中藥四藤方對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞的侵襲力及上皮鈣黏附蛋白（E—cadherin）表達(dá)的影響

毛竹君 沈克平 姚瓊 鄭佳露 奚燕萍

摘要：目的 檢測(cè)中藥四藤方對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）蛋白表達(dá)，并觀察中藥對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲力的影響。方法 實(shí)驗(yàn)組加入四藤方對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后在進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)甲基噻唑基四唑法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞活性，使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力變化，RT-PCR、檢測(cè)E-cadherin mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 四藤方能抑制人胃癌BGC823細(xì)胞的增殖；抑制缺胃癌細(xì)胞的侵襲力，并且能降低E-cadherin mRNA的表達(dá)。結(jié)論 四藤方可抑制人胃癌BGC823細(xì)胞的增殖，可能通過(guò)降低E-cadherin mRNA的表達(dá)來(lái)抑制人胃癌BGC823細(xì)胞侵襲力。

關(guān)鍵詞：中藥；胃癌；BGC-823；侵襲

四藤方由紅藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜四藥組成，來(lái)源于我院著名腫瘤專(zhuān)家邱佳信教授臨床驗(yàn)方“胃腸安方”中的小拆方，我的導(dǎo)師沈克平主任認(rèn)為此四味中藥補(bǔ)中有泄，抗胃癌同時(shí)不傷正氣，尤其適合胃癌患者。故導(dǎo)師治胃癌患者以此為基礎(chǔ)辯證與辨病相結(jié)合預(yù)防胃癌復(fù)發(fā)收效甚捷。前期研究證實(shí)四藤方具有一定抑制胃癌轉(zhuǎn)移的作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行了四藤方在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用和機(jī)制的探索。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 ①中藥材四藤方（紅藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜）由龍華醫(yī)院藥材科提供，產(chǎn)地明確，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定。②主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（PAA公司產(chǎn)品）；甲基噻唑基四唑（MTT）（美國(guó)Sigma公司）；BGC-823細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所，細(xì)胞培養(yǎng)皿等耗材為Conming公司產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑Reverse Transeriptase M-MLV、RNase Inhibitor、Oligo d（T）18、dNTP Mixture和RealTime PCR檢測(cè)試劑盒均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；

1.2主要儀器及設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本（三洋；離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀，均鉤于美國(guó)Thermo公司；梯度PCR和RealtimePCR儀均為Ft本TaKaRa公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1四藤方藥物的提取 將四藤方飲片（菝葜、野葡萄藤、藤梨根等）浸泡30 min，煎煮2次，30min/次，紗布粗慮去渣，將所得濾液以5000 轉(zhuǎn)離心30min以初步去掉大的顆粒雜質(zhì)。取清液濃縮至300ml，加等體積的無(wú)水乙醇后置于4℃ 冰箱過(guò)夜沉淀。取出各藥物與乙醇的混合液，再以5000轉(zhuǎn)，30min離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇濃縮藥液，濃縮至50ml左右時(shí)取出，室內(nèi)揮發(fā)24h后冷凍干燥，當(dāng)藥物成粉末狀時(shí)取出，稱(chēng)重，臨用時(shí)用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，0.22pure微孔濾器過(guò)濾除菌。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù) 實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為空白組、藥物干預(yù)組（組加人不同濃度四藤方（1、10、100、1000、10000μg/ml），其中空白組使用不含藥物的RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集細(xì)胞樣本進(jìn)行mRNA含量檢測(cè)，取處理后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。

1.3.3 BGC823細(xì)活性檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823細(xì)胞使用胰酶消化，1000轉(zhuǎn)離心5min收集細(xì)胞沉淀，使用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105個(gè)/ml每孔200ul。接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)平行孔，正常條件培養(yǎng)，于第24、48、72h，各取一塊培養(yǎng)板，每孔添加濃度為15 mg/ml的MTT，緩慢晃動(dòng)培養(yǎng)板其在培養(yǎng)基均勻分布，正常條件共孵育4h，去培養(yǎng)液，加入DMSO150ul的溶液，于37℃溫育4h，100rpm震蕩10min。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm吸光值。

1.3.4 Realtime-PCR測(cè)定E-cadherin mRNA含量 各干預(yù)組BGC823細(xì)胞培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞樣本，進(jìn)行E-cadherin mRNA含量檢測(cè)。使用Trizol法提取細(xì)胞樣本的Total RNA，電泳判斷總RNA的完整性，紫外分光檢測(cè)RNA純度及濃度。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系及Oligo（dT）18 Primer引物逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。設(shè)計(jì)用于定量檢測(cè)的PCR引物，引物序列如下：E-cadherin的上游引物序列為5'-GAACGCATTGCCACATAC-3'，下游引物序列為5'-ACCTTCCATGACAGACCC-3'。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），其上游引物序列為5'-GACAGTCAGCCGCATClTCT-3'，下游引物序列為5'-ACATGTAAACCATGTAGTTGAGGT-3'。PCR引物設(shè)計(jì)好之后，PCR驗(yàn)證引物擴(kuò)增效率和引物特異性，然后使用熒光染料法（SYBR）進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，獲得實(shí)驗(yàn)曲線和數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5胃癌細(xì)胞BGC823侵襲力檢測(cè)使用劃痕實(shí)驗(yàn) 使用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基各組BGC-823細(xì)胞按5×105/L接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，用200μl的槍頭沿著孔中央直徑線做劃痕，PBS洗1次，實(shí)驗(yàn)組加入中藥四藤方（濃度為100μg/ml），為了排除增殖對(duì)遷移實(shí)驗(yàn)的影響，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后取出6孔板，分別在0h，24h倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況。比較各組細(xì)胞細(xì)胞向劃痕邊緣向劃痕內(nèi)遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析（ANCOVA）及LSD兩兩比較法。應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析及總體比較；P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01認(rèn)為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 BGC-823細(xì)胞增殖率檢測(cè) 通過(guò)MTT檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，含不同藥物體積的培養(yǎng)液均能不同程度的抑制BGC細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，且培養(yǎng)液內(nèi)藥物含量越高，培養(yǎng)時(shí)問(wèn)越長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到的抑制作用也越明顯，見(jiàn)表1。不僅與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），而且高濃度藥物組相比低濃度藥物組的抑制率，也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），見(jiàn)圖1。提示，中藥四藤方具有抑制BGC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用。使用公式法求出四藤方提取物對(duì)于BGC823細(xì)胞的ID50：各藥物濃度組的生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔平均OD值/對(duì)照孔平均OD值）×100% ，ID50=lg-1[Xm-i（∑P-0.5）]，重復(fù) 3次取平均值，取平均值約為 7.930%。

2.2 BGC-823細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá) 通過(guò)Rt-PCR檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)，四藤方ID50濃度干預(yù)的細(xì)胞，24h后E-cadherin mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）。提示，四藤方具有上調(diào)BGC細(xì)胞E-cadherin基因表達(dá)的作用（P<0.05），從而抑制腫瘤細(xì)胞的黏附轉(zhuǎn)移（表2，圖2）。

2.3細(xì)胞侵襲力實(shí)驗(yàn)（劃痕實(shí)驗(yàn)） 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，使用四藤方ID50濃度干預(yù)24h后，侵襲力較對(duì)照組組下降，明顯抑制人胃癌細(xì)胞株BGC-823的遷移，實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合率為（47.454～10.05）%，對(duì)照組劃痕愈合率為（88.23±5.45）%（P<0.05），見(jiàn)圖3及圖4。

3 討論

E-cadherin又被稱(chēng)為上皮-鈣黏蛋白，定位于16號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)2帶，含有16個(gè)外顯子、15個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)約100 kb，其編碼的跨膜糖蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為124×103。E-cadherin廣泛分布于人類(lèi)上皮細(xì)胞中，是鈣依賴(lài)的黏附分子家族成員之一，可介導(dǎo)正常細(xì)胞間的黏附，維持正常上皮細(xì)胞形態(tài)、極性及組織結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)還參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[1～3]，當(dāng)E-cadherin表達(dá)下降或缺失時(shí)，細(xì)胞間的相互黏附力下降，一旦獲得轉(zhuǎn)移的必要條件，就可脫離原發(fā)灶而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。因此，E-cadherin被認(rèn)為是一種抑癌基因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中藥四藤方作用24h后可明顯抑制人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞的增殖。通過(guò)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)中藥四藤方ID50濃度作用24h能明顯抑制人胃癌細(xì)胞株BGC-823的遷移。提示四藤方在降低胃癌的侵襲力方面可能具有一定抗腫瘤的作用。為了研究四藤方降低胃癌侵襲力的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了ID50濃度的四藤方作用24h后BGC-823細(xì)胞 E-cadherin mRNA的表達(dá)量明顯提高。

四藤方由紅藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜四藥組成，大血藤，又名“大活血”、“紅藤”等，根據(jù)《中國(guó)藥典》記載，大血藤氣微，味苦微甘，性平，無(wú)毒，入肝、胃、心包、大腸經(jīng)。具解毒消癰，活血止痛，祛風(fēng)除濕，殺蟲(chóng)功效。其中紅藤的粗提取液被發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[5]。野葡萄藤，《廣西植物名錄》：清熱利濕，消腫解毒。治痢疾，瘡瘍腫毒。有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其單獨(dú)具有抗胃癌功效是專(zhuān)病專(zhuān)藥[6]。藤梨根《全國(guó)中草藥匯編》清熱解毒，祛風(fēng)除濕，利尿止血。用于風(fēng)濕骨痛，以及黃疸等癥。有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其單獨(dú)具有抑制胃癌[7]的功效，屬于專(zhuān)病專(zhuān)藥。菝葜見(jiàn)《別錄》：“味甘，平溫，無(wú)毒?！薄镀穮R精要》：“散腫毒。”紅藤、藤梨根清熱解毒，菝葜、野葡萄藤消腫祛濕。在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)示四藤方可以上調(diào)SGC -7901 胃癌Caspase -3 蛋白表達(dá)，促進(jìn)PARP 蛋白剪輯，抑制Livin表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。

本研究結(jié)果首次表明，中藥四藤方在體外可以有效抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞株的增殖和遷移，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)BGC-823細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮了抑制胃癌細(xì)胞遷移的作用。

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編輯/安樺