馬鈴薯X病毒研究進(jìn)展

陳虞超　聶峰杰　張麗　鞏檑　甘曉燕　石磊　宋玉霞

摘 要：從PVX的發(fā)生與分布、基因組結(jié)構(gòu)與功能、檢測(cè)方法、防治技術(shù)和應(yīng)用研究方面進(jìn)行了綜述，同時(shí)對(duì)PVX的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，旨在為PVX的深入研究提供參考。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯X病毒；分布與發(fā)生；基因結(jié)構(gòu)與功能；檢測(cè)方法；防治技術(shù)

馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）又稱馬鈴薯潛隱病毒（Potato latent virus）或馬鈴薯輕花葉病毒（Potato mild mosaic virus），為馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）模式成員，是由一條正鏈RNA組成的線性病毒，RNA長(zhǎng)約6.4 kbp，病毒粒子呈長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)×寬=515 nm×13 nm。自然條件下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之間接觸摩擦進(jìn)行機(jī)械傳播。PVX單獨(dú)侵染時(shí)癥狀較輕，與馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、煙草脈斑駁病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）等馬鈴薯Y病毒屬病毒復(fù)合侵染時(shí)癥狀加劇，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1～3]。目前有關(guān)PVX的分布與發(fā)生、基因組結(jié)構(gòu)和功能、檢測(cè)方法、防控技術(shù)以及生產(chǎn)應(yīng)用等方面的研究均取得顯著進(jìn)展。本文對(duì)上述研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，探討其中尚存在的問(wèn)題，以期為深入開(kāi)展PVX相關(guān)研究提供一定參考。

1 PVX的發(fā)生與分布

所有馬鈴薯（Solanum tuberosum）產(chǎn)區(qū)均存在PVX發(fā)生的現(xiàn)象，但不同栽培品種受PVX侵染情況存在較大差異，有些品種帶毒率較高。在田間，PVX侵染馬鈴薯植株，引起輕型花葉或者潛隱病征，若多年侵染則易引起重花葉或者植株矮化，造成10%～80%減產(chǎn)。PVX常與PVY復(fù)合侵染，使癥狀加劇[4～6]。PVX主要靠汁液接觸傳播，也可以由某些昆蟲(chóng)如異黑蝗（Melanoplus differentialis）和綠叢螽斯（Tettigonia viridissima）的咀嚼式口器經(jīng)機(jī)械作用傳播，菟絲子（Cuscuta campestris）和集合油壺菌（Synchytium endobiotcum）也能夠傳播該病毒，但實(shí)生種子不能傳毒[7]。PVX 寄主范圍較廣，可侵染16科240種植物，茄科植物是主要的寄主，其診斷寄主有白肋煙（White burley）及其他煙草（Nicotiana tabacum）品種。初侵染的葉片通常表現(xiàn)為壞死斑，之后發(fā)展為壞死斑駁、褪綠、花葉或脈褪綠。在曼陀羅（Datura stramonium）上繼斑駁之后產(chǎn)生褪綠環(huán)，脈褪綠或脈壞死。煙草栽培品種適于作繁殖寄主。千日紅（Gomphrena globosa）是較好的指示植物，除HB株系外都產(chǎn)生局部斑[8，9]。

對(duì)于PVX株系的分類還未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但Cockerham[10]的方法認(rèn)可度較高，該方法根據(jù)PVX侵染攜帶不同抗病基因（Nx和Nb）的馬鈴薯植株所表現(xiàn)出的癥狀，將PVX株系分為4組，分別是X1、X2、X3和X4。X1組（如CS35株系）在含Nx、Nb基因的馬鈴薯上均能引起過(guò)敏反應(yīng)（Hypersensitive resistance，HR）。X2組（如CP株系）只在含Nb基因的馬鈴薯上引起HR。X3組（如UK3、DX株系）只在含有Nx基因的馬鈴薯上引起HR。X4組（如DX4、CP4、HB株系）則能完全克服Nx、Nb抗性。許多研究表明，PVX的外殼蛋白（Coat protein，CP）基因在決定PVX與植物抗病基因互作方面起著重要作用。CP可作為激發(fā)子使馬鈴薯產(chǎn)生HR、ER（極端抗病性，extreme resistance，ER）反應(yīng)，CP基因核苷酸序列的變化會(huì)導(dǎo)致寄主產(chǎn)生不同的癥狀類型。因此，PVX的CP基因序列分析也有助于對(duì)PVX的分類研究[11～16]。

2 PVX的基因組結(jié)構(gòu)與功能

PVX基因組由一條單組分的正單鏈RNA分子組成，長(zhǎng)度約6.4 kbp。RNA的5′-末端有m7GpppA帽子結(jié)構(gòu)，3′-末端有1個(gè)poly（A）尾結(jié)構(gòu)，共包含5個(gè)開(kāi)放式閱讀框（Open reading frane，ORF）。ORF1編碼166 kDa的RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），是PVX合成RNA必需的，也是唯一來(lái)源于自身的蛋白。中間的ORF2、ORF3、ORF4相互重疊，被稱為三基因區(qū)段（Triple-gene block，TGB），分別編碼25 kDa的TGBp1蛋白、12 kDa的TGBp2蛋白、8 kDa的TGBp3蛋白，這些蛋白與病毒在寄主細(xì)胞間的移動(dòng)有關(guān)，其中，TGBp1蛋白已經(jīng)被證明是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的抑制因子，可打破寄主植物的防御反應(yīng)，使病毒成功侵染。3′-末端的ORF5編碼25 kDa的病毒外殼蛋白（Capsid protein，CP），除具有包裝核酸的功能外，也是病毒在細(xì)胞間移動(dòng)所必需的，而且還能起到復(fù)制調(diào)節(jié)的作用[17～19]。

另外，PVX基因組還包括5′-末端非翻譯區(qū)域（5′-Untranslational region，5′-UTR）和3′-端非翻譯區(qū)域（3′-Untranslational region，3′-UTR）。5′-UTR有84個(gè)核苷酸（nt），已有的研究表明，5′-UTR對(duì)于病毒的復(fù)制、細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)以及病毒的組裝等有重要作用[20～23]。3′-UTR有72個(gè)核苷酸，含有多種重疊的作用元件，其中包括1個(gè)富含U的八核苷酸序列，對(duì)于病毒RNA與寄主蛋白之間的互作以及病毒的增殖起著重要作用[24]。

3 PVX的檢測(cè)方法

PVX的檢測(cè)方法較多，主要包括指示植物檢測(cè)法、電鏡檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和核酸介導(dǎo)的分子生物學(xué)檢測(cè)法。

3.1 指示植物檢測(cè)法

指示植物檢測(cè)法是利用指示植物被PVX侵染后所表現(xiàn)出的特異癥狀，來(lái)檢測(cè)PVX是否存在。指示植物檢測(cè)法簡(jiǎn)便可行，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，可迅速掌握利用。吳凌娟等[9]用多種指示植物分離鑒定了PVX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)千日紅發(fā)病時(shí)間短、易觀察，比較適合作為PVX檢測(cè)的指示植物。常用于檢測(cè)PVX的指示植物還包括白花刺果曼陀羅（Datura metel）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）等。但指示植物檢測(cè)法耗時(shí)較長(zhǎng)，受環(huán)境影響較大，準(zhǔn)確性和靈敏度不高，已不作為PVX檢測(cè)和鑒定的主要方法，多用于分子生物學(xué)或免疫學(xué)檢測(cè)之前的初步鑒定[25]。

3.2 電鏡檢測(cè)法

電鏡檢測(cè)法是開(kāi)展植物病毒研究的常規(guī)手段之一，主要是通過(guò)觀察病毒粒子形態(tài)、內(nèi)含物、亞結(jié)構(gòu)等方面的特征來(lái)確定病毒的種類。電鏡的分辨率可達(dá)到0.5 nm，比指示植物法更直觀、速度更快、觀察結(jié)果也更準(zhǔn)確。張仲凱等[26，27]利用電鏡對(duì)云南地區(qū)的PVX等病毒進(jìn)行了觀察和鑒定。電鏡還可以觀測(cè)到病毒引起的寄主細(xì)胞的病變和內(nèi)含體特征，是深度研究病毒病機(jī)理的重要手段。但是，電鏡檢測(cè)法所需儀器設(shè)備昂貴，操作過(guò)程繁瑣，對(duì)人員要求較高，在PVX檢測(cè)上應(yīng)用較少。

3.3 免疫學(xué)檢測(cè)法

①酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）由Voller等[28]首次應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)，主要是利用抗原與酶標(biāo)抗體特異性結(jié)合以及底物的顯色反應(yīng)，檢測(cè)病毒存在與否，并可對(duì)病毒含量進(jìn)行初步測(cè)定。ELISA具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合于口岸、生產(chǎn)企業(yè)開(kāi)展大樣本檢測(cè)。ELISA依據(jù)支持物的不同可分為雙抗體夾心法（DAS-ELISA）和硝酸纖維素膜法（NCM-ELISA）。DAS-ELISA和NCM-ELISA在PVX檢測(cè)上應(yīng)用較為廣泛。李云海等[29]利用ELISA對(duì)云南省馬鈴薯脫毒試管苗的PVX病毒進(jìn)行了檢測(cè)；白艷菊等[30]利用DAS-ELISA對(duì)黑龍江省主栽馬鈴薯品種的脫毒試管苗及田間收獲薯塊感染PVX的情況進(jìn)行了檢測(cè)；仲乃琴[31]利用DAS-ELISA對(duì)甘肅省種植的6個(gè)馬鈴薯品種的老齡薯、幼齡薯以及2個(gè)品種的莖尖組培苗攜帶PVX的情況進(jìn)行了檢測(cè)分析；張國(guó)柱[32]利用NCM-ELISA對(duì)山西省的主栽馬鈴薯品種PVX感染情況進(jìn)行了檢測(cè)，并均取得了較好的結(jié)果。

②免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，ICG）是一種新型檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，樣品用量較少、無(wú)需特殊處理，檢測(cè)時(shí)間短，僅15 min便可完成，肉眼水平便可觀察結(jié)果，特別適合口岸檢疫、基層單位的實(shí)驗(yàn)室和大田病毒病害的快速檢測(cè)[33，34]。魏梅生等[35]已研制出用于PVX檢測(cè)的ICG試紙條，該試紙條的靈敏度和精確度均較高。張麗等[36]利用ICG技術(shù)對(duì)寧夏地區(qū)不同馬鈴薯品種及不同級(jí)別脫毒種薯的脫毒情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ICG檢測(cè)效果與ELISA相當(dāng)，但具有樣本用量極小、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于一級(jí)種薯田間小樣本抽樣檢測(cè)。

3.4 分子生物學(xué)檢測(cè)法

分子生物學(xué)方法在馬鈴薯病毒檢測(cè)中的應(yīng)用發(fā)展十分迅速。與傳統(tǒng)馬鈴薯病毒檢測(cè)方法相比，其具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，尤其是反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和核酸斑點(diǎn)雜交（Nucleic acid spot hybridization，NASH）技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于PVX的檢測(cè)。

①RT-PCR技術(shù) RT-PCR技術(shù)以PVX的RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后對(duì)cDNA擴(kuò)增，最后進(jìn)行檢測(cè)分析，該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和取樣量少等優(yōu)點(diǎn)，十分適合種薯生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)控管理[37]。關(guān)翠萍

等[38]運(yùn)用一步RT-PCR法對(duì)馬鈴薯中的PVX等病毒進(jìn)行了檢測(cè)，建立了靈敏度較高的一步法RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。朱云芬等[2]建立了PVX的RT-PCR和

IC-RT-PCR（Immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction）技術(shù)，認(rèn)為這2種方法均具有較高的靈敏度，均可滿足檢測(cè)需求。在RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究者們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了多重RT-PCR技術(shù)，可對(duì)PVX等多種馬鈴薯病毒同時(shí)進(jìn)行有效的檢測(cè)[39～41]。

②NASH技術(shù) NASH技術(shù)是將PVX基因組的一段核苷酸序列進(jìn)行放射性或非放射性標(biāo)記，制成探針，再與待檢樣品的核酸進(jìn)行雜交，從而指示PVX的存在與否[42]。Eweida等[43]利用NASH檢測(cè)PVX，結(jié)果表明該方法的靈敏度是ELISA的100～250倍。Katarzyna等[44]利用NASH對(duì)馬鈴薯組培苗中的PVX等病毒進(jìn)行了多重檢測(cè)。吳興泉等[45]首次在國(guó)內(nèi)研究建立了PVX的NASH檢測(cè)技術(shù)，認(rèn)為NASH可完全滿足檢測(cè)的實(shí)際要求。

4 PVX的防治技術(shù)

PVX的防治技術(shù)主要包括生產(chǎn)脫毒種薯、培育抗病毒品種和利用抗病毒化學(xué)藥劑3個(gè)方面。生產(chǎn)脫毒種薯是目前最主要的防控措施，培育抗病品種是今后的發(fā)展方向，研發(fā)有效的抗病毒化學(xué)藥劑也是一個(gè)重點(diǎn)領(lǐng)域。

4.1 脫毒種薯生產(chǎn)

脫除PVX的常用方法有熱處理脫毒法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法，其中熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法應(yīng)用最為廣泛，脫毒效果也最顯著[46，47]。PVX脫毒種薯的生產(chǎn)流程主要分為4步，第一步是在實(shí)驗(yàn)室利用上述脫毒方法去除PVX，得到馬鈴薯組培脫毒試管苗；第二步是在溫室或者網(wǎng)室內(nèi)開(kāi)展微型薯（也稱作原原種，薯塊質(zhì)量1～20 g）的生產(chǎn)；第三步是在田間開(kāi)展原種（薯塊質(zhì)量小于

75 g）的生產(chǎn)；第四步是在田間開(kāi)展一級(jí)種（也稱作生產(chǎn)種，薯塊質(zhì)量50～100 g）的生產(chǎn)。在脫毒種薯的生產(chǎn)過(guò)程中，必須對(duì)各級(jí)種薯攜帶PVX的情況進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格控制種薯帶毒率。

4.2 抗病品種培育

常規(guī)育種技術(shù)是馬鈴薯抗病毒病育種的主要途徑之一，主要是通過(guò)雜交等方法，將抗性栽培種、野生種或近緣種的抗病基因引入到主栽品種

中[48，49]。目前，研究者們已經(jīng)分離了多個(gè)抗PVX的基因。Ritter等[50]分離定位了PVX的極端抗性基因Rx1和Rx2，并將其引入到馬鈴薯育種材料中；Bendahmane等[51]在馬鈴薯栽培種Cara中分離了

PVX的極端抗性基因Rx，并將其定位于Ⅻ染色體上；Tommiska等[52]從二倍體栽培種Solanum phureja IvP35中分離到PVX高敏抗性基因Nxphu，并將其定位到Ⅸ染色體上。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是馬鈴薯抗病毒病育種的一個(gè)新途徑，主要是通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，將具有抗PVX功能的外源基因整合到目標(biāo)馬鈴薯品種的基因組中，增強(qiáng)其PVX抗性。這些功能基因種類較多，主要包括馬鈴薯自身的抗性基因、PVX外殼蛋白基因以及其他物種體內(nèi)的抗性基因。張鶴齡等[53]、Doreste等[54]分別將PVX的CP基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種虎頭、克新4號(hào)和cv. Desiree中，得到了具有較強(qiáng)PVX抗性的轉(zhuǎn)基因株系。Lodge等[55]將美國(guó)商陸（Phytolacca americana）的PAP基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種Russet Burbank中，得到的轉(zhuǎn)基因后代表現(xiàn)出較強(qiáng)的PVX抗性。

4.3 抗病毒病化學(xué)藥劑的利用

利用化學(xué)藥劑對(duì)PVX進(jìn)行防治也是一個(gè)重點(diǎn)研究方向。研究表明，嘌呤、嘧啶堿基類似物等物質(zhì)具有抑制PVX活性的功能。Huber等[56]研究發(fā)現(xiàn)，8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、8-氮雜腺嘌呤和6-丙基-2-硫代尿嘧啶對(duì)PVX具有明顯的抑制作用；Schulze等[57]研究發(fā)現(xiàn)，6-氨基尿嘧啶、6-氨基胸腺嘧啶和9-（2，3-二羥基丙基）腺嘌呤具有抑制PVX復(fù)制的功能；Schuster等[58，59]發(fā)現(xiàn)，咪唑衍生物類物質(zhì)病毒唑（三氮唑核苷）可完全抑制馬鈴薯莖培養(yǎng)物中PVX 的增殖，三嗪類衍生物DHT（2，4-二酮-六氫化1，3，5-三嗪）等對(duì)PVX也具有抑制作用。

5 PVX的應(yīng)用

PVX主要用作植物外源基因的表達(dá)載體，研究者們多采用基因插入和融合蛋白2種構(gòu)建方法構(gòu)建PVX表達(dá)載體?；虿迦敕ㄊ菍⑼庠椿虿迦隤VX的CP基因的2個(gè)重復(fù)啟動(dòng)子之間，利用CP基因的啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)外源基因的表達(dá)。為了避免重復(fù)的啟動(dòng)子同源結(jié)合導(dǎo)致外源基因丟失現(xiàn)象的發(fā)生，通常利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（1RES）取代其中1個(gè)啟動(dòng)子[60]。融合蛋白是將目的基因以及通讀序列插入CP基因之前，編碼CP與目的基因的融合蛋白，然后利用病毒復(fù)制組裝將目的蛋白呈現(xiàn)在病毒粒子表面，表達(dá)后再?gòu)闹参镏蟹蛛x出重組病毒，用蛋白酶消化后進(jìn)行提純，得到抗原或非抗原藥物蛋白[60～62]。PVX作為表達(dá)載體具有易轉(zhuǎn)化、效率高等優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)上都得到了廣泛的應(yīng)用。Baulcombe等[63]、Avesani等[64]、Wagner等[65]、Zhou等[66]、楊鳳萍等[67]先后利用PVX載體生產(chǎn)了綠色熒光蛋白GFP、胰島素谷氨酸脫羧酶自抗原GAD65、植物過(guò)敏原、人巨粒細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF和乙肝表面抗原HBsAg。PVX載體在商業(yè)上存在顯著的應(yīng)用價(jià)值，F(xiàn)itchen等[68]利用PVX載體在煙草中生產(chǎn)兒童病毒性胃腸炎疫苗VP6蛋白，該方法生產(chǎn)的疫苗具有安全性高、數(shù)量大、成本低、儲(chǔ)藏方便等優(yōu)點(diǎn)。

6 展望

PVX病毒病是影響馬鈴薯生產(chǎn)的主要病害之一，對(duì)PVX開(kāi)展深入研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前有關(guān)PVX發(fā)生與分布、基因結(jié)構(gòu)與功能、檢測(cè)方法等方面的研究較多，也取得了較大的進(jìn)展。PVX病毒病防治方面，主要采用莖尖脫毒以及三級(jí)快繁體系生產(chǎn)脫毒種薯，抗病毒病化學(xué)藥劑因其防治效果有限，應(yīng)用比較少?？共《静∑贩N育種是PVX病毒病防治的主要發(fā)展方向，但這方面的研究進(jìn)展較為緩慢，亟待加大研究力度，培育出既具有良好抗病性，又能滿足生產(chǎn)實(shí)際需求的馬鈴薯品種。雖然PVX易對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)造成較嚴(yán)重的影響，但我們可以充分利用PVX的生物學(xué)特性，根據(jù)實(shí)際需求，將其改造成攜帶外源基因的表達(dá)載體，生產(chǎn)所需蛋白，有關(guān)這方面的研究將極具應(yīng)用前景。

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