關(guān)于無(wú)菌制劑無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證的探討

王瑩

摘 要：在現(xiàn)代質(zhì)量體系驗(yàn)證的過(guò)程中，關(guān)于檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證十分重要，這對(duì)于質(zhì)量控制的相關(guān)技術(shù)以及方法，包括手段是否具有科學(xué)性都產(chǎn)生了直接的影響，因此是質(zhì)檢體系中最為重要的組成部分，我國(guó)在相關(guān)規(guī)定中也指出，加強(qiáng)對(duì)無(wú)菌制劑的檢驗(yàn)工作，應(yīng)該采取科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法，并且如果出現(xiàn)檢驗(yàn)條件出現(xiàn)改變時(shí)，那么也應(yīng)該進(jìn)行重新檢驗(yàn)，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文重點(diǎn)對(duì)無(wú)菌制劑的檢查方法進(jìn)行介紹，并驗(yàn)證結(jié)果，希望對(duì)今后的工作有所幫助，可以進(jìn)一步提升檢驗(yàn)質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：方法驗(yàn)證；無(wú)菌制劑；無(wú)菌檢查

在檢查藥典中，無(wú)菌制劑都需要采用無(wú)菌檢查法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察是否真正呈現(xiàn)出無(wú)菌的狀態(tài)，只有通過(guò)無(wú)菌檢驗(yàn)后，才能保證無(wú)菌產(chǎn)品的出售。同時(shí)這也是無(wú)菌產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)過(guò)程中一個(gè)重要組成部分。在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中，判斷樣品是否受到污染，就需要依靠無(wú)菌檢查法才能實(shí)現(xiàn)。受到各種因素的影響，檢驗(yàn)量、培養(yǎng)基質(zhì)量以及無(wú)菌技術(shù)等都會(huì)在一定程度上影響著無(wú)菌檢查的質(zhì)量，因此需要我們更加深入的對(duì)其進(jìn)行研究，以實(shí)現(xiàn)更加科學(xué)化與高質(zhì)量的檢驗(yàn)。

1 影響無(wú)菌檢查結(jié)果的主要因素

首先，供試品的組分會(huì)對(duì)無(wú)菌檢查結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。受到供試品自身特點(diǎn)的影響，其內(nèi)部極有可能含有抑制成分，如黃連就是典型的抑制成分，又或者含防腐劑以及輔料等，都會(huì)在一定程度上對(duì)微生物產(chǎn)生抑制的作用，對(duì)微生物造成不同程度的污染，這樣一來(lái)，無(wú)菌檢查的結(jié)果就會(huì)失去準(zhǔn)確性，產(chǎn)生不同程度的損傷也是無(wú)法避免的。此外，受到不同原料產(chǎn)地的影響，加之生產(chǎn)工藝也不可能完全一致，尤其是在對(duì)中藥制劑進(jìn)行生產(chǎn)的過(guò)程中，即使是同一廠家生產(chǎn)的藥品，在不同批次中微生物的生長(zhǎng)還會(huì)具有差異性。所以說(shuō)，這些因素都會(huì)對(duì)無(wú)菌檢查結(jié)果帶來(lái)不同的影響。其次，微生物自身就具有多樣性與復(fù)雜性的特點(diǎn)。在自然界中，微生物都是以不同形態(tài)或者在不同的環(huán)境中生存下來(lái)的，所以在生長(zhǎng)過(guò)程中所受到的污染也有可能具有差異性的特點(diǎn)。當(dāng)同樣的產(chǎn)品放在不同的生產(chǎn)區(qū)域中時(shí)，微生物受到污染的形態(tài)也極有可能不同，因此，運(yùn)用同樣一種檢查方法并不能完全保證準(zhǔn)確的檢驗(yàn)出結(jié)果，從公平性上也是不公平的。所以在對(duì)無(wú)菌制劑進(jìn)行檢驗(yàn)的過(guò)程中，應(yīng)該充分考慮到微生物自身所具有的特點(diǎn)，再選取合適的檢查方式進(jìn)行檢驗(yàn)，這樣才可以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。第三，在對(duì)無(wú)菌制劑中的微生物進(jìn)行檢驗(yàn)的過(guò)程中，檢查方法是相當(dāng)重要的。其中包含以下幾個(gè)方面的內(nèi)容，一是供試液的制備方法，二是微生物的檢測(cè)方法，只有選擇了適宜的檢查方法，才能有效的實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在對(duì)微生物進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該先進(jìn)行供試液的制備，供試品具有不同的特性，所以制備的方式也不盡相同。因此在這一過(guò)程中多少會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，如果運(yùn)用同樣的供試液檢驗(yàn)微生物，那么結(jié)果可能也會(huì)有所差異，并且供試液的濃度會(huì)直接對(duì)供試品產(chǎn)生抑制性的作用，這些都是需要考慮的因素。第四，在檢驗(yàn)條件方面，微生物之所以會(huì)在檢驗(yàn)過(guò)程中受到污染，與檢驗(yàn)條件這一因素具有密不可分的關(guān)系。因?yàn)槲⑸镌谂囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)的過(guò)程中，檢驗(yàn)的目的就是要對(duì)微生物是否受到污染進(jìn)行判斷，所以檢驗(yàn)條件是直接的影響因素，例如培養(yǎng)時(shí)間的不同，亦或是培養(yǎng)基的質(zhì)量具有差異性，都會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生直接的影響，造成誤差的出現(xiàn)。另外，受到外界因素的影響，如檢驗(yàn)人員的手段不嫻熟，因?yàn)槠涫д`造成的問(wèn)題，也都會(huì)影響到檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠性。

2 對(duì)無(wú)菌制劑中微生物檢驗(yàn)方法的要求

首先，對(duì)驗(yàn)證的類型具有一定的要求。驗(yàn)證類型可以分為以下幾個(gè)部分。如前驗(yàn)證，前驗(yàn)證是在建立藥品無(wú)菌的檢驗(yàn)方法時(shí)進(jìn)行的驗(yàn)證；再驗(yàn)證，這主要是在對(duì)無(wú)菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行修訂時(shí)進(jìn)行而展開的驗(yàn)證；另外還包括定期方法驗(yàn)證，主要是當(dāng)供試品的組分出現(xiàn)改變時(shí)，如果對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，那么就需要進(jìn)行定期方法驗(yàn)證。其次，對(duì)于驗(yàn)證的主要內(nèi)容而言，主要是用于對(duì)抑制細(xì)菌、抑制真菌而進(jìn)行的驗(yàn)證試驗(yàn)，另外，在對(duì)供試品進(jìn)行處理時(shí)，也需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，上述驗(yàn)證試驗(yàn)中所采用的方法以及環(huán)境等是否符合驗(yàn)證的要求也需要經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢查后才能判定。第三，還應(yīng)該對(duì)驗(yàn)證試驗(yàn)中所產(chǎn)生的關(guān)鍵性因素進(jìn)行考量。試驗(yàn)菌中主要包含了對(duì)試驗(yàn)菌種類的選擇，對(duì)菌種的具體要求以及對(duì)試驗(yàn)菌液進(jìn)行制備，這些都是需要考慮的因素，如果想要令實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確與公正，就要保證嚴(yán)格按照上述的要求進(jìn)行驗(yàn)證，這樣才可以有效的避免出現(xiàn)問(wèn)題。

3 驗(yàn)證方法

3.1 菌種選擇

無(wú)菌檢查法的驗(yàn)證試驗(yàn)選擇了以下6株菌：金黃色葡萄萄球菌，代表革蘭陰性菌；銅綠假單胞菌或大腸埃希菌（用于抗革蘭陰性菌為主的供試品）代表革蘭陰性菌；生孢梭菌代表厭氧菌；白色念珠菌代表酵母菌；黑曲霉代表霉菌；枯草芽孢桿菌是代表藥品中常見的污染菌-芽孢桿菌。選擇的菌株都是微生物試驗(yàn)中常用的控制菌，且為標(biāo)準(zhǔn)菌株。每一試驗(yàn)菌均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，根據(jù)各菌株所代表的微生物種類進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌代表好氧細(xì)菌和厭氧菌，培養(yǎng)基采用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；而白色念珠菌和黑曲霉代表真菌，培養(yǎng)基采用改良馬丁培養(yǎng)基。

3.2 菌種要求

無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），以保證試驗(yàn)菌株的生物特性。

3.3 菌液制備

取經(jīng)30℃～45℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物、取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的生孢梭菌流體硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)物、取經(jīng)23℃～28℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物、取經(jīng)23℃～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5mL0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液分別稀釋，制成約含菌10～100cfu/mL。

3.4 供試品的取樣和處理

無(wú)菌產(chǎn)品中個(gè)成分的含量應(yīng)該是均勻的，因此只要確定在驗(yàn)證的方法中，按所需的總接種量即可，而不必強(qiáng)求按規(guī)定的容器數(shù)取樣。如果供試品需要溶解、稀釋、乳化等處理，則必須確認(rèn)這些處理對(duì)微生物無(wú)影響。

3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

薄膜過(guò)濾法的驗(yàn)證。分別做供試品組及對(duì)照組，與對(duì)照組比較供試品組微生物的生長(zhǎng)情況。沖洗次數(shù)及沖洗體積同時(shí)要在驗(yàn)證試驗(yàn)中得到確認(rèn)。直接接種法的驗(yàn)證。分別做供試品組及對(duì)照組，與對(duì)照組比較供試品組微生物的生長(zhǎng)情況。結(jié)果判斷與薄膜過(guò)濾法的驗(yàn)證相同。

4 需要注意的問(wèn)題

培養(yǎng)基的適用性檢查包括培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查和培養(yǎng)基的靈敏度檢查，驗(yàn)證試驗(yàn)的培養(yǎng)基適用性檢查必須符合要求。菌株選擇的原則為具有代表性、普遍性、易存活、在該制劑中常見的污染菌。為安全起見，試驗(yàn)菌株應(yīng)選擇同類菌種中的低或非致病性的標(biāo)準(zhǔn)菌株；另外，試驗(yàn)菌株宜選擇生物活性比較穩(wěn)定的菌株，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)室菌種的處理和保藏的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，盡可能減少菌種污染和避免生長(zhǎng)特性的改變。驗(yàn)證試驗(yàn)用的菌懸液并不是只要活的菌體就行，而是要保持旺盛的生命力，所以，菌懸液存放時(shí)間不能太長(zhǎng)。除黑曲霉孢子菌懸液外，其它試驗(yàn)菌液使用期限不超過(guò)24h，并應(yīng)置4℃冰箱保存。

結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，通過(guò)開展驗(yàn)證工作，積累了大量的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)，使無(wú)菌制劑的無(wú)菌檢查的驗(yàn)證方法已經(jīng)具有較明確的思路和方法，增加了試驗(yàn)的可操作性；尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗(yàn)證供試品本身對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，提高供試品的陽(yáng)性檢出率，使無(wú)菌檢查方法更具科學(xué)性，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為控制無(wú)菌制劑的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

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