絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性測定及酶學(xué)性質(zhì)研究

鄭桂花　趙倩　汪璨　陶濤　余龍江

摘要：通過測定苯甲醛在279 nm處的吸光度來確定絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，利用單因素試驗分析Escherichia coli SRZ018菌株最適產(chǎn)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的條件。結(jié)果表明，最適產(chǎn)酶條件為pH 8.0，反應(yīng)溫度50℃，CTAB為0.03 g/L，DL-β-苯基絲氨酸濃度為200 μmol/L，PLP濃度為50 μmol/L，該條件下絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的活性最高達到0.881 U/mg。

關(guān)鍵詞：絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶：單因素分析；DL-β-苯基絲氨酸：L-絲氨酸；Escherichia coli SRZ018

L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，可用于合成嘌呤、胸腺嘧啶、膽堿等前體。作為中間體，可用于合成L-色氨酸、L-多巴等。在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域均有較為廣泛的應(yīng)用。目前，生產(chǎn)絲氨酸的方法主要有蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)合成法、生物發(fā)酵法和酶法，酶法以其反應(yīng)過程簡單、催化專一性強、反應(yīng)條件溫和及轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，受到國內(nèi)外的普遍重視。近年來隨著固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)在氨基酸工業(yè)上的應(yīng)用，使酶法成為生產(chǎn)L-絲氨酸的研究熱點。

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（Serine Hydroxymethyltransferase，SHMT）是L-絲氨酸合成中的關(guān)鍵酶，催化甘氨酸和L-絲氨酸的相互轉(zhuǎn)化。在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，以5-磷酸吡哆醛作為輔酶，甘氨酸與N5，N10-亞甲基四氫葉酸反應(yīng)生成L-絲氨酸。研究發(fā)現(xiàn)以甘氨酸為底物酶法生產(chǎn)L-絲氨酸時，菌體積累L-絲氨酸的含量與菌體含有的SHMT活性直接相關(guān)，SHMT活性越高，菌體產(chǎn)生的L-絲氨酸就越多，因此，獲得高活力的SHMT是提高L-絲氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。本試驗根據(jù)已有的報道建立了一種快速、簡易的SHMT測定方法，通過單因素試驗優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高酶活力，以期達到間接提高菌株由甘氨酸轉(zhuǎn)化為L-絲氨酸的能力。

1.材料與方法

1.1菌株來源

E.coli-SRZ018菌株由華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保藏。

1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿51.96 g/L，磷酸氫二鉀5.88 g/L，甘油13.60g/L，谷氨酸鈉5g/L，MgSO40.8 g/L，蛋白胨5g/L，脯氨酸0.5 g/L，維生素B6 0.5g/L。

1.3其他試劑

DL-B-苯基絲氨酸購自Biosharp公司，磷酸吡哆醛（PLP）、氫氧化鈉、氨芐青霉素、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和十六烷基三甲基溴化銨（cTAB）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.4方法

1.4.1菌種活化與培養(yǎng) 菌株培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量均為30 mL，250 mL三角瓶，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，分別加入氨芐青霉素，終濃度達到100μg/mL，混合均勻。將保存的凍干管菌種接種至LB平板活化，活化好的菌株按照5%的濃度接種至種子培養(yǎng)基，37℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)4.5 h，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)14 h。

1.4.2酶活測定 逆向酶活是絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）活力的主要評價指標(biāo)，逆向酶活的測定原理：SHMT可以催化DL-B-苯基絲氨酸分解產(chǎn)生苯甲醛，苯甲醛在279 nm處有最大吸收峰，因此可通過檢測酶反應(yīng)液在279 nm處的吸光度計算SHMT酶活。

1）苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmoL/L的苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，于紫外分光光度計279 nm處測定其吸光度，根據(jù)吸光度Az79m（y）和濃度（x）的關(guān)系繪圖，得到苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性范圍、回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。

2）SHMT逆向酶活的測定：取一定量發(fā)酵液于5 000 r/min離心10 min，去除上清液，加入適量的去離子水洗滌菌體1～2次，去除上清液，加入配制好的底物1 mL，振蕩混合均勻，于30℃水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束將反應(yīng)液8 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋至合適濃度后測定A279，以去離子水稀釋底物相同倍數(shù)的溶液為對照，根據(jù)苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計算SHMT逆向酶活。

1.4.3E.coli-SRZ018產(chǎn)SHMT條件的優(yōu)化 以酶反應(yīng)液的各組分為基礎(chǔ)進行單因素水平研究，以磷酸緩沖液控制反應(yīng)體系的pH，每個條件重復(fù)3次，研究DL-β-苯基絲氨酸、PLP、pH、CTAB、溫度等因素對E.coli-SRZ018生產(chǎn)SHMT活性的影響。

1）CTAB對SHMT活性的影響。取相同量的菌體，依次加入CTAB的濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g/L，測定SHMT活性。

2）DL-B-苯基絲氨酸對SHMT活性的影響。CTAB的添加量為0.03 g/L時，向底物中加入DL-β-苯基絲氨酸，濃度依次為50、100、150、200、250mmol/L，測定SHMT活性。

3）PLP對SHMT活性的影響。在苯基絲氨酸添加量為250μmol/L、CTAB添加濃度0.03 g/L時，分別考察PLP濃度為10、20、30、40、50、60、70、80μmol/L時SHMT的活性，

4）酶的最適反應(yīng)pH。最適反應(yīng)pH因底物種類，濃度及緩沖液成分的不同而不同，分別用pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的緩沖液配制底物反應(yīng)溶液，30℃保溫1 h，測定SHMT活性。

5）溫度對SHMT活性的影響。將底物溶液分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃水浴中保溫1 h，測定SHMT活性。

2.結(jié)果與分析

2.1SHMT活性檢測方法的建立

對苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液進行紫外掃描，考慮到當(dāng)吸收波長小于240 nm時，吸收干擾較大，選定的波長應(yīng)大于240 nm，對苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品進行全波長掃描。根據(jù)全波長掃描的結(jié)果，苯甲醛在279 nm處有最大吸收，故選定檢測SHMT活性的波長為279 nm。

在波長279 nm的條件下，測定不同濃度的苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，苯甲醛的回歸方程為r=0.000 5+1.026x，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。上述結(jié)果表明，在0.05～0，80mmol/L范圍內(nèi)，苯甲醛在279 nm處吸光度和濃度的線性關(guān)系良好。

2.2CTAB對SHMT活性的影響

CTAB濃度過低會對細(xì)胞的破壁效果有一定影響，細(xì)胞不能完全破壁，胞內(nèi)酶SHMT不能完全釋放，相反，CTAB的濃度過高，會影響酶的活性，導(dǎo)致酶的活性降低，因此，有必要考察不同濃度的CTAB對酶活性的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，CTAB濃度在0.01-0.03g/L時，SHMT活性逐漸增加，CTAB濃度為0.03g/L時，SHMT活性達到最大值0.278 U/mg。因此，選擇0.03 g/L為最適CTAB濃度。

2.3DL-β-苯基絲氨酸對SHMT活性的影響

由圖3可知，DL-β-苯基絲氨酸濃度在50-200μmoL/L范圍內(nèi)，SHMT活性持續(xù)增加，當(dāng)DL-β-苯基絲氨酸濃度為200 μzmol/L時，SHMT活性達到最大0.780 U/mg，DL-β-苯基絲氨酸濃度為250 μmol/L時，SHMT活性緩慢下降。因此，選擇200 μmol/L為最適的DL-β-苯基絲氨酸濃度。

2.4PLP對SHMT活性的影響

根據(jù)圖4結(jié)果可知，PLP濃度在20-40 μmol/L范圍內(nèi)，SHMT活性由0.232 U/mg逐漸增加，PLP為50 μmol/L時，SHMT活性最高為0.378 U/mg。因此，選擇50μmol/L為最適PLP濃度。

2.5SHMT的最適反應(yīng)pH

如圖5所示，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶在pH 7-9之間，酶活維持在0.900 U/mg以上，pH<6時酶活相對較低，pH為8時，SHMT活性最大，達到1.184 U/mg。

2.6溫度對SHMT活性的影響

如圖6所示，溫度對SHMT活性有很大影響，反應(yīng)時間為1 h時，SHMT可以耐受較高溫度，隨著溫度的升高SHMT活性逐漸上升，40-60℃范圍內(nèi)，SHMT保持相對較高的活性，50℃時酶活達到最大，為1.246U/mg，故選擇50℃為SHMT的最適反應(yīng)溫度。

3.小結(jié)

本試驗建立的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的測定方法，是一種快速、簡易的方法，可用于E.coli-SRZ018菌株及其他產(chǎn)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶菌種活性的測定。逆向酶活的最佳反應(yīng)條件為pH 8.0，50℃，CTAB的濃度0.03 g/L，DL-β-苯基絲氨酸200 μmol/L，PLP為50 μmol/L，測得最優(yōu)條件下的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的活性為0.881 U/mg。