骨橋蛋白在侵入性胎盤組織中的表達和意義

趙衛(wèi)衛(wèi) 侯朝暉 陳冰 任力 朱建平

[摘要] 目的 分析骨橋蛋白（OPN）在侵入性胎盤和正常胎盤組織中的表達差異，探討其在侵入性胎盤發(fā)病機制中的作用。 方法 選取2014年1月～2015年10月在中國人民解放軍空軍總醫(yī)院婦產科住院分娩的單胎晚期妊娠68例產婦的胎盤組織為研究對象，將其中正常妊娠產婦的胎盤組織34例作為對照組，侵入性胎盤疾病產婦的胎盤組織34例作為研究組，其中胎盤粘連26例（胎盤粘連組），胎盤植入8例（胎盤植入組）。采用免疫組化EnVision二步法檢測所有胎盤組織中OPN蛋白表達水平；采用SYBR Green PCR方法檢測所有標本中OPN mRNA的表達水平。 結果 OPN蛋白在胎盤粘連組、胎盤植入組和對照組胎盤組織中的陽性表達率分別為73.07%、75.00%、35.29%。胎盤粘連組和胎盤植入組OPN蛋白陽性表達率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；胎盤植入組與胎盤粘連組OPN蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。胎盤粘連組中OPN mRNA表達較對照組上調1.36倍，而胎盤植入組OPN mRNA表達較對照組上調了1.21倍。 結論 胎盤組織中OPN表達升高可能與侵入性胎盤疾病的發(fā)生有關。

[關鍵詞] 骨橋蛋白；侵入性胎盤；粘連性胎盤；植入性胎盤

[中圖分類號] R339.22 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（b）-0080-04

[Abstract] Objective To investigate the role in thepathogenesis of placenta accrete through analyzing the expression differences of osteoponin （OPN） in the tissues of placenta accrete and normalplacenta. Methods Sixty-eight cases of placenta tissues of the third trimester pregnant women delivering in Department of Gynecology and Obstetrics of Air Force General Hospital from January 2014 to October 2015 were chosen as the research objects. 34 cases of placenta tissues from normal pregnancy women were taken as the control group and 34 cases of placenta tissues from pregnant women with placenta accrete were taken as the research group， of which including 26 cases of placenta adhesion （placenta adhesion group） and 8 cases of placenta increta （placenta increta group）. The protein expressions of OPN in all placenta tissues were measured by EnVision immunohistochemistry. The mRNA expression of OPN in all placenta tissues were detected through SYBR Green PCR method. Results The positive rates of OPN protein expression in the placenta adhesion group， placenta increta group and control group were 73.07%， 75.00%， 35.29% respectively. The positive rates of OPN protein expression in the placenta adhesion group and placenta increta group were both significantly higher than the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no statistically significant difference between placenta increta group and placenta adhesion group （P > 0.05）. The mRNA expression of OPN in placenta adhesion group increased 1.36 times compared with the control group； and the mRNA expression of OPN in placenta increta group increased 1.21 times compared with control group. Conclusion High expression of OPN in tissues of placenta may be related to the pathogenesis of placenta accrete.

[Key words] Osteoponin； Placenta accrete； Placenta Adhesion； Placentaincreta

侵入性胎盤是由于胎盤種植部位子宮內膜缺損或者發(fā)育不良，導致胎盤絨毛直接種植在子宮肌層甚至深入肌層的病理現(xiàn)象[1]，是導致產后出血極為嚴重的并發(fā)癥。根據(jù)絨毛侵入子宮肌層的深度分為粘連性胎盤、植入性胎盤和穿透性胎盤[2]。目前我國剖宮產率居高不下，計劃外妊娠人工流產不斷增加，“普遍二胎”制度放開，妊娠伴子宮創(chuàng)傷史的孕婦會越來越多，侵入性胎盤疾病的發(fā)生率也將隨之上升。據(jù)統(tǒng)計，近年來我國侵入性胎盤的發(fā)病率占所有妊娠的0.4%～1.93%[3]。侵入性胎盤疾病發(fā)病隱蔽，胎盤娩出前不易被發(fā)現(xiàn)，處理起來被動棘手，因此該疾病越來越受到人們的關注。骨橋蛋白（osteoponin，OPN）是一種細胞外介質，可以與整合素受體αvβ3特異性結合，從而發(fā)揮細胞間黏附、細胞遷移以及細胞外基質的相互作用[4]。目前對于OPN與侵入性胎盤疾病發(fā)生關系的報道極為少見，本研究采用免疫組化EnVision二步法和SYBR Green PCR方法檢測晚孕期侵入性胎盤組織中OPN的表達情況，從而初步探討OPN在侵入性胎盤發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2015年10月在空軍總醫(yī)院婦產科住院分娩的單胎晚期妊娠孕婦共68例，其中正常妊娠孕婦胎盤組織34例作為對照組，發(fā)生侵入性胎盤疾病孕婦胎盤組織34例作為研究組，其中包括胎盤粘連26例（胎盤粘連組），胎盤植入8例（胎盤植入組）。參照Gielchinshey等[5]在2002年提出的侵入性胎盤的診斷標準，排除合并妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、圍生期心肌病及胎膜早破等病史的孕婦。經過孕婦同意，并經相關醫(yī)學醫(yī)學倫理委員會批準，收集部分產后胎盤組織進行檢測。三組孕婦年齡、妊娠次數(shù)及孕齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。

1.2 標本采集

產婦胎盤娩出后迅速取胎盤母面粘連或植入部位的胎盤組織2～3塊，正常胎盤選取中間帶部位，避開出血、壞死、鈣化的地方，每塊大小1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，用生理鹽水沖洗，置于4%多氯甲醛中固定24 h后，自來水沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，最后石蠟包埋制成蠟塊，用于免疫組化和SYBR Green PCR實驗。

1.3 免疫組織化學EnVision二步法檢測胎盤組織OPN蛋白表達水平

每例標本取石蠟切片2張，EnVision二步法免疫組織化學染色。主要步驟：石蠟切片60℃烤片機過夜；二甲苯脫蠟2次，每次5 min；100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、雙蒸水各5 min，水化；盛有pH 6.0乙二胺四乙酸液（北京中杉金橋生物技術有限公司）的高壓鍋中高溫抗原修復2 min；3%過氧化氫溶液中10 min，阻斷內源性過氧化物酶；磷酸緩沖鹽（PBS）液沖洗后，滴加一抗即兔抗人OPN單克隆抗體（1∶150，北京中杉金橋生物技術有限公司），37℃孵育60 min；PBS液沖洗，滴加二抗（DAKO公司），室溫孵育30 min；PBS液沖洗，使用二氨基聯(lián)苯胺溶液（DAKO公司）顯色，自來水沖洗；蘇木精復染，1%的鹽酸酒精分化，1%氨水中返藍；75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精脫水各3 min；二甲苯溶液透明，中性樹膠封片。用一抗稀釋液替代一抗進行陰性對照，反應呈陰性。

1.4 免疫組化結果判定標準

參照Shimizu法[6]，每張切片在顯微鏡下觀察隨機選擇5個高倍鏡視野，計數(shù)100個細胞。根據(jù)陽性細胞在全部組織細胞中所占的百分比以及陽性細胞染色強度進行半定量評分。陽性細胞占總細胞百分比評分：<25%為0分；25%～50%為1分；>50%～75%為2分；>75%為3分。染色強度評分：不著色為0分；黃色為1分；棕色為2分；棕褐色為3分。根據(jù)以上兩項評分之和進行判斷：0分為陰性（-）；1～2分為弱陽性（+）；3～4分為中度陽性（++）；5～6分為強陽性（+++）。

1.5 SYBR Green PCR方法檢測胎盤組織中OPN mRNA表達水平

分別取5 μm厚石蠟切片5片，使用HiPure FFPE RNA Plus Kit試劑盒（Magen公司）提取RNA。使用核酸測定儀（Merinton公司）檢測并記錄提取樣品RNA濃度，計算OD260/OD280比值。比值為1.80～2.00，說明純度符合要求；低于1.80說明存在蛋白質污染，需要重新提取RNA。使用M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Omega公司）反轉錄cDNA。選用GAPDH作為內參指標，標準化目的基因結果，校正不同樣本間RNA純度和逆轉錄效率的差異。最后取2×RT2 SYBR Green Mastermix 10 μL、RNase-Free Water 4 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 4 μL配成20 μL體系，每例樣品均設4個平行重復孔。簡單離心后置于實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD）中，并設定程序：95℃ 10 min，1次；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環(huán)40次，進行擴增。所有步驟均按照相關說明書嚴格執(zhí)行。引物由迪納興科公司設計合成，引物序列見表2。

1.6 SYBR Green PCR結果處理

由于Ct值指從基線到指數(shù)增長的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)，是指數(shù)關系，而不是線性關系，不能用t檢驗或者方差分析等的統(tǒng)計學方法。因而將原始Ct值轉換為2-Ct，從而達到線性關系。本實驗采用Ct值法（2-ΔΔCt）對SYBR Green PCR結果進行相對定量分析。2-ΔΔCt表示實驗組目的基因表達相對于對照組變化的倍數(shù)。計算公式：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參基因）研究組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組[7]。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組胎盤組織中OPN蛋白表達情況

OPN蛋白在侵入胎盤組和對照組胎盤組織中均有表達，其免疫反應陽性產物為棕褐色顆粒狀或點狀，主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞胞漿和胞膜中，絨毛間質和毛細血管內皮細胞中也有大量表達。侵入性胎盤組OPN蛋白表達較對照組細胞數(shù)量多，著色深。高倍鏡下觀察胎盤植入組胎盤組織中OPN蛋白表達與胎盤粘連組并無明顯差異，見圖1（封三）。OPN在胎盤粘連組、胎盤植入組和對照組胎盤組織中表達的陽性率分別為73.07%、75.00%、35.29%。胎盤粘連組、胎盤植入組標本中OPN蛋白陽性表達率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。而胎盤植入組與胎盤粘連組標本中OPN蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表3。

2.2 SYBR Green PCR檢測結果

OPN mRNA在在兩組胎盤組織中均有表達，經2-ΔΔCt法分析后可知：胎盤粘連組中OPN mRNA表達較對照組上調1.36倍，而胎盤植入組OPN mRNA表達較對照組上調了1.21倍。

3 討論

OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白，分子量為25～75 kU，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）特殊結構域。RGD特殊結構域是OPN發(fā)揮多種生物學功能的重要結構，可以與整合素受體αvβ3結合[8]，從而發(fā)揮細胞間黏附、細胞遷移以及細胞外基質的相互作用。OPN廣泛存在于多種組織、體液和細胞中，包括骨、軟骨、血液、尿液、乳汁、白細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、腫瘤細胞等[9]。OPN在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10-11]、免疫調節(jié)[12]以及損傷修復[13]中的作用已經得到公認。劉能輝等[14]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，OPN在圍植入期小鼠子宮內膜中有表達，且隨孕齡增加而表達增強。殷莉等[15]通過免疫組化和RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)OPN mRNA和蛋白在婦女種植期子宮內膜組織中的表達明顯升高，在早孕蛻膜和絨毛組織中表達進一步升高，推測OPN可能與種植窗開放和胚胎著床有關。Von Wolff等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，OPN mRNA在妊娠6～9周的蛻膜組織也有表達，是分泌期的1.5倍。推測OPN與妊娠密切相關，可能參與受精、胚胎著床、胎盤形成、母胎界面黏附、信號轉導以及母胎免疫調節(jié)等生殖的全過程[17]。

正常的妊娠的建立需要胎盤滋養(yǎng)細胞黏附、侵入并固定在蛻膜樣變的子宮內膜上。滋養(yǎng)細胞屬于上皮細胞，是胎盤的主要細胞，具有侵襲功能，這種功能與腫瘤細胞極為相似而又不同。滋養(yǎng)細胞的侵襲行為受時間和空間的嚴格限制，這是滋養(yǎng)細胞與腫瘤細胞的主要區(qū)別[18]。滋養(yǎng)細胞的分化和侵襲能力決定胎盤能否正常發(fā)育。而胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲行為受到細胞因子、細胞外基質蛋白以及黏附分子的共同調控作用，相互制約平衡，一旦平衡被打破，就可能造成滋養(yǎng)細胞侵襲不足或者過度侵襲，從而發(fā)生各種病理妊娠[19]。Batorfi等[20]研究證實葡萄胎中OPN蛋白和mRNA水平的表達均明顯降低。薛涵等[21]研究發(fā)現(xiàn)稽留流產患者絨毛和蛻膜組織中OPN表達低于正常人流組。秦晨等[22]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)自然流產組小鼠絨毛和蛻膜組織中OPN的表達明顯低于正常妊娠組織。夏俊霞等[23]研究證實，OPN在子癇前期患者胎盤組織中低表達，滋養(yǎng)細胞侵襲力下調，導致滋養(yǎng)細胞淺浸潤，子宮螺旋動脈重鑄失敗，胎盤淺著床。推測OPN在胎盤組織中的低表達可能導致葡萄胎、流產、子癇前期等疾病。

本研究結果顯示，OPN在正常妊娠和侵入性胎盤組織中均有不同程度表達。OPN主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞胞漿和胞膜中，間質和毛細血管內皮細胞中也有表達。OPN蛋白在粘連性胎盤、植入性胎盤胎盤組織中表達的陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；胎盤植入組OPN蛋白陽性表達率與胎盤粘連組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。胎盤粘連組OPN mRNA較對照組上調了1.36倍，而胎盤植入組OPN mRNA較對照組上調了1.21倍。據(jù)此推測，OPN在侵入性胎盤組織中高表達，滋養(yǎng)細胞侵襲能力上調，導致滋養(yǎng)細胞侵襲過度，胎盤侵入甚至穿透子宮肌層，從而導致侵入性胎盤的發(fā)生。但是OPN具體是如何作用使滋養(yǎng)侵襲力上調導致侵入性胎盤發(fā)生的機制尚不清楚，有待進一步研究。本研究中植入性和胎盤粘連組織中OPN表達差異并無顯著性，可能為樣本數(shù)量較少所致，有待擴大樣本量進一步研究。本研究為侵入性胎盤的發(fā)生機制提供參考依據(jù)，臨床上能否以OPN為突破點，預測和預防侵入性胎盤疾病的發(fā)生，仍需進一步研究。

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（收稿日期：2015-12-10 本文編輯：任 念）