jià)值；不僅開(kāi)發(fā)的成本比較低，開(kāi)發(fā)形式也比較簡(jiǎn)單。在花生標(biāo)記和研發(fā)上具有重要作用，不僅對(duì)分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了開(kāi)發(fā)性和穩(wěn)定性，對(duì)花生種子的栽培也具有重要意義[1]。

2 研究材料與方法

選擇花生抗青枯病高油品系列，根據(jù)每個(gè)葉子和根的EST數(shù)量，對(duì)栽培品種的EST-SSR進(jìn)行檢測(cè)。要提取花生基因組的DNA，利用CTAB-酚方法，還要保證一定的測(cè)試濃度和純度、DNA的質(zhì)量等。實(shí)現(xiàn)EST的序列拼接方式，利用聚類的相關(guān)軟件，將所有的EST拼接起來(lái)，并保證一定的拼接標(biāo)準(zhǔn)。再使用SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索，在拼接后產(chǎn)生的序列方式上，利用一定的時(shí)間，搜索出相關(guān)的應(yīng)用材料。還要對(duì)SSR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，根據(jù)兩端的保守區(qū)域，利用Primer3軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，在引物溫度的選擇上、長(zhǎng)度范圍都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)篩選。實(shí)現(xiàn)PCR的擴(kuò)增，根據(jù)PCR中每個(gè)反應(yīng)體系，對(duì)SSR的正反向建立DNA模板，利用電泳方式在顯微鏡下進(jìn)行分析。

3 對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的研究表明，栽培花生種子在DNA下的提取可以看出，所有的品種葉子都得到了較高的DNA質(zhì)量，而且在紫外分光上的檢測(cè)以及電泳上的檢測(cè)，所有得到的DNA都比較完整，沒(méi)有發(fā)生講解現(xiàn)象[2]。在序列拼接期間，為了減少EST序列的冗余，就要對(duì)某個(gè)特定的基因?qū)崿F(xiàn)共有序列方式。在EST-SSR中產(chǎn)生的分布頻率和特點(diǎn)也不同，花生栽培中的種類比較豐富，在各個(gè)材料中，核苷酸出現(xiàn)的頻率比較高，二核苷酸出現(xiàn)的重復(fù)類型比較多。在已經(jīng)搜索出的栽培花生種子EST-SSR中，出現(xiàn)的頻率也不同。在EST-SSR引物中產(chǎn)生的設(shè)計(jì)和檢測(cè)的多態(tài)性中，利用Primer3可以看出，由于SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的序列比較短、結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，不能進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。所以利用EST-SSR引物對(duì)花生的栽培品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)清晰的條帶檢測(cè)出種子的多樣性，從而檢測(cè)出引物的等位基因。

4 對(duì)結(jié)論進(jìn)行討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果的分析可以得到，花生SSR引物在開(kāi)發(fā)期間，主要對(duì)基因組SSR引物的開(kāi)發(fā)、引物的開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)移等。利用EST-SSR方法，在花生種子栽培中檢測(cè)出EST的位點(diǎn)，然后對(duì)作物中EST產(chǎn)生的SSR進(jìn)行表示[3]。在EST-SSR中，大多數(shù)的植物都是以三核苷酸和二核苷酸作為主要的重復(fù)類型的，由于植物葉子的不同性，花生中的栽培品種以EST-SSR中的三核苷酸作為主要的重復(fù)類型。由于葉子中含有豐富的重復(fù)類型，所以在四、五、六核苷酸重復(fù)類型中不會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)也使用了擴(kuò)增性，由于擴(kuò)充區(qū)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，引物在進(jìn)行擴(kuò)增期間，就會(huì)出現(xiàn)一些條帶的顯示，從而為栽培花生中的基因作為重要的引物序?yàn)椤?/p>

5 結(jié) 論

在花生栽培過(guò)程中，利用EST-SSR引物進(jìn)行開(kāi)發(fā)和標(biāo)記是可行的，不僅實(shí)現(xiàn)了野生種子的有效性和擴(kuò)展效果，對(duì)花生中產(chǎn)生的多樣性資源也產(chǎn)生重要意義。EST-SSR這種表達(dá)基因方式不僅能夠?qū)ㄉ姆肿宇愋瓦M(jìn)行標(biāo)記，還能在遺傳性方面實(shí)現(xiàn)多種方式的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 江建華，倪皖莉，肖美華.花生SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用現(xiàn)狀和前景[J].花生學(xué)報(bào)，2012（2）：39-45.

[2] 唐梅，陳玉寧，任小平等.源于栽培種花生的EST-SSR引物對(duì)野生花生擴(kuò)增的多態(tài)性[J].作物學(xué)報(bào)，2012（7）：1221-1231.

[3] 肖洋，廖伯壽，晏立英等.栽培種花生EST-SSR引物的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（11）：2625-2628.