痛瀉要方及防風(fēng)對肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜COX-2及外周血中IL-6的影響*

郭軍雄，閆立國

(河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅張掖734000)

痛瀉要方及防風(fēng)對肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜COX-2及外周血中IL-6的影響*

郭軍雄，閆立國

(河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅張掖734000)

目的:觀察痛瀉要方及防風(fēng)對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸 黏膜COX-2，血清白細(xì)胞介素－6(IL-6)的影響。方法:將72只Wistar大鼠分為6組，應(yīng)用病證結(jié)合復(fù)合法復(fù)制肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠后，分別給予防風(fēng)、痛瀉要方去防風(fēng)、痛瀉要方、柳氮磺胺吡啶灌胃治療，正常對照組和模型對照組給予生理鹽水。4周后處死大鼠，分離血清和結(jié)腸組織，評價結(jié)腸組織損傷，采用免疫組化法檢測結(jié)腸組織COX-2水平，放射免疫法檢測血清IL-6的水平。結(jié)果:痛瀉要方組結(jié)腸黏膜的損傷、COX-2蛋白表達(dá)，血清IL-6水平較防風(fēng)組、痛瀉要方去防風(fēng)組有明顯下降，痛瀉要方組與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論:痛瀉要方可下調(diào)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜COX-2蛋白的表達(dá)，降低血清IL-6炎性因子的水平來促進(jìn)潰瘍的愈合，而防風(fēng)在全方中發(fā)揮了不可替代的佐助作用。

痛瀉要方/藥效學(xué);防風(fēng)/藥效學(xué);潰瘍性結(jié)腸炎;COX-2;IL-6;動物;大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)作為非特異性腸道炎癥性疾病，病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床以腹痛、腹瀉和黏液膿血便為主要表現(xiàn)。大部分UC可伴終身，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并有一定的結(jié)腸癌變傾向，迄今尚無特效的治療方法，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。研究［1－2］指出，環(huán)氧合酶－2(COX-2)和白細(xì)胞介素－(IL-6)與 UC的病情進(jìn)展息息相關(guān)，可作為檢測 UC發(fā)展程度的重要指標(biāo)。中醫(yī)藥治療UC具有明顯優(yōu)勢，臨床組方中常配伍風(fēng)藥治療UC，效果良好，但其治療機(jī)制不明。前期研究［3］表明:痛瀉要方配伍風(fēng)藥(柴胡、升麻)可通過清除氧自由基、抗氧化來減輕UC大鼠結(jié)腸組織的損傷。本課題組擬在前期研究基礎(chǔ)上，采用2，4，6－三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌腸法建立UC大鼠，觀察防風(fēng)、痛瀉要方、痛瀉要方去防風(fēng)對UC大鼠結(jié)腸黏膜COX-2、血清IL-6的影響，探索痛瀉要方及防風(fēng)治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級 wistar大鼠，雌雄各 36只，體質(zhì)量(180±20)g，購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號:SCXK(甘)2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施合格證號:SYXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

炒白術(shù)、炒白芍、炒陳皮、防風(fēng)飲片均由河西學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥房提供。依據(jù)《景岳全書·卷之五十四書集》［4］中痛瀉要方的藥物劑量的比例確定上述中藥的用量。將中藥洗凈，浸泡40 min，加水煎煮兩次，合并煎液，過濾，95℃水浴濃縮至每毫升含生藥0.75 g。痛瀉要方祛除防風(fēng)或單純選擇防風(fēng)，按上述方法制備水煎劑，使每毫升含生藥0.75 g。將以上藥物分裝，高壓滅菌消毒，冰箱保存?zhèn)溆?。柳氮磺胺吡啶腸溶片(SASP)，0.25 g/片，上海信誼天平藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號09140806，用研缽研碎，溶于蒸餾水中，調(diào)配成0.03 g/mL的混懸液備用。2，4，6 －三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司產(chǎn)品，批號2008-16-2;無水乙醇，天津市化學(xué)試劑工廠提供，批號20140501;白介素－6(IL-6)放射免疫藥盒，購自北京華英生物技術(shù)研究所，批號20151015;大鼠抗COX-2免疫組化試劑盒，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號AE062452;SP-9001生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG免疫組化檢測試劑盒(批號15121A01)和濃縮型DNA試劑盒(批號K146712F)，購自北京中杉金橋公司。γ－911全自動放免計(jì)數(shù)儀，中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司產(chǎn)品;TGL－16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;BI－2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品;MiE圖像處理系統(tǒng)，山東易創(chuàng)電子有限公司產(chǎn)品;OLYMPUS－CX21型顯微鏡，產(chǎn)地日本。

1.3 動物分組與模型的建立

將動物隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、柳氮磺胺吡啶組、防風(fēng)組、痛瀉要方組、痛瀉要方去防風(fēng)組，每組12只。除正常對照組外，其余各組采用TNBS/乙醇溶液灌腸外加束縛法和飲食失節(jié)復(fù)合法制備肝郁脾虛型UC大鼠模型［5］:造模各組大鼠每日不定時束縛四肢，限制其自由活動4 h左右;隔日喂養(yǎng)，模擬飲食饑飽失常。束縛1周后，所有動物禁食(不禁水)24 h;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/L的水合氯醛(3 μL/g)腹腔麻醉;取直徑 2 mm、長12 cm聚丙烯管，由肛門輕緩插入約8 cm深的腸腔內(nèi)，將TNBS/乙醇液(100 μg/g TNBS+500 mL/L 的乙醇0.25 mL)緩慢推入結(jié)腸;捏緊肛門，提取大鼠尾巴倒立1 min，使注入藥液與結(jié)腸充分接觸;麻醉清醒后正常喂養(yǎng);第2天即為造模成功。正常對照組大鼠于肛門內(nèi)約8 cm處注入等體積生理鹽水。

1.4 給藥方法

各組于造模成功后第2天開始灌胃，藥物等效劑量以成人常規(guī)劑量的10倍計(jì)算，各中藥組均按相當(dāng)于生藥7.5 g/kg劑量灌服，SASP組按0.3 g/kg劑量灌服，正常對照組與模型對照組每日予以等體積生理鹽水灌服，1 d 1次，連續(xù)21 d。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 血清 IL-6含量

灌胃結(jié)束，各組大鼠禁食、不禁水24 h，乙醚麻醉后股動脈采血5 mL，37℃水中放置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，于4℃ 冰箱保存，測血清IL-6含量。檢測由北京華英生物技術(shù)研究所承擔(dān)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 結(jié)腸黏膜損傷及 COX-2蛋白表達(dá)

采血后脫頸處死大鼠，迅速剖取距肛門2～10 cm處結(jié)腸，沿腸系膜緣剪開腸腔并展平，用生理鹽水沖洗，肉眼觀察，比較各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷;取部分結(jié)腸組織，以40 g/L多聚甲醛固定，采用免疫組化SP法檢測結(jié)腸黏膜COX-2，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié)腸黏膜損傷評分按照Luketal［6］標(biāo)準(zhǔn)。0分:無炎癥和潰瘍。1分:充血但無潰瘍。2分:充血、腸壁變厚但無潰瘍。3分:有1處潰瘍及炎癥，直徑0～1 cm。4分:潰瘍較大，直徑1～2 cm，腸管與外周臟器組織無粘連。5分:潰瘍延伸直徑超過2 cm，腸管增厚，并與周圍臟器組織粘連嚴(yán)重。

COX-2蛋白表達(dá)以胞漿或核膜內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性，陽性染色細(xì)胞≤10%為陰性(－)，＞10%且≤30%為弱陽性(+)，＞30%且≤50%為陽性(++)，＞50%為強(qiáng)陽性(+++)。采用BI－2000型醫(yī)學(xué)圖像免疫組化分析系統(tǒng)，隨機(jī)選擇5個視野，測量陽性細(xì)胞平均積分吸光度，吸光度越大蛋白表達(dá)越強(qiáng)，反之則表達(dá)越弱。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清IL-6含量對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清IL-6含量升高，說明造模后大鼠IL-6含量明顯升高(P＜0.01)。與模型對照組對比，痛瀉要方組和SASP組IL-6含量均降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-6含量對比x±s

2.2 結(jié)腸黏膜損傷及評分對比

肉眼觀察:正常對照組大鼠腸管無增厚及粘連，腸黏膜光滑平整，皺襞紋理清楚，無充血、糜爛及潰瘍。模型對照組大鼠腸管增厚，腸黏膜明顯充血、水腫、可見散在多處糜爛和潰瘍面，部分腸管粘連，組織損傷評分較正常對照組明顯增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。防風(fēng)組大鼠腸黏膜輕度充血、水腫，可見部分潰瘍和糜爛面。痛瀉要方去防風(fēng)組大鼠腸管不厚，有輕度的充血、水腫，未見明顯糜爛和潰瘍面，可見潰瘍愈合瘢痕。痛瀉要方組和柳氮磺胺吡啶組大鼠腸黏膜偶有輕度的充血、水腫。與模型對照組對比，防風(fēng)組、痛瀉要方去防風(fēng)組、痛瀉要方組、柳氮磺胺吡啶組結(jié)腸黏膜損傷評分降低，尤以痛瀉要方組、柳氮磺胺吡啶組最為明顯 (P＜0.01)。見表 2。

2.3 各組大鼠結(jié)腸黏膜COX-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞平均積分光密度對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠結(jié)腸黏膜COX-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞平均積分光密度上升，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型對照組對比，痛瀉要方與柳氮磺胺吡啶組結(jié)腸黏膜COX-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞平均積分光密度降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見表3。

表2 各組UC大鼠結(jié)腸黏膜損傷評分的比較x±s

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜COX-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞平均積分光密度對比x±s

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織COX-2蛋白的表達(dá)

正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜COX-2蛋白呈陰性，模型對照組COX-2呈強(qiáng)陽性，防風(fēng)組COX-2呈陽性，痛瀉要方去防風(fēng)組COX-2呈陽性，痛瀉要方組COX-2呈弱陽性，柳氮磺胺吡啶組COX-2呈弱陽性。見圖1。

圖1 免疫組化圖片(SP染色，×40倍)

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎又被稱為非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，與克隆病合稱為炎癥性腸病。UC病變主要位于結(jié)腸黏膜和黏膜下層，且以潰瘍?yōu)橹鳎＠奂爸蹦c和結(jié)腸遠(yuǎn)端，也可累及整個結(jié)腸。探尋UC病因和發(fā)掘治療藥物一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。目前研究多認(rèn)為，UC與機(jī)體免疫反應(yīng)的交互性、環(huán)境、遺傳易感性等緊密相關(guān)，尤與腸黏膜局部免疫反應(yīng)的異常關(guān)系密切。COX-2是體內(nèi)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素代謝過程中的關(guān)鍵酶，正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)甚少，一旦受到炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等刺激，COX-2表達(dá)量迅速增加，從而合成多種過量的PGE2等前列腺素類物質(zhì)，最終導(dǎo)致結(jié)腸黏膜充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng)，并影響腸管運(yùn)動和血流量，使本已存在的炎癥放大或持久化。越來越多的證據(jù)提示，COX-2表達(dá)與UC炎癥發(fā)展密切相關(guān)［7－8］。IL-6是一個具有多種潛能的前炎癥細(xì)胞因子，可由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌。IL-6的表達(dá)過量會引發(fā)機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，促使腸上皮細(xì)胞的電解質(zhì)分泌增加，通透性增強(qiáng)，中性粒細(xì)胞浸潤;同時，IL-6還可結(jié)合可溶性IL-6受體形成IL-6/sIL-6R/gp130復(fù)合物，活化相應(yīng)受體，介導(dǎo)UC炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致UC炎性病變的持續(xù)與加重［9－10］。

根據(jù)UC的發(fā)病規(guī)律及證候特征，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“腸澼”“休息痢”等范疇。有文獻(xiàn)［11］統(tǒng)計(jì)，全國UC患者以大腸濕熱、脾胃虛弱、肝郁脾虛和脾腎兩虛證為主。肝郁脾虛型UC患者常因飲食失宜或情志因素誘發(fā)腹痛、腹瀉、多見黏液血便，伴情緒抑郁、焦慮，噯氣不爽，腹脹食少，這與痛瀉要方主治的脾虛肝郁證不謀而合。方中重用白術(shù)苦甘而溫，補(bǔ)脾運(yùn)濕以治土虛;白芍酸寒，柔肝緩急止痛;陳皮辛苦而溫，理氣醒脾和胃;尤妙配少量風(fēng)藥防風(fēng)，專入肝脾二臟，辛能散肝郁，香能舒脾氣，且為脾經(jīng)引經(jīng)藥，其性輕靈升浮，能勝濕而止瀉。臨床治療UC，配伍防風(fēng)和去掉防風(fēng)療效大不相同。本研究通過對實(shí)驗(yàn)性UC大鼠灌服防風(fēng)、痛瀉要方去防風(fēng)、痛瀉要方，發(fā)現(xiàn)痛瀉要方全方在促進(jìn)結(jié)腸黏膜損傷的愈合方面明顯優(yōu)于單純的防風(fēng)和痛瀉要方去防風(fēng)方，初步提示:痛瀉要方或方藥配以風(fēng)藥防風(fēng)可通過下調(diào)結(jié)腸COX-2蛋白的表達(dá)、外周血清IL-6炎性因子的水平來減輕腸黏膜的炎性反應(yīng)和促進(jìn)潰瘍的愈合。本研究亦為臨床適當(dāng)配伍風(fēng)藥能顯著提高UC的治療效果提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］王少鑫，浦江，劉超群，等.炎癥因子 TNF-α、IL-6和 IL-4獵誒瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)及臨床意義［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2015，24(1):104.

［2］鐘英強(qiáng)，顏蓉，黃花榮，等.GFAP和COX-2在中重度活動期潰瘍性結(jié)腸炎活檢標(biāo)本中的表達(dá)及其臨床意義［J］.胃腸病學(xué)，2011，16(8):469

［3］王小蓮，郭軍雄，馬麗，等.痛瀉柴升方對肝郁脾虛型UC大鼠MPO、SOD 和 MDA 的影響［J］.中醫(yī)研究，2011，24(11):19.

［4］張介賓，著.景岳全書［M］.趙立績，校.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:1397.

［5］朱向東，梅曉云，王燕，等.痛瀉要方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(4):942.

［6］WALLACE JL，KEENAN CM.An orally active inhibitor of leukotriene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis［J］.Am J Physiol，1990，258(4 Pt 1):G527 － 34.

［7］苗新普，歐陽欽，韋紅.COX-2、PPARy和 NF-KBp65在潰瘍性結(jié)腸炎組織中的表達(dá)及意義［J］.世界華人消化雜志，2010，18(25):2664.

［8］張超賢，郭李柯，郭曉鳳.環(huán)氧合酶-2-1195G/A和錳超氧化物歧化酶9Ala/Val基因多態(tài)性與高脂飲食的交互作用及其與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，37(1):41.

［9］牛靖，閆海金.自擬健脾方治療脾虛濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎臨床觀察及作用機(jī)制研究［J］.四川中醫(yī)，2016，34(11):89.

［10］董艷，曹永清，陸金根，等.IL-6/STAT3信號通路在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中機(jī)制及香連丸對其的預(yù)作用［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2016，50(6):78.

［11］陳新林，張長榮，王丹丹，等.潰瘍性結(jié)腸炎證候分布的文獻(xiàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35(2):378.

1001－6910(2017)11－0073－05

R573.1

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2017.11.33

郭軍雄(1977－)，男(漢族)，甘肅通渭人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事中醫(yī)藥防治潰瘍性結(jié)腸炎的基礎(chǔ)及臨床研究。

甘肅省教育廳基金資助項(xiàng)目(1030－02);河西學(xué)院科研創(chuàng)新與應(yīng)用校長基金項(xiàng)目(XZ2014－32)

2017－06－06;

2017－10－23(編輯 陶 珠)