人胰島素MIP融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化

黃旋 陳婷 張云龍 陸昌瑞

摘 要：MIP即人胰島素B27賴氨酸去三肽胰島素 （B27K-DTrI）的前體。B27K-DTrI是一種新型單體速效胰島素類似物，其單體性質(zhì)好，生物活性高，是潛在的速效人胰島素藥物。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒ppSUMO-MIP轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）菌株，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對MIP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)時間進(jìn)行一系列的優(yōu)化，結(jié)果表明：重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中最優(yōu)的表達(dá)條件為TB培養(yǎng)基、0.1 mM IPTG，15 ℃誘導(dǎo)過夜。通過表達(dá)條件的優(yōu)化，每升菌液可獲得30.1 mg的融合蛋白粗品。為進(jìn)一步制備單體胰島素B27K-DTrI打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：速效胰島素；SUMO-MIP融合蛋白；表達(dá)優(yōu)化

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160333046

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，它現(xiàn)已成為威脅人類健康的最大殺手之一[1]。胰島素是由胰腺β細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一類多肽類激素，是體內(nèi)重要的降低血糖激素[2-3]。胰島素從問世至今經(jīng)歷了從動物胰島素、人胰島素到胰島素類似物的3大跨越[4-6]。20世紀(jì)90年代，人們利用基因工程技術(shù)對人胰島素的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行局部修飾，合成了人胰島素類似物，改變了胰島素的藥代動力學(xué)特征。速效胰島素是一類通過基因工程方式獲得，與餐后正常人體內(nèi)胰島素分泌代謝最為接近的胰島素類似物[7]。近年來，速效胰島素以其吸收快、安全性好等特點(diǎn)受到越來越多研究者的關(guān)注。

MIP即人胰島素B27賴氨酸去三肽胰島素（B27K-DTrI）的前體，是2005年由丁金國等人利用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)成功制備的單體速效胰島素類似物[8]。B27K-DTrI具有單體性質(zhì)好，生物活性高等特點(diǎn)，是一種新型的速效胰島素類似物。但是，由于其產(chǎn)量較低限制了B27K-DTrI的產(chǎn)業(yè)化。在前期研究中，研究者嘗試使用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌IMPACT-TWIN系統(tǒng)進(jìn)行重組制備B27K-DTrI。研究結(jié)果表明利用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行制備其純化過程繁瑣，得率較低，而大腸桿菌IMPACT-TWIN系統(tǒng)進(jìn)行制備必須經(jīng)歷復(fù)性過程，不僅降低最終產(chǎn)量，而且對蛋白的生理活性也會產(chǎn)生潛在的影響 [9]。因此，試圖通過增加MIP前體表達(dá)量的方法來提高B27K-DTrI的最終產(chǎn)量。

利用大腸桿菌ppSUMO表達(dá)系統(tǒng)制備B27K-DTrI。ppSUMO表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的一種，通過融合表達(dá)SUMO肽可以明顯提高重組蛋白的可溶性[10-11]，避免在表達(dá)過程中出現(xiàn)包涵體，從而增加蛋白的可溶性表達(dá)量。在制備B27K-DTrI前體MIP融合蛋白的過程中，對MIP融合蛋白在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，改善了表達(dá)過程中的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及培養(yǎng)基條件，使得MIP融合蛋白產(chǎn)量得到提高（30.1 mg/L），為進(jìn)一步制備單體胰島素B27K-DTrI打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株和載體：大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞、ppSUMO-MIP質(zhì)粒（經(jīng)測序、鑒定無誤）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、NC膜、Terrific Broth（TB）、Ni-NTASefinoseTM Resin、蛋白質(zhì)Marker均為生工生物產(chǎn)品，Yeast extra、Tryptone購自O(shè)xoid公司，抗體6*His單克隆抗體購自proteintech。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：搖床、Western轉(zhuǎn)膜、凝膠成像儀（Bio-Rad）等。

1.2 方法

1.2.1 不同IPTG濃度對融合蛋白表達(dá)的影響

陽性克隆經(jīng)測序鑒定正確后，接種到5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基（1 % tryptone， 0.5 % yeast extract， 1 % NaCl， w/v）中，于37℃、225rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜，次日按體積比l：100的比例接種到5 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃，225 rpm搖床培養(yǎng)2 h，分別加人終濃度為0.1 mM，0.5 mM， 1 mM的誘導(dǎo)劑IPTG。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。誘導(dǎo)前后樣品進(jìn)行12 % SDS-PAGE鑒定。

1.2.2 不同誘導(dǎo)溫度對融合蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞與37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600=0.5后，加入終濃度為0.1 mM的IPTG，分別在37℃誘導(dǎo)8 h，在15 ℃條件下誘導(dǎo)過夜，離心收集菌體，高壓破碎細(xì)胞后離心分離上清和沉淀，進(jìn)行12 %SDS-PAGE及western鑒定。

1.2.3 不同培養(yǎng)基對融合蛋白表達(dá)的影響

分別使用LB及TB（4.76 % Terrific Broth， w/v）培養(yǎng)基中，在0.1 mM IPTG條件下，15 ℃誘導(dǎo)過夜。離心收集菌體，高壓破碎細(xì)胞后離心分離上清和沉淀，進(jìn)行12 %SDS-PAGE鑒定。

1.2.4 融合蛋白的親和純化

誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞離心收集后，高壓破碎細(xì)胞，10000×g ，30 min離心細(xì)胞裂解液。將上清樣品上樣至預(yù)先平衡好的Ni-NTA SefinoseTM resin中，依次用5倍柱體積（5 CV）的漂洗緩沖液 （25mM Tris-HCl，200mM Nacl，20 mM咪唑，pH8.0），5 CV 洗脫緩沖液 （25mM Tris-HCl，200mM Nacl，250 mM咪唑，pH8.0） ，5 CV再生緩沖液（25mM Tris-HCl，200mM Nacl，1 M咪唑，pH8.0） 處理柱子。所有樣品使用12 %SDS-PAGE鑒定分析。

1.2.5 濃度計算

使用Bradford試劑測定親和純化的蛋白樣品，計算蛋白濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 SUMO-MIP重組蛋白在大腸桿菌的表達(dá)

對重組質(zhì)粒進(jìn)行快速誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1（條帶1和4）所示。圖中可以看到構(gòu)建的質(zhì)?？杀磉_(dá)，但是融合蛋白的表達(dá)量偏低，所以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中需要對融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 SUMO-MIP重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)條件的優(yōu)化

從快速誘導(dǎo)結(jié)果得出質(zhì)粒可表達(dá)，但是融合蛋白表達(dá)量偏低，無法滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求，所以對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及培養(yǎng)基條件做一系列的優(yōu)化。

2.2.1 不同IPTG濃度對融合蛋白表達(dá)的影響

融合蛋白在37 ℃誘導(dǎo)溫度，不同濃度IPTG（0.1 mM， 0.5 mM， 1 mM）誘導(dǎo)下，全部都有表達(dá)。誘導(dǎo)劑濃度的增加并不增加目的蛋白的表達(dá)量，反而有下降的趨勢（圖1）。這可能是因?yàn)檫^高濃度的IPTG影響了細(xì)胞的生長狀態(tài)，從而影響融合蛋白的表達(dá)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定SUMO-MIP融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳IPTG濃度是0.1 mM。

2.2.2 不同誘導(dǎo)溫度對融合蛋白表達(dá)的影響

在0.1 mM IPTG誘導(dǎo)下，分別在15 ℃和37℃誘導(dǎo)重組蛋白。誘導(dǎo)樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE及wetern blot鑒定。從圖2可以看到，SUMO-MIP融合蛋白的大小約為20kDa，與理論值一致。在0.1 mMIPTG濃度下，37 ℃和15 ℃均有融合蛋白的表達(dá)。特別是在15 ℃誘導(dǎo)條件下，western檢測到的目的蛋白條帶單一，均存在于破菌上清液中，說明在此條件下，融合蛋白具有很高的可溶性。所以SUMO-MIP融合蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)溫度為15 ℃。

2.2.3 不同培養(yǎng)基對融合蛋白表達(dá)的影響

為了提高蛋白表達(dá)量，使用不同的培養(yǎng)基去誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。分別使用LB及TB培養(yǎng)基，在0.1mM IPTG條件下，15 ℃過夜誘導(dǎo)融合蛋白，并進(jìn)行親和純化。從SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖3）分析，使用TB培養(yǎng)基后，在破菌上清和沉淀中均有融合蛋白的出現(xiàn)，通過親和純化洗脫下來的蛋白量，TB培養(yǎng)基遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LB培養(yǎng)基。所以融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)培養(yǎng)基是TB培養(yǎng)基。

2.2.4 親和純化

在TB培養(yǎng)基，0.1 mM IPTG濃度下，15 ℃誘導(dǎo)過夜的條件下，對蛋白進(jìn)行了初步的親和純化。通過親和純化的電泳圖（圖4）分析，得到了純度約70 %的融合蛋白粗產(chǎn)物（條帶7），通過Bradford發(fā)測定蛋白濃度，1 LTB培養(yǎng)基誘導(dǎo)，可以得到30.1 mg的融合蛋白粗產(chǎn)物?；緷M足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需求。

3 結(jié) 論

B27K-DTrI是一種新型單體速效胰島素類似物，其單體性質(zhì)好，生物活性高，是潛在的速效人胰島素藥物。MIP是B27K-DTrI胰島素的前體。提高M(jìn)IP的表達(dá)量、簡化純化操作是實(shí)現(xiàn)B27K-DTrI產(chǎn)業(yè)化的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利用ppSUMO表達(dá)系統(tǒng)，通過對ppSUMO-MIP誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索及優(yōu)化，得到了SUMO-MIP融合蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：使用TB培養(yǎng)基，0.1 mM IPTG濃度下，15 ℃誘導(dǎo)過夜。其大大提高了蛋白的表達(dá)量，1 L細(xì)胞可以得到約30.1 mg純度約75 %的粗產(chǎn)物。融合蛋白的可溶性大大提高，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中無需對蛋白進(jìn)行復(fù)性。

參考文獻(xiàn)

[1] “Update 2014”. IDF. International Diabetes Federation. Retrieved 29 November 2014.

[2] Wright JR， Yang H， Hyrtsenko O， et al. A review of piscine islet xenotransplantation using wild-type tilapia donors and the production of transgenic tilapia expressing a “humanized” tilapia insulin.[J]. Xenotransplantation. 2014，21（6）：485-495.

[3] Sonksen P ，， Sonksen J ，. Insulin： understanding its action in health and disease.[J]. British Journal of Anaesthesia， 2000， 85（1）：69-79（11）.

[4] 李玉珍.胰島素制劑的發(fā)展與安全[C].2011紫禁城國際藥師論壇暨中日藥師研討會，2011.

[5] 楊兆軍，楊文英.胰島素制劑的發(fā)展[J].中國糖尿病雜志，2013（5）.

[6] 王戰(zhàn)強(qiáng).胰島素及其合成技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011， 08（13）：11-12.

[7] Mooradian A D， Marla B， Albert S G. Narrative review： a rational approach to starting insulin therapy.[J]. Annals of Internal Medicine， 2006， 145（2）：125-134.

[8] Ding J G， Jian F， Gui D F， et al. Expression of Monomeric Insulin Precursor in Pichia pastoris and Its Conversion into Monomeric B27 Lys Destripeptide Insulin by Tryptic Hydrolysis[J]. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica， 2005， 37（4）：234–240.

[9] Ting C， Lujuan L， Helong H， et al. Preparation of monomeric B27 Lys destripeptide insulin by intein mediated expression in Escherichia coli[J]. Protein Expression & Purification， 2011， 80（1）：152-156.

[10] Malakhov M P， Mattern M R， Malakhova O A， et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins[J]. Journal of Structural & Functional Genomics， 2004， 5（1-2）：75-86.

[11] Marblestone J G， Edavettal S C， Lim Y， et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems： enhanced expression and solubility with SUMO.[J]. Protein Science， 2006， 15（1）：182-189.

作者簡介：黃旋（1989-），江蘇南通人，東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院在讀碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能；通訊作者：陸昌瑞（1983-），上海人，東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，教授，研究方向：核酸與結(jié)構(gòu)生物學(xué)。