構(gòu)建原代分離培養(yǎng)與鑒定小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的方法及模型

張秋墨 金丹

【摘要】目的：構(gòu)建能夠?qū)π∈蠓闻茛蛐蜕掀ぜ毎M行分離、原代培養(yǎng)與鑒定的方法，從而對建立穩(wěn)定高效的細胞膜性起到積極的促進作用。方法：（1）使用低濃度胰酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶消化法，對小鼠的肺泡Ⅱ型上皮細胞進行分離；（2）經(jīng)差速離心差速貼壁和免疫黏附法對Ⅱ型上皮細胞進行純化及原代培養(yǎng)。并倒置顯微鏡對細胞形態(tài)及生長狀況進行觀察，測定肺泡Ⅱ型上皮細胞的產(chǎn)量、活力以及純度。對肺泡表面活性蛋白A和C的表達進行免疫細胞化學染色鑒定，使用透射電鏡對肺泡Ⅱ型上皮細胞的特異性細胞結(jié)構(gòu)進行鑒定。結(jié)果：每只小鼠所獲得的肺泡Ⅱ型上皮細胞數(shù)量為 ，純度為 ，細胞活力為 。且原代肺泡Ⅱ型上皮細胞在對倒置顯微鏡下為立方形或圓形，細胞質(zhì)內(nèi)存在許多差別非常明顯的細小顆粒，生長方式為島狀；在免疫細胞化學鑒定方面，肺泡表面的活性蛋白A為棕黃色，C為綠色，二者都定位表達于細胞漿；透射電鏡可見特征性板層小體及細胞游離面大量微絨毛。結(jié)論：胰酶聯(lián)合膠原酶消化，差速離心差速貼壁和免疫黏附純化法能夠獲得產(chǎn)量和純度都具有優(yōu)勢的AECⅡ，符合一般的體外實驗的要求。

【關鍵詞】原代分離；小鼠；肺泡Ⅱ型上皮細胞；方法；模型

1材料和方法

1.1材料

設計：單一樣本觀察。

地點：XX大學中心實驗室。

材料：健康清潔的小鼠6只，雌雄均為3只，體重19～23g。在實驗中對動物的處置符合國家《關于善待動物的指導性意見》中的相關規(guī)定。

試劑及儀器主要包括DEME培養(yǎng)基、 青霉素、 鏈霉素、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶等等以及兔抗鼠SP-A-抗、SP-C-抗、多聚賴氨酸、SABC試劑盒、DAB試劑盒、高速臺式離心機、 培養(yǎng)箱以及倒置顯微鏡和透射電鏡等等。

1.2方法

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離：將小鼠脫頸處死，盡快取下肺組織并洗干凈；將其剪成小塊；放入10mL的離心管，以2mL/只小鼠的標準加入1g/L胰蛋白酶。將吸管吹打均勻后在37℃的溫度孵育5min，將消化好的細胞懸液移除，并加入與之等量的含10%胎牛血清的DEME中止消化；使用同法用1g/L胰蛋白酶對肺組織進行5mim的消化，將消化好的細胞懸液移除并中止消化；在剩余肺組織中，按上述標準加入Ⅰ型膠原酶，孵育15min，移除細胞懸液，加入同上的胎牛血清，中止消化；吸管混勻后用過濾、離心、去上清，用DEME重懸沉淀。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞純化與培養(yǎng)：將肺細胞懸液接種入包被小鼠1gG的培養(yǎng)皿中，并孵育，吸出含未黏附細胞的液體接種于另一包被小鼠的1gG培養(yǎng)皿中，同法繼續(xù)孵育2次，并使用胎牛血清重懸沉淀，并接種于培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板中，24h后換液，此時貼壁的即為Ⅱ型上皮細胞。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的鑒定：將其置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，并使用多聚賴氨酸浸泡，吸出多聚賴氨酸后徹底吹干。對純化后的肺細胞懸液濃度進行調(diào)整并接種于蓋玻片，并加入SP-A-抗及SP-C-抗，進行免疫細胞化學操作，然后置于倒置顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

在AECⅡ的產(chǎn)量、純度及活力方面，每只小鼠的平均值分別為 、 、 。

倒置顯微鏡下，免疫黏附純化后的AECⅡ在接種后的12～18h開始伸展貼壁，形狀為圓形活力放心，且有小顆粒，胞核明顯。24h后逐漸融合。48h之內(nèi)為多邊形，72h后顆粒減少。六七天后無法辨認Ⅱ型細胞形態(tài)。而免疫黏附細胞48h后大量纖維細胞貼壁生長，呈不規(guī)則三角形或梭形。

透射電鏡下，小鼠AECⅡ呈圓形或立方形，胞質(zhì)內(nèi)有小泡，細胞游離面見大量微絨毛。其中圖1為倒置顯微鏡下原代培養(yǎng)的小鼠AECⅡ。

3討論

就目前的技術(shù)來說，從肺組織中將AECⅡ分離出來最常用的方法是酶消化法。常用的消化酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶和膠原酶等。本次研究中使用的是胰蛋白酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶的方式，而且降低了胰蛋白酶的消化濃度和時間。使用這種方式的目的，一是為了降低胰蛋白酶對肺泡上皮細胞的損傷，二是為了保證AECⅡ獲取的數(shù)量。膠原酶能夠?qū)毎|(zhì)起到消化作用，但對上皮細胞的影響不大。在細胞分離的過程當中，因為酶會對細胞產(chǎn)生一定的損害，細胞釋放出DNA，并與細胞外基質(zhì)形成DNA蛋白復合物，從而將細胞聚集起來。因此，為了使細胞無法聚集成團，經(jīng)常使用脫氧核糖核酸酶進行控制。在本次研究中，整個分離過程也都存在脫氧核糖核酸。而且，提高細胞活性的條件還包括保持低溫、縮短細胞分離的時間。

肺組織中的細胞較多，經(jīng)過酶消化后得到的細胞懸液中包括AECⅡ、纖維細胞、淋巴細胞等等。這樣的AECⅡ是不符合實驗研究的需要的，必須對其進行純化。AECⅡ純化方法種類較多，例如免疫黏附選擇、密度梯度離心法、單克隆抗體技術(shù)、貼壁選擇以及流式細胞儀篩選等等。每種方式均有自身的優(yōu)缺點，但部分方法的操作過程較為復雜，而且結(jié)果并不是很理想，細胞的數(shù)量較少，也容易受損。而使用差速離心差速貼壁和免疫黏附法對其進行純化，所得到的產(chǎn)量、純度、活力等均較高。本次研究中分別達到了 、 、 。

AECⅡ的鑒定主要是通過自身的形態(tài)及特異性來實現(xiàn)對標志物的表達。AECⅡ特異表達的物質(zhì)較多，例如SP-A、SP-B、SP-C等等。完全分化的AECⅡ最具代表性的表型是表達表面活性蛋白。在AECⅡ中，SP-A的含量最多，特異性及敏感性較高，檢出比較容易，因此是對免疫細胞進行化學鑒定的一種新方式。而SP-C是僅在AECⅡ上表達的唯一活性蛋白，因此也可使用它來進行AECⅡ的鑒定。在本次研究中，同時使用了SP-A和SP-C進行鑒定，相互之間取長補短，使得鑒定結(jié)果的可靠性增加，而且在20h就能完成，使得鑒定時間縮短。

結(jié)束語：

綜上所述，胰酶聯(lián)合膠原酶消化，差速離心差速貼壁和免疫黏附純化法能夠獲得產(chǎn)量和純度都具有優(yōu)勢的AECⅡ，符合一般的體外實驗的要求。

【參考文獻】

[1]陳坤，鄧世雄，劉芳君等.小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離、原代培養(yǎng)及鑒定[J].西南大學學報：自然科學版，2011，12（12）：123-126

[2]王燕，Aron B.Fisher，宋善路等.抗氧化酶Prdx6保護肺泡Ⅱ型上皮細胞抵抗過氧化氫誘導細胞凋亡的作用[J].實用兒科臨床雜志，2012，06（16） ：82-84.