澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠血糖及肝糖原含量的影響

崔書源，崔昊震，張默函(延邊大學醫(yī)學院，吉林延吉3300；延邊大學中醫(yī)學院)

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澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠血糖及肝糖原含量的影響

崔書源1，崔昊震2，張默函1(1延邊大學醫(yī)學院，吉林延吉133002；2延邊大學中醫(yī)學院)

摘要：目的觀察中藥澤蘭對糖尿病小鼠血糖及肝糖原含量的影響，并探討磷脂蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)/糖原合成酶(GS)通路在其中的作用機制。方法選擇40只小鼠，其中10只作為正常對照組，其余30只通過腹腔注射鏈脲佐菌素溶液制備糖尿病模型后，隨機分為模型組、高劑量組和低劑量組各10只。制備澤蘭乙醇提取物，高劑量組、低劑量組分別予澤蘭乙醇提取物5.0、1.25 g/(kg·d)灌胃，正常對照組、模型組分別予蒸餾水10 mL/kg(kg·d)灌胃，共持續(xù)5周。尾靜脈取血檢測各組血糖水平。取血后脫頸處死各組小鼠，取肝臟組織，行碘酸雪夫染色檢測肝糖原含量，高倍鏡下測定每個視野糖原顆粒面積所占百分比。采用Western blot法檢測各組肝組織中磷酸化AKT(p-Akt)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、GS蛋白的表達。結果高劑量組、低劑量組給藥后血糖水平均低于給藥前(P<0.01或0.05)。模型組肝糖原面積百分比、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表達均低于其他各組(P均<0.01)，低劑量組肝糖原面積百分比、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表達均低于高劑量組(P均<0.05)。結論澤蘭乙醇提取物可提高糖尿病小鼠肝糖原含量、降低血糖水平，其機制可能與上調AKT/GSK-3β/GS通路蛋白表達有關。

關鍵詞：澤蘭；糖尿病；肝糖原;磷脂蛋白激酶B；糖原合成酶激酶3β；糖原合成酶

澤蘭是一種常見中草藥，具有活血化瘀、行水消腫的作用，常用于糖尿病的治療[1]。肝糖原是體內糖的儲存形式之一，對于血糖水平的調節(jié)具有重要作用[2]。糖原合成酶(GS)是肝臟合成糖原過程的限速酶。磷脂蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)通路具有調控細胞糖原代謝的功能，其機制可能與調節(jié)GS的磷酸化有關[3]。2014年1月～2015年6月，我們觀察了澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠肝臟肝糖原含量及AKT/GSK-3β/GS通路蛋白的影響，探討澤蘭乙醇提取物降糖作用的分子生物學機制，為糖尿病的中藥治療提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物與試劑成年雄性昆明小鼠40只，8周齡，體質量23～25 g，由延邊大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(吉)2011-0007。澤蘭購自北京同仁堂。鏈脲佐菌素(STZ,Sigma)；兔抗小鼠p-AKT多克隆抗體(p-AKTSer473)；兔抗小鼠p-GSK-3β多克隆抗體(p-GSK-3βSer9)；兔抗小鼠GS多克隆抗體；兔抗小鼠多克隆β-actin抗體；辣根過氧化物標記IgG抗體。

1.2澤蘭乙醇提取物的制備[4]澤蘭干燥后切碎(1 cm左右)，在8倍95%乙醇中浸泡(≥12 h)，再分別用6倍、5倍95%乙醇回流提取，各次時間分別為2、1.5、1 h。合并過濾提取液，濃縮至浸膏，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3動物分組及模型制備選擇10只小鼠作為正常對照組，其余30只通過腹腔注射STZ溶液制備糖尿病模型后，隨機分為模型組、高劑量組和低劑量組各10只。模型制備方法：適應性喂養(yǎng)1周后，禁食但不禁飲水24 h，按0.12 mg/g腹腔注射STZ溶液(濃度為20 mg/mL)。常規(guī)喂養(yǎng)60 h后，禁食但不禁水12 h。尾靜脈取血，檢測空腹血糖(FPG)，以FPG≥11.1 mmol/L為糖尿病模型制備成功。

1.4干預方法高劑量組、低劑量組分別予澤蘭乙醇提取物5.0、1.25 g/(kg·d)灌胃，正常對照組、模型組分別予蒸餾水10 mL/kg(kg·d)灌胃，均為1次/d，共持續(xù)5周。實驗期間均普通飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。

1.5血糖水平檢測灌胃5周后，尾靜脈取血檢測各組小鼠血糖水平。

1.6肝糖原含量檢測各組小鼠尾靜脈取血后脫頸處死，迅速剖腹取肝臟，投入4 ℃ Carnoy液中固定12 h后，脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片。然后脫蠟水化，行碘酸雪夫染色顯示肝糖原[3]。光鏡下肝糖原呈紫紅色顆粒。染色后利用病理顯微分析系統(tǒng)進行定量分析，在×200高倍鏡下測定每個視野糖原顆粒面積所占百分比。

1.7PI3K/AKT/GSK-3β通路蛋白表達檢測采用Western blot法。取部分肝臟組織，按照小量組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，全波長分光光度計測定蛋白樣品濃度。取待測蛋白煮沸2 min，加樣40 μg/孔。10%SDS-PAGE電泳分離后，利用半干轉移法將分離膠內的蛋白轉移到PVDF膜。用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液封閉PVDF膜上的非特異性位點，分別加入兔抗小鼠p-AKT多克隆一抗(1∶400)、兔抗小鼠p-GSK-3β多克隆一抗(1∶500)、兔抗小鼠GS多克隆一抗(1∶500)，4 ℃過夜，洗滌后加入辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶1 000)，與膜室溫下孵育1 h，洗膜。圖像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以β-actin為參考，計算p-AKT、p-GSK-3β、GS蛋白的相對表達量。

2結果

2.1各組給藥前后血糖水平比較高劑量組、低劑量組給藥后血糖水平均低于給藥前(P<0.01或0.05)。正常對照組與模型組給藥前后血糖水平差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組給藥前后血糖水平比較

注：與同組給藥前比較，*P<0.01，﹟P<0.05。

2.2各組肝糖原含量比較正常對照組、模型組、高劑量組、低劑量組肝糖原面積百分比分別為42.58%±0.79%、17.46%±0.92%、39.71%±0.68%、26.16%±0.19%，模型組低于其他各組(P均<0.01)，低劑量組低于高劑量組及正常對照組(P均<0.05)。

2.3肝組織p-AKT、p-GSK-3β與GS蛋白表達比較模型組p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表達均低于其他三組(P均<0.01)，低劑量組p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表達均低于高劑量組及正常對照組(P均<0.05)。見表2、圖1。

表2　　　　各組肝組織p-AKT、p-GSK-3β

注： 與模型組比較，*P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.05。

圖1　　　　各組肝組織p-AKT、p-GSK-3β

3討論

糖尿病是一種由于胰島的功能減退和(或)機體的胰島素抵抗，而引發(fā)的機體內蛋白質、糖、脂肪等物質代謝紊亂性疾病[5]。對血糖水平的調控是防治糖尿病及其并發(fā)癥的關鍵，血糖水平調控不佳可能引發(fā)腎、眼、消化道、足、神經(jīng)等部位病變，嚴重影響生活質量[6]。

中草藥已被用于糖尿病的治療，在發(fā)揮降糖作用的同時可改善機體的功能，且有治療靶點多、作用機制多向性等特點[7]。澤蘭為雙子葉植物藥唇形科植物地瓜苗的莖葉，具有活血化瘀、行水消腫及調節(jié)機體新陳代謝的功效[8,9]。因此，在中藥治療糖尿病過程中，澤蘭常被作為大方劑的重要組成部分，但單獨研究澤蘭降糖作用及機制的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，給予澤蘭乙醇提取物灌胃后，高劑量組及低劑量組血糖水平均降低，提示澤蘭乙醇提取物能夠降低糖尿病小鼠的血糖水平，具有降糖作用。

肝糖原貯藏于肝細胞質中，是機體糖類儲存的主要形式之一，其含量的變化可影響血糖水平[10]。肝糖原的合成是有多種酶參加的復雜過程。正常狀態(tài)下，肝臟中的葡萄糖在己糖激酶和ATP的作用下先被磷酸化成6-磷酸葡萄糖，再經(jīng)1-磷酸葡萄糖而成UDP葡萄糖，在糖原合成酶的作用下生成糖原。GS是肝臟合成糖原過程的限速酶，其活性受變構和共價修飾的調節(jié)[11]。GSK-3β是一種多功能的可激活絲氨酸/蘇氨酸類蛋白的激酶，廣泛存在于真核生物細胞中，參與細胞分化、增殖、胚胎發(fā)育、細胞凋亡等多種生物學功能行為，并可磷酸化GS使其失活，參與抑制肝糖原合成過程[12]。GSK-3β是AKT的下游效應物，磷酸化后AKT被活化，進而磷酸化GSK-3β[13]。磷酸化的GSK-3β不具有生物學活性，即磷酸化的GSK-3β不能夠磷酸化GS，而保持GS在糖原合成中的作用[14]。糖尿病狀態(tài)下，由于高糖的作用，使得肝細胞中的活性氧(ROS)和糖基化終產(chǎn)物增加，抑制AKT上游PI3K的表達，進而抑制了AKT的磷酸化，減少了GSK-3β的磷酸化，從而增加了GSK-3β的活性，抑制GS的活性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肝糖原含量、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表達均低于其他各組，提示糖尿病小鼠肝糖原含量降低，肝糖原含量降低可能與p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表達下調有關，而低劑量、高劑量的澤蘭乙醇提取物均可提高糖尿病小鼠肝糖原含量，考慮澤蘭乙醇提取物可能通過上調AKT/GSK-3β/GS通路發(fā)揮提高肝糖原含量的作用，其機制可能為通過促進AKT的磷酸化，繼而磷酸化GSK-3β，使GSK-3β失活而減少了GS的磷酸化，增加了GS的相對含量，從而提高了肝糖原含量。本研究同時發(fā)現(xiàn)，高劑量組肝組織肝糖原含量、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表達均高于低劑量組，提示澤蘭乙醇提取物提高肝糖原含量及上調AKT/GSK-3β/GS通路的作用與其劑量有關，高劑量應用時的作用更明顯，表明可能具有一定的量效關系。

綜上所述，澤蘭乙醇提取物可提高糖尿病小鼠肝糖原含量、降低血糖水平，其機制可能與上調AKT/GSK-3β/GS通路蛋白表達有關。

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(收稿日期：2015-11-04)

中圖分類號：R587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0036-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.012

通信作者：張默函(E-mail: 809118439@qq.com)