神經(jīng)肽FF對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型的治療作用研究

孫韜　王春霞　李東海 馬艷云

【摘 要】目的：探討神經(jīng)肽FF（NPFF）對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎DBA/1小鼠模型的治療作用。方法：將30只DBA/1小鼠隨機(jī)分為膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型組、NPFF治療組、健康對照組，每組10只。CIA模型組和NPFF治療組利用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)法建立小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，造模后，NPFF治療組小鼠腹腔注射NPFF 30 mg·kg-1，每周3次，連續(xù)2周。CIA模型組腹腔注射同體積的生理鹽水作為對照。治療結(jié)束后對小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評分，檢測各組小鼠血清中細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-17的含量水平，取小鼠后足踝關(guān)節(jié)進(jìn)行病理學(xué)觀察及評分。結(jié)果：與CIA模型組比較，NPFF治療的CIA小鼠能夠明顯減輕CIA小鼠的臨床癥狀；明顯抑制CIA小鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生（P = 0.004）；顯著降低小鼠血清TNF-α（P = 0.000）、IL-1β（P = 0.001）和IL-17（P = 0.001）的含量水平；減少滑膜細(xì)胞增殖（P = 0.010）、炎性細(xì)胞浸潤（P = 0.007）、血管翳產(chǎn)生（P = 0.005）、炎癥（P = 0.002）和骨質(zhì)侵蝕（P = 0.003）的發(fā)生。結(jié)論：NPFF對DBA/1小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有治療作用，血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-17的顯著降低是NPFF治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；神經(jīng)肽FF；細(xì)胞因子；抗炎；小鼠

On the Therapeutic Effect of NPFF on Mouse Models with Rheumatoid Arthritis

SUN Tao，WANG Chun-xia，LI Dong-hai，MA Yan-yun

【ABSTRACT】Objective：To investigate the therapeutic effect of neuropeptide FF（NPFF）on DBA/1 mice models with rheumatoid arthritis.Methods：Thirty DBA/1 mice were randomly divided into a collagen-induced arthritis（CIA）model group，an NPFF treatment group and a healthy control group，with 10 mice in each.In the CIA model group and NPFF treatment group，the models of rheumatoid arthritis were induced by bovine type II collagen.After modeling，the mice in the NPFF treatment group were given an intraperitoneal injection of

30 mg·kg-1 NPFF，3 times per week for 2 weeks.While those in the CIA model group were given an intraperitoneal injection of the same volume of normal saline.After treatment，scores were made on mice arthritis index，and the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL）-1β and IL-17 in serum were detected.Ankle joints of mouses pleopoda were isolated for pathological observation and scoring.Results：Compared with the CIA model group，clinical symptoms of CIA mice treated with NPFF were significantly improved；the occurrence of polyarthritis in CIA mice was obviously inhibited（P = 0.004）；the contents of TNF-α（P = 0.000），IL-1β

（P = 0.001）and IL-17（P = 0.001）were significantly reduced；and synoviocyte proliferation（P = 0.010），

inflammatory cell infiltration（P = 0.007），pannus generation（P = 0.005），inflammation（P = 0.002）and bone erosion（P = 0.003）were decreased.Conclusion：NPFF has a therapeutic effect on rheumatoid arthritis in DBA/1 mice，and the significant reduction of inflammatory cytokines TNF-α，IL-1β and IL-17 in serum may be the mechanism of treating rheumatoid arthritis with NPFF.

【Keywords】arthritis，rheumatoid；NPFF；cytokine；anti-inflammation；mice

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的以滑膜炎及軟骨損傷為特點(diǎn)的慢性自身免疫性疾病[1]。大量研究表明，促炎因子參與RA的發(fā)病過程，尤其是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-17可引起軟骨損傷及骨質(zhì)侵蝕。TNF-α在關(guān)節(jié)炎癥過程中表現(xiàn)出高度釋放，特別是在炎癥疾病活動加重期[2]。IL-1β作為炎癥的始動因子，不僅會對機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生損傷，還會誘導(dǎo)其他細(xì)胞產(chǎn)生另外的炎性因子，造成更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[3]。IL-17已經(jīng)被證實(shí)在RA過程中可誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，并且造成骨關(guān)節(jié)的破壞[4-5]。牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）動物模型廣泛用于RA疾病研究，其優(yōu)點(diǎn)在于可精確模擬RA患者的臨床癥狀及病理學(xué)改變，特別是在關(guān)節(jié)炎、骨侵蝕及血管翳產(chǎn)生等方面[6]。有證據(jù)表明，CIA動物模型血清中IL-1β和IL-17均呈高濃度

表達(dá)[7]。

神經(jīng)肽FF（NPFF）作為一種內(nèi)源性神經(jīng)肽在1985年被首次報(bào)道。研究人員證實(shí)了NPFF具有多種生理學(xué)功能，包括鎮(zhèn)痛、阿片調(diào)節(jié)、心血管調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等[8]。但是，國內(nèi)外關(guān)于NPFF對RA的抗炎活性研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立CIA模型，對小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分、血清細(xì)胞因子檢測及組織病理學(xué)分析，深入研究NPFF抑制RA炎癥過程及部分相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性DBA/1小鼠30只，7～8周齡。購于北京華阜康生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2014-0004。小鼠置于環(huán)境溫度20～24 ℃，相對濕度為45%～55%的動物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。小鼠可自由攝食飲水，自然光線照明，室內(nèi)通風(fēng)良好，動物使用許可證號SYXK（軍）2012-0029。

1.2 藥物及試劑 牛Ⅱ型膠原（批號140158）、弗式完全佐劑（批號140373）和弗氏不完全佐劑（批號140490）均購于美國Chondrex公司；小鼠TNF-α（批號12198009）、IL-1β（批號119172026）和IL-17（批號120657018） ELISA檢測試劑盒均購于奧地利eBioscience公司；NPFF（批號15013091）購于中國波泰生物科技有限公司。

1.3 CIA小鼠模型的建立及給藥 將30只DBA/1小鼠隨機(jī)分為CIA模型組、NPFF治療組、健康對照組，每組10只。健康對照組不做任何處理，對其他2組小鼠進(jìn)行造模：將2 mg·mL-1牛Ⅱ型膠原與1 mg·mL-1弗氏完全佐劑等體積混合，乳化，制成終濃度為1 mg·mL-1的乳劑。將制備后的乳劑于每只小鼠的尾根部處皮下注射0.1 mL進(jìn)行初次免疫，并記為造模第0天；在造模第21天，

將2 mg·mL-1牛Ⅱ型膠原與1 mg·mL-1弗氏不完全佐劑等體積混合，乳化，制成終濃度為1 mg·mL-1的乳劑，再次于每只小鼠尾根部皮下注射0.1 mL進(jìn)行二次免疫。造模第22天開始對NPFF治療組小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥NPFF，

30 mg·kg-1，每周3次，連續(xù)2周。CIA模型組腹腔注射同體積的生理鹽水作為對照。初次免疫后第49天將各組小鼠處死取樣。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 足腫脹變化情況 二次免疫后，每隔4天，分別測量各組小鼠左、右后足趾厚度。腫脹厚度（mm） = 左足趾厚度（mm） - 右足趾厚度（mm）。每只小鼠左、右后足趾厚度均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.4.2 關(guān)節(jié)炎評分 二次免疫后，每隔4天，進(jìn)行一次關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)腫脹；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹[9]。

1.4.3 血清TNF-α、IL-1β和IL-17水平檢測 摘眼球取血1 mL左右，室溫放置30 min后，置于3000 r·min-1離心機(jī)離心10 min，利用小鼠ELISA試劑盒分別檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-17含量水平。

1.4.4 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察及評分 首次免疫后第49天，取各組小鼠后足炎性踝關(guān)節(jié)組織10%甲醛固定進(jìn)行HE染色，觀察組織病理改變，并進(jìn)行病理評分。各組小鼠的踝關(guān)節(jié)病理分別從滑膜細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕這五項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評分統(tǒng)計(jì)[10]。①滑膜細(xì)胞增殖評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無增殖；1分，輕微增殖，2～4層

滑膜細(xì)胞；2分，中度增殖，4層以上滑膜細(xì)胞；

3分，滑膜細(xì)胞過度增殖。②炎性細(xì)胞侵蝕評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無侵蝕；1分，較少的局部侵蝕；2分，廣泛的局部侵蝕；3分，廣泛侵蝕到關(guān)節(jié)囊，伴有凝聚體的形成。③血管翳評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無改變；1分，2個部位出現(xiàn)血管翳；2分，4個部位出現(xiàn)血管翳，伴有軟骨表面的侵蝕；3分，4個以上部位出現(xiàn)血管翳或者2個部位出現(xiàn)大范圍的血管翳。

④炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無炎癥；1分，輕度炎癥，出現(xiàn)1個聚集物或較少的分散白細(xì)胞浸潤；2分，中度炎癥，2個及以上的白細(xì)胞聚集物；3分，重度炎癥，白細(xì)胞融合，分散浸潤明顯。⑤骨質(zhì)侵蝕評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，正常；1分，小量侵蝕，1～2個

小的淺表部位；2分，少量侵蝕，1～4個中等大小和深度部位；3分，中等侵蝕，5個以上部位，局部侵蝕到骨皮質(zhì)；4分，重度侵蝕，多重?fù)p傷，局部或完全侵蝕到骨皮質(zhì)；5分，廣泛損傷，皮質(zhì)穿透骨長度的25%以上。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，兩兩比較采用雙因素方差分析（Tukey's post-tests）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠足腫脹變化情況 初次免疫第21天，小鼠逐漸開始發(fā)病，指關(guān)節(jié)紅腫癥狀多見于后足趾間關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)并累及前足趾。造模第41天，與CIA模型組小鼠比較，NPFF治療組小鼠足腫脹被顯著抑制（P = 0.005），抑制作用持續(xù)至第49天

（P = 0.003）；健康對照組無任何明顯腫脹變化。見圖1。

造模第49天，CIA模型組小鼠足掌及踝關(guān)節(jié)部位腫脹明顯；NPFF治療組小鼠的臨床癥狀明顯減輕，踝關(guān)節(jié)未出現(xiàn)明顯腫脹；健康對照組則無任何明顯腫脹變化。見圖2。

2.2 關(guān)節(jié)炎評分 小鼠在二次免疫后開始給予藥物治療，NPFF（30 mg·kg-1）腹腔注射給藥，每周3次，治療2周后，對各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分。結(jié)果表明，NPFF治療在首次免疫41 d 時(shí)表現(xiàn)出明顯地抑制CIA小鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生

（P = 0.004），并且抑制作用持續(xù)至第49天（P = 0.003）。

見圖3。

2.3 血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測 首次免疫后第49天，摘眼球取血1 mL左右，離心取血清分別檢測TNF-α、IL-1β和IL-17含量水平。結(jié)果顯示，健康對照組、CIA模型組和NPFF治療組小鼠血清TNF-α含量分別為（158.9±17.53）pg·mL-1、（570.1±

84.81）pg·mL-1、（336.6±37.32）pg·mL-1，方差

分析3組TNF-α含量水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（F = 14.350，P = 0.000）。兩兩比較結(jié)果顯示，CIA模型組的血清TNF-α含量水平較健康對照組明顯升高（P = 0.000）；NPFF治療組與健康對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.072）；NPFF治療組的血清TNF-α含量水平較CIA模型組明顯減低

（P = 0.014）。見圖4（1）。

健康對照組、CIA模型組和NPFF治療組小鼠血清IL-1β含量分別為（26.55±4.91）pg·mL-1、（62.25±7.54）pg·mL-1、（38.03±6.02）pg·mL-1。方差分析3組TNF-α含量水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 8.501，P = 0.001）。兩兩比較結(jié)果顯示，CIA模型組的血清IL-1β含量水平較健康對照組明顯升高（P = 0.001）；NPFF治療組與健康對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.408）；NPFF治療組的血清IL-1β含量水平較CIA模型組明顯減低（P = 0.028）。見圖4（2）。

健康對照組、CIA模型組和NPFF治療組小鼠血清IL-17含量分別為（30.07±4.10）pg·mL-1、（75.68±6.24）pg·mL-1、（48.80±6.02）pg·mL-1。方差分析3組IL-17含量水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 18.960，P = 0.000）。兩兩比較結(jié)果顯示，CIA模型組的血清TNF-α含量水平較健康對照組明顯升高（P = 0.000）；NPFF治療組與健康對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.066）；NPFF治療組的血清IL-17含量水平較CIA模型組明顯減低（P = 0.033）。見圖4（3）。

2.4 小鼠足趾組織病理學(xué)評分 首次免疫后第49天

處死小鼠，分別取健康對照組、CIA模型組和NPFF治療組小鼠后足炎性踝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行HE染色切片，觀察組織病理改變。結(jié)果顯示，健康對照組小鼠無滑膜細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳產(chǎn)生以及骨侵蝕表現(xiàn)；CIA模型組有明顯的滑膜組織增生、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳產(chǎn)生以及部分骨質(zhì)侵蝕；NPFF治療組則表現(xiàn)出少量滑膜細(xì)胞增殖，襯覆1～2層滑膜細(xì)胞，少量中性粒細(xì)胞浸潤以及輕微的骨侵蝕表現(xiàn)。見圖5。

分別對3組小鼠的后足踝關(guān)節(jié)組織從滑膜細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳產(chǎn)生、炎癥和骨質(zhì)侵蝕方面進(jìn)行評分，結(jié)果顯示，健康對照組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)病理評分為0分，NPFF治療組較CIA模型組小鼠在各項(xiàng)指標(biāo)病理評分上明顯降低。

見表1。

3 討 論

RA是一種以關(guān)節(jié)的慢性、反復(fù)發(fā)作性炎癥為特點(diǎn)的自身免疫性疾病。盡管NPFF對RA的抗炎活性研究還未見報(bào)道，但多項(xiàng)研究證實(shí)NPFF參與炎癥過程。1992年，Lecron等[11]發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞表明存在NPFF結(jié)合位點(diǎn)，隨后Lecron等[12]發(fā)現(xiàn)NPFF可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性。在角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠炎癥模型[13]和腸炎大鼠模型[14]上，脊髓部位NPFF2受體的表達(dá)有明顯上調(diào)。最近，Sun等[15]發(fā)現(xiàn)NPFF2受體在炎癥巨噬細(xì)胞上具有功能性表達(dá)；NPFF能夠抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生胞內(nèi)炎癥因子一氧化氮（NO）的濃度；同時(shí)腹腔注射NPFF能夠明顯降低小鼠的足腫脹炎癥反應(yīng)。以上研究證據(jù)充分表明NPFF系統(tǒng)參與體內(nèi)抗炎過程。因此筆者通過建立CIA小鼠模型，探究了NPFF對RA的治療作用及其相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，給予NPFF治療明顯地減輕了CIA小鼠的臨床癥狀，在足腫脹厚度改變、關(guān)節(jié)炎評分以及病理學(xué)評分等方面，NPFF治療組均低于CIA模型組，說明NPFF可以抑制牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠關(guān)節(jié)炎反應(yīng)。盡管RA的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但促炎癥細(xì)胞因子在RA疾病發(fā)生發(fā)展過程中高水平的表達(dá)已經(jīng)得到公認(rèn)，特別是血清TNF-α、IL-1β和IL-17含量水平顯著升高與RA密切相關(guān)。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在炎癥活動期可高水平表達(dá)。IL-1β作為炎癥的始動因素，可抑制軟骨細(xì)胞蛋白多糖的合成，并且促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集，加重關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)。IL-17是關(guān)節(jié)炎癥過程中的上游炎癥細(xì)胞因子，可刺激產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，進(jìn)一步造成軟骨破壞和關(guān)節(jié)損傷[16]?；谝陨系难芯孔C據(jù)，筆者又檢測了各實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清TNF-α、IL-1β和IL-17。結(jié)果顯示，NPFF治療組小鼠血清的各項(xiàng)細(xì)胞因子含量水平均低于CIA模型組小鼠的細(xì)胞因子含量水平，說明NPFF能夠降低炎癥狀態(tài)時(shí)血清炎性細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)這些炎性細(xì)胞因子濃度降低也可能是導(dǎo)致CIA小鼠臨床癥狀減輕的一種可能的作用機(jī)制。

目前，多肽藥物已被廣泛用于腫瘤、糖尿病、HIV及心血管等疾病的治療[17]。關(guān)于NPFF，自從被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員一直致力于對其多樣的生理活性進(jìn)行研究，并且已經(jīng)取得了一定成果[18]。據(jù)調(diào)查，目前對于NPFF研究的多數(shù)報(bào)道只停留在對其生物活性層面，尚未見到NPFF作為藥物治療的臨床研究，這也預(yù)示著該肽在治療疾病方面可能具有較大的發(fā)展空間。通過建立CIA小鼠模型，首次探究了NPFF在治療RA方面的抗炎活性，并且初步闡明了其可能的作用機(jī)制，（下轉(zhuǎn)第14頁）

（上接第9頁）這將為NPFF在炎癥領(lǐng)域的研究提供一種新的線索，也為該肽成為RA可能的治療藥物提供了重要的研究依據(jù)。

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收稿日期：2016-04-11；修回日期：2016-05-12