棗果霉?fàn)€病病原鑒定(一)
——引起新疆棗果霉?fàn)€病的幾種曲霉菌的分離鑒定

沙娜瓦爾·色買提，玉山江·買買提，郭慶元，白劍宇

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊　830052；2．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，烏魯木齊　830091)

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棗果霉?fàn)€病病原鑒定(一)
——引起新疆棗果霉?fàn)€病的幾種曲霉菌的分離鑒定

沙娜瓦爾·色買提1，玉山江·買買提2，郭慶元1，白劍宇1

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052；2．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，烏魯木齊830091)

摘要：【目的】棗果霉?fàn)€病是棗果產(chǎn)后的重要病害，曲霉菌是棗果霉?fàn)€最重要的致病菌。目前，國內(nèi)外對引起棗果霉?fàn)€病的病原種類報道甚少。明確新疆棗果霉?fàn)€病的病原種類及優(yōu)勢致病種群，有效防控該病的發(fā)生和危害?！痉椒ā客ㄟ^廣泛采樣、組織分離和回接證病對大量病樣進行系統(tǒng)分離；對幾種致病曲霉菌進行形態(tài)鑒定、分子驗證及致病性比較?！窘Y(jié)果】曲霉屬真菌為棗果霉?fàn)€病的最主要病原；分離得到的大多數(shù)曲霉屬的單孢分離菌株對棗果具有明顯的致病性；致病的214個曲霉屬單孢菌株分屬于5個種，分別為黑曲霉、黃曲霉、赤曲霉、赭曲霉和聚多曲霉；其中黑曲霉的分離頻率最高，致病性最強?！窘Y(jié)論】引起新疆棗果霉?fàn)€病的曲霉有5種，其中黑曲霉為優(yōu)勢致病種。

關(guān)鍵詞：棗；果實霉?fàn)€病；曲霉；病原鑒定

0引 言

【研究意義】我國是世界上主要的棗生產(chǎn)國家，有幾千年的栽培歷史，擁有全世界99%以上的棗種質(zhì)資源[l]。棗果因其味甜、肉質(zhì)厚并且含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和具有較高的營養(yǎng)價值及食療功能等優(yōu)良品質(zhì)而受到消費者的喜愛，是國內(nèi)外市場知名的果產(chǎn)品[2]。近年來，在大力發(fā)展林果業(yè)的政策帶動下，新疆林果業(yè)有了突飛猛進的發(fā)展，新疆紅棗目前種植面積已達35×104hm2(525萬畝)，居全國第三位，產(chǎn)量62×104t[3]。但是，目前新疆棗制干方法仍沿用自然晾干等原始方式，因此極易受污染，出現(xiàn)酸甜失衡、營養(yǎng)價值下降等問題；在棗果儲運過程中很容易發(fā)生霉變引起棗果霉?fàn)€等貯藏期病害，最終導(dǎo)致市場價值降低[4]。在引起棗果霉?fàn)€病的致病菌中，曲霉菌是主要的病原菌之一[5]。因此，明確棗果霉?fàn)€病的病原種類及優(yōu)勢致病種群對有效防控該病的發(fā)生和危害有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】根據(jù)已有報道，棗果霉?fàn)€病在每年都有大量發(fā)生，有的年份甚至造成 90%以上的損失[5]。棗果霉?fàn)€病包括輪紋爛果病、紅粉病、軟腐病、曲霉病、青霉病和木霉病等多種[5]。根據(jù)對新疆棗干果中的霉?fàn)€果的初步觀察，曲霉菌是最常出現(xiàn)的病原。曲霉侵入棗果后，病斑表面產(chǎn)生初期灰白色、漸變?yōu)楹稚蚝谏摹按箢^針”狀霉?fàn)钗?，濕度高時果面長出霉層[5]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外對引起棗果霉?fàn)€病致病曲霉種類的相應(yīng)報道很少，對新疆棗果霉?fàn)€病病原的研究更未見報道。針對棗果霉?fàn)€病危害普遍、其病原菌種類缺少準確鑒定、防治上沒有適當(dāng)措施的現(xiàn)狀，研究擬對引起棗果霉?fàn)€病的曲霉菌進行大量分離，應(yīng)用形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合的方法對引起棗果霉?fàn)€的曲霉菌進行準確鑒定，并對多種致病曲霉進行致病性比較?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過大量的采樣和嚴格的分離鑒定，明確由曲霉引起的棗果霉?fàn)€病(即曲霉病)的致病菌種類和優(yōu)勢致病種群，為該病的有效防控提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1 棗果品種

2014至2015年，先后于阿克蘇地區(qū)(市郊、阿瓦提縣、沙雅縣)，和田地區(qū)(皮山縣、策勒縣、于田縣、洛浦縣)，喀什地區(qū)(沙車縣)等主要棗產(chǎn)區(qū)及烏魯木齊華凌干果批發(fā)市場和烏魯木齊東環(huán)路干果批發(fā)市場收集病果，從中挑選典型病果進行分離。用于分離的主要棗果品種有駿棗、灰棗和哈密大棗等。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，用水定容至1 L。

查氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek)：蔗糖30 g，NaNO31 g，K2HPO41 g，KCI 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g,瓊脂15～20 g，用水定容至1 L，pH 自然。

水瓊脂培養(yǎng)基(WA)：瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2方 法

1.2.1病原菌的分離

采用組織分離法：將新鮮病果表面清洗干凈，用70%酒精棉球擦拭棗果表面，用解剖刀削去大部分病部組織，用鑷子夾取病健交界處果肉置于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

保濕誘發(fā)分離法：選取典型病果，置入加濾紙的保濕培養(yǎng)皿內(nèi)，待菌落長出后，從菌落上選擇較為單純的曲霉菌轉(zhuǎn)接到查氏平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d后檢查菌落。

1.2.2 病原真菌的純化、回接及形態(tài)鑒定

對各分離物采用單胞分離法進行純化，將病原菌培養(yǎng)5 d后，用接種環(huán)刮取少量孢子，置于100 μL滅菌水中，用接種環(huán)蘸取少量孢子液后在WA平板培養(yǎng)基上劃線，待萌發(fā)形成菌落后自較末端劃線上挑取最小的單一菌落進行培養(yǎng)；上述操作重復(fù)三次，以得到真正的單孢菌株。將獲得的單孢菌株保存在PDA 斜面上[6]。

完成所有分離物的單孢分離后，采用離體果針刺接種法將各菌株接種到新鮮、成熟、健康、無傷的紅棗果實上，觀察其致病與否，由此篩選致病菌株。

將各致病菌株分別接種到查氏平板培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后進行體視顯微觀察及制作切片鏡檢，觀察描述其產(chǎn)孢方式及分生孢子梗、產(chǎn)孢細胞和分生孢子的形態(tài)特征，結(jié)合培養(yǎng)特性，作為鑒定菌種依據(jù)。參照《真菌鑒定手冊》[7]及《中國真菌志》曲霉屬分冊[8]，主要以Raper和Fennell(1965)的系統(tǒng)為依據(jù)對各致病菌株進行形態(tài)鑒定。

1.2.3病原菌分子鑒定1.2.3.1基因組DNA的提取

采用液體靜置培養(yǎng)方法收集菌絲體，用液氮充分研磨菌至干粉后裝入1.5 mL離心管中，參照試劑盒使用說明,用真菌 DNA 提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取。

1.2.3.2rDNA-ITS的擴增與測序

引物：上游引物ITS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)

下游引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)

PCR擴增25 μL的反應(yīng)體系，包括Taq(1U/μL) 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+Plus 2.5 μL，dNTP Mixture 3 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，模板DNA 各2 μL，ddH2O 13 μL。

PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃3 min；變性，95℃1 min，退火52℃40 s，延伸72℃2 min，35個循環(huán)；補平72℃10 min。

擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，在1×TAE電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測并記錄擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的圖譜。用PCR產(chǎn)物切膠、PMD18-T載體純化和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化方法將擴增產(chǎn)物純化后送博士德生物公司測序部進行測序。

1.2.3.3BLAST比對與同源性分析

將測得的菌株序列在GenBank中進行BLAST比對，根據(jù)待測菌株與已知種的同源性驗證形態(tài)鑒定結(jié)果。

1.2.4病原菌的致病性比較

為比較各種曲霉菌在鮮果和干果上的致病力大小，致病性實驗采用鮮果接種和干果接種兩種方法。

1.2.4.1鮮果接種

采集白熟期新鮮健康棗果，用浸泡在70%酒精中的棉球?qū)椆砻嫦?，無菌水沖洗3次，晾干后切成果片并置于保濕培養(yǎng)皿內(nèi)；將各單孢菌株制成直徑4 mm的菌餅作為接種體，貼于棗果片切面上，每果片接種3個位點；每個單孢菌株接種3個果片(三次重復(fù))并置于同一保濕皿中；以果片上放無菌的PDA培養(yǎng)基餅作為對照。接種后在25℃溫箱中保濕培養(yǎng)，每天觀察記錄果實發(fā)病情況，10 d后分別統(tǒng)計發(fā)病率。

1.2.4.2干果接種

選健康干果，用70%酒精棉球作表面消毒后，用無菌水浸泡吸脹，晾干后切成果片并置于保濕培養(yǎng)皿內(nèi)；用與鮮果相同的接種和培養(yǎng)方法觀察記錄果實發(fā)病情況。

2結(jié)果與分析

2.1自然發(fā)病棗果的典型癥狀

該類型病果主要為害近儲藏期的果實，一般在采后晾曬期(10月中、下旬)大量發(fā)生。曲霉菌侵入棗果后，受害部位引起病果變軟果肉變呈淡褐色至褐色腐爛；病斑表面產(chǎn)生灰白色、黑色、綠色的“大頭針”狀霉?fàn)钗?，即病原菌的分生孢子梗及分生孢子，腐爛果實有霉酸味。

2.2棗果霉?fàn)€病病原菌分離結(jié)果

通過組織分離法，從60個典型病果，約300個組織塊上分離獲得175個曲霉屬(Aspergillusspp.)分離物；通過保濕分離，從15個典型病果上獲得44個曲霉屬分離物；合計從75個病果上分離到219個曲毒屬分離物，經(jīng)單孢分離得到657個單孢菌株(3個/每分離物)；從219個分離物中各選一個單孢菌株進行回接，篩選出214個致病的單孢菌株。這些致病菌株均能侵染棗果，引起果實表面或內(nèi)部發(fā)病,長出褐色或黑色霉層,最后導(dǎo)致爛果，并從發(fā)病果實上可重新看得到與所接菌株相同的培養(yǎng)性狀,說明分離得到的病原菌是引起棗果霉?fàn)€病的致病菌。表1

2.3 曲霉種的形態(tài)鑒定

將來自214個分離物的214個致病單孢菌株，通過對各單孢菌株在查氏培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形狀及孢子和產(chǎn)孢細胞的形態(tài)、大小等特征觀察，鑒定出214個曲霉屬菌株分屬于5個種，分別為黑曲霉(A.nigerTiegh)、黃曲霉(A.flatusLink)、赤曲霉(A.ruberSamon & Gams)、赭曲霉(A.ochraceusWilh)和聚多曲霉(A.sydowiiThom&Church)；黑曲霉的出現(xiàn)頻率最高，為74.76%，黃曲霉次之，為17.29%，其余三種曲霉的出現(xiàn)頻率分別為3.37%、2.34%和1.87%。此外，從兩種分離方法得到的結(jié)果來看，經(jīng)組織分離法得到的曲霉菌菌株多，而經(jīng)保濕分離法得到的曲霉菌菌株數(shù)較少；但從組織分離法得到的171個菌株中，只鑒定出黑曲霉、黃曲霉和赤曲霉三種，且以黑曲霉的菌株占約大多數(shù)，而保濕分離得到的39個菌株中鑒定出了上述所有5個種，仍以黑曲霉的菌株為多。多項分離結(jié)果均顯示，黑曲霉在所有曲霉中菌株出現(xiàn)頻率最高，為棗果霉?fàn)€病的優(yōu)勢病原菌種。表1

2.4各致病曲霉菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

2.4.1黑曲霉Aniger

菌落在查氏培養(yǎng)基上生長迅速，25℃，培養(yǎng)7d后，直徑為40 ～ 60 mm；菌落中心稍凸起，有規(guī)則的輻射狀溝紋；質(zhì)地絲絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，表面呈暗褐黑色至炭黑色；菌落反面呈黃褐色。分生孢子頭初為球形至輻射形，直徑150 ～ 450 μm；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，孢梗莖，(800)950 ～ 2 700(4 000)μm×10 ～ 20 μm，壁平滑；頂囊球形，直徑(30)40 ～ 75(80)μm，全部表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層：梗基，(10)15 ～ 35(70)μm×(3)3.5 ～ 12(14) μm；瓶梗，(7)8 ～ 11(12)μm×(2)2.5 ～ 3 μm；分生孢子近球形，直徑3 ～ 5.4 μm，壁明顯粗糙。

2.4.2黃曲霉A.flavus

菌落在查氏培養(yǎng)基上生長迅速，25℃，培養(yǎng)7d后，直徑36 ～ 52 mm；質(zhì)地主要為致密絲絨狀，中央部分呈絮狀，平坦；分生孢子結(jié)構(gòu)多，顏色為黃綠至草綠色，初期較淡，老后稍深；菌落反面淡褐色；分生孢子頭初為球形，后呈輻射形，直徑(80)125 ～ 500(800)μm；分生孢子梗大多生自基質(zhì)，孢梗莖，(200)400 ～ 1 000(3 000)μm×(4)8 ～15(20)μm，壁厚，無色，粗糙；頂囊近球形至燒瓶狀，直徑(9)22.5 ～ 48(65)μm，大部表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層：?；?6.2)7 ～ 11(19)μm×(3.2)4 ～ 6 μm；瓶梗(6.2)8.5 ～ 10(12) μm×(2.4)3 ～ 3.5(4) μm；分生孢子多為球形，(2.4)3.6 ～ 4.8(6.4)μm，壁稍粗糙。

2.4.3赭曲霉A.ochraceus

菌落在查氏培養(yǎng)基上，25℃ ，培養(yǎng)7 d后，直徑為(25)28 ～ 30(35) mm ，10 ～ 14天后直徑35 ～ 53(55) mm；質(zhì)地絲絨狀，平坦；分生孢子結(jié)構(gòu)較稀疏，黃赭色；菌絲體白色；菌落反面為紫褐色；分生孢子頭初為球形(75)90 ～ 200 μm，老后可達350 ～ 500 μm；分生孢子梗生自基質(zhì)，孢梗莖一般(500)900 ～ 1 250(1 500) μm×(6)7 ～ 15 μm，壁厚(0.7)0.8 ～ 1.5 μm，粗糙；頂囊球形或近球形，直徑(20)25 ～ 45(55)μm，全部表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層：?；?7)14 ～ 25 μm×(2.5)3 ～ 6 μm；瓶梗7 ～ 12(13) μm×1.5 ～ 2.5(3) μm；分生孢子多球形或近球形，(2)2.5 ～ 3.5(4)μm，壁近于光滑。

注：A，B，C，D，E分別代表黑曲霉、黃曲霉、赭曲霉、聚多曲霉、赤曲霉。1，2，3分別代表5種曲霉菌的分生孢子穗、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)

Note：A，B，C，D，E respectively representA.niger，A.flatus，A.ochraceus，A.sydowii，A.sydowii；1，2，3 respectively represent the conidial head，conidiophores and conidia of 5 species ofAspergillus

圖1五種曲霉菌的主要形態(tài)
Fig.1The main morphological characteristics of 5 species ofAspergillus
表1214個曲霉屬菌株所屬的種及其出現(xiàn)頻率
Table 1Frequence of 214Aspergillusspp

代表菌株Representativestrain相同特征菌株數(shù)Numberofequalcharacteristicstrains出現(xiàn)頻率Occurrencefrequency(%)組織分離Tissueisolation(個)保濕分離Moisturizeisolation(個)組織分離Tissueisolation(%)保濕分離Moisturizeisolation(%)合計Total(%)鑒定結(jié)果IdentificationresultYTML1406-3-1HTML1406-4-2HMML1406-6-11431766.827.9474.76黑曲霉HMML1406-1-1HTML1406-14-1-2RQML1406-12-1-528913.084.2017.29黃曲霉HTML1406-9-1-2HTGS1406-8-6YTGS1406-3-3441.871.873.73赤曲霉HTGS1406-2-1-1YTGS1406-4-1-2HTGS1406-14-2050.002.342.34赭曲霉CLRF1406-5-1HTGS1406-14-2YTGS1406-3-1040.001.871.87聚多曲霉

2.4.4聚多曲霉A.sydowii

菌落在查氏培養(yǎng)基上，25℃ ，培養(yǎng)7 d后，直徑為25 mm左右；質(zhì)地為絲絨狀；顏色呈不同程度的灰藍色至暗藍色；菌落反面呈淡褐色。分生孢子頭球形至輻射狀，直徑達(52)62.5 ～ 87.5(125)μm；分生孢子梗生于基質(zhì)，孢梗莖長度為110 ～ 200(500) μm×3.5 ～ 7(8) μm，壁光滑，較厚；頂囊較小，近球形，直徑為(8)10 ～ 20 μm，全部表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層：?；话?4.2)6 ～ 9(10.4) μm×(2)3～ 3.5(4) μm；瓶梗(4.2)5 ～ 9(10) μm×2 ～ 3 μm；分生孢子球形，直徑2.5 ～ 3.5(5)μm，壁明顯粗糙，具小刺。

2.4.5赤曲霉(A.ruber,有性型：赤散囊菌E.rubrum)

菌落在查氏培養(yǎng)基上生長緩慢，25℃，12 d直徑5 ～ 12 mm；平坦；分生孢子較少，灰綠色；分生孢子頭球形，直徑100 ～ 250 μm；分生孢子梗莖150 ～ 300 μm×8 ～ 15 μm，壁光滑；頂囊燒瓶形，直徑17 ～ 40 μm，大部分表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層：瓶梗6 ～ 12.5 μm×3 ～ 5 μm；分生孢子球形5 ～ 6 μm。閉囊殼較多，黃色；菌落反面黃褐色。閉囊殼球形，(70)88 ～ 180(200) μm；子囊近球形，9 ～ 19(22) μm；子囊孢子雙凸鏡形，5 ～ 6.5 μm×4 ～ 5(5.6) μm。

2.5致病菌 rDNA- ITS 序列分析

從幾種曲霉菌中各選一個致病的單孢菌株，以各菌株的 DNA 作為模板，用通用引物擴增，得到約 600 bp 左右的 rDNA- ITS 序列。

將上述擴增產(chǎn)物測序后，將各自的 rDNA- ITS 序列在GenBank 中分別與已有的一些曲霉菌序列進行比對分析，結(jié)果表明所測病原菌分屬于半知菌類曲霉屬中的5個種。經(jīng)形態(tài)鑒定的各種曲霉菌與GenBank 中登錄的同種曲霉菌的rDNA- ITS序列同源性比對結(jié)果表明：黑曲霉菌株(HTML1406-4-2)的ITS序列與A.niger(KF031027，JQ867382，KR149643等)多個菌株的ITS序列同源性均達100%；黃曲霉菌株(HMML1406-1-1)的ITS 序列與A.flatus(GU172440，LN482520，KP329664等)多個菌株的ITS序列同源性均達99%；赤曲霉菌株(HTGS1406-8-6)的ITS 序列與A.ruber(NR131286，AY37389，HE801343)等多個菌株的ITS序列同源性均達100%；赭曲霉菌株(YTGS1406-4-1-2)的ITS 序列與A.ochraceus(NR077150，F(xiàn)R329836，EF661419等)多個菌株的ITS序列同源性高達99%～100%；聚多曲霉菌株(CLRF1406-5-1)的ITS 序列與A.sydowii(JX518253，KP329836，KP329835等)多個菌株的ITS序列同源性高達100%。其分析結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致，再次證明，引起新疆棗果霉?fàn)€病的曲霉菌確為上述5種。圖2

注：M：DNA marker DL2000；1：黑曲霉(HTML1406-4-2)；2：黃曲霉(HMML1406-1-1)；3：赤曲霉(HTGS1406-8-6)；

4：赭曲霉(YTGS1406-4-1-2)；5：聚多曲霉(CLRF1406-5-1).

Note：M：DNA marker DL2000；1：A.niger(HTML1406-4-2)；2：A.flatus(HMML1406-1-1)；3：A.ruber(HTGS1406-8-6)；4：A.ochraceus(YTGS1406-4-1-2)；5：A.sydowii(CLRF1406-5-1)．

圖2五種曲霉的單孢菌株的rDNA ITS-PCR產(chǎn)物
Fig.2rDNA ITS-PCR products of single spore isolates of 5 species Aspergillus

2.6 五種曲霉菌的致病性比較

研究表明，5種曲霉菌對棗果的致病力存在明顯的差異，同一種曲霉菌對鮮果和干果的致病力亦有較大差異。黑曲霉、黃曲霉和赭曲霉對棗鮮果致病能力最強(接種發(fā)病率為100%～ 96.29%)，其中黑曲霉對干果的致病力最強(接種發(fā)病率為55.55%)，而黃曲霉的最弱(接種發(fā)病率為7.41%)；聚多曲霉對棗鮮果和干果的致病能力均最弱(接種發(fā)病率為鮮果70.36%，干果7.41%)；赤曲霉對棗鮮果和干果致病能力較強(接種發(fā)病率為鮮果88.88%，干果51.84%)；同時，同一種曲霉菌的不同菌株間的致病力亦有明顯差異。表2

表2五種曲霉菌對棗鮮果及棗干果的致病性比較
Table 2 The comparison of pathogenicity test ofAspergillusfungus to jujube fresh fruit and dried fruit

病原名稱Nameofpathogeny菌株編號Strainnumbers新鮮果接種 Freshfruit干果接種 Driedfruit發(fā)病率Incidencerate(%)種間平均發(fā)病率Averageincidencerateofspecies(%)發(fā)病率Incidencerate(%)種間平均發(fā)病率Averageincidencerateofspecies(%)黑曲霉YTML1406-3-1100.00100.0033.3355.55A.nigerHTML1406-4-2100.0033.33HMML1406-6-1100.00100.00黃曲霉HMML1406-1-1100.00100.000.007.41A.flavusHTML1406-14-1-2100.0011.11RQML1406-12-1-5100.0011.11赤曲霉HTML1406-9-1-2100.0088.8877.7751.84A.ruberHTGS1406-8-677.7766.66YTGS1406-3-388.8811.11赭曲霉HTGS1406-2-1-1100.0096.2922.2211.11A.ochraceusYTGS1406-4-1-2100.0011.11HTGS1406-14-288.880.00聚多曲霉CLRF1406-5-1100.0070.3622.227.41A.sydowiiHTGS1406-14-244.440.00YTGS1406-3-166.660.00CK0.000.000.000.00

3討 論

3.1棗果在貯藏期由于病原菌的侵染而導(dǎo)致的霉?fàn)€變質(zhì)，大大降低了棗果的市場價值。因此，對棗果霉?fàn)€病進行病原菌的分離與鑒定，明確其致病菌種類，進而了解其生物學(xué)特性，研究其控制方法，對今后棗果的貯藏保鮮具有重要意義。

3.2對棗果霉?fàn)€病病原菌的分離頻率及致病性分析結(jié)果初步表明，曲霉屬真菌是引起棗果霉?fàn)€的主要病原菌；在研究中鑒定出的5種曲霉菌中，黑曲霉為優(yōu)勢菌種，其分離頻率最高，致病性也很強；同時黑曲霉和赤曲霉為5種曲霉菌中致病性最強的種，對鮮果和干果的致病率均很高；但需要說明的是，由于每種曲霉菌僅選用了3個代表菌株，且菌株間的致病性差異很大，因而5種曲霉菌的致病性比較會在一定程度上受到菌株選擇的影響，為更準確的得出該5種曲霉菌在對棗果的致病性差異上的結(jié)果，需要進一步選擇更多的菌株并設(shè)置更多的重復(fù)進行比較。

3.3曲霉在不同的培養(yǎng)基上的菌落外觀及顏色均有差異，因此研究中均統(tǒng)一在查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)。通過在一致條件下培養(yǎng)的培養(yǎng)性狀即可大體區(qū)分為黑色組、黃綠組、煙色組等不同組；為準確鑒定，還要參考前人研究的培養(yǎng)條件，盡量與其保持一致，只有這樣才更有可比性[9]。

3.4魏天軍，魏象廷在“中國棗果實病害研究進展”中介紹了棗曲霉病的病原為黑曲霉。研究中通過組織分離和保濕分離，鑒定出5種曲霉對棗鮮果和干果具有致病性(或稱致霉性)，同時得到黑曲霉為優(yōu)勢致病種的結(jié)果。兩者有較好的一致性。除黑曲霉外，研究中還鑒定出黃曲霉、赤曲霉、赭曲霉等4種曲霉對棗果具有致病性。這一差異可能與地域不同，采樣的多少及分布有關(guān)，也與研究中采用了保濕分離法有關(guān)，在保濕分離過程中可能使一些并非造成果實最初感染而是在保濕環(huán)境中次生感染的，同時又具有一定致病性的曲霉菌成為鑒定結(jié)果的一部分。一般而言，嚴格的組織分離能更好地得到初始感染或真實感染到組織中病原菌，而保濕分離能簡單地得到更多種類的分離物及致病菌。由于棗果采后制干、貯運環(huán)境復(fù)雜，接觸各種致病菌的可能性很大，因此，研究中兩種分離方法并用，能更大范圍地分析棗果上的致病菌及可能的致病菌。如果研究中的組織分離方法足夠嚴格和無疏漏的話，可以認為組織分離的結(jié)果體現(xiàn)了初始感染或真實感染到組織中病原菌，即黑曲霉、黃曲霉和赤曲霉為引起棗果霉?fàn)€病的真正的致病菌種，而僅在保濕分離中出現(xiàn)的赭曲霉和聚多曲霉為分離環(huán)境中存在的可致病菌種。這一推論結(jié)果有待通過分子檢測方法對大量樣果的實際檢測來證實。

4結(jié) 論

引起新疆棗果霉?fàn)€病的曲霉菌有黑曲霉、黃曲霉、赤曲霉、赭曲霉和聚多曲霉5種。其中黑曲霉的分離頻率最高，致病性最強，是曲霉菌中的優(yōu)勢菌種。

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Identification of the Pathogen Causing Jujube Fruit Mildew (Part I)-Isolation and Identification ofAspergillusfungusCausing Jujube Fruit Mildew

Shanawaer Semaiti1，Yushanjiang Maimaiti2，GUO Qing-yuan1，BAI Jian-yu1

(1．CollegeofAgronomy，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052China；2．ResearchInstituteofPlantProtection，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091China；)

Abstract：【Objective】 The Jujube fruit mildew is the major disease of postharvest jujube fruits，and Aspergillus fungus is the most important pathogenic fungus of jujube fruits mildew．At present，there is no substantial report within or outside the country about the pathogen species causing jujube fruits mildew．Clarifying pathogen species and advantaged species of jujube fruits mildew in Xinjiang is significantly important to control the occurrence and damage of this diseases．【Method】Widely sampling，tissue isolation and tie-back method were used in systematic isolation for large number of disease samples．At the same time，morphological analysis，molecular analysis and pathogenicity comparison were used for identification of some pathogenic Aspergillus fungus．【Result】The isolation results showed that Aspergillus spp. fungus is the major pathogen which causes jujube fruits mildew．Separation with the majority single spore isolates of Aspergillus spp. have got pathogenicity to jujube fruit． 214 single spore isolates of Aspergillus spp. which have pathogenicity belong to 5 species，they are A. niger，A. flatus，A. rubrum，A. ochraceus and A. sydowii，among which, A. niger had the highest isolate rate and the strongest pathogenicity.【Conclusion】There are 5 species of Aspergillus that cuase jujube fruits mildew in Xinjiang，among which, the advantaged pathogenetic species is A. niger.

Key words:jujube；fruits mildew；Aspergillus；pathogen identification

中圖分類號：S436.65

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)03-0502-08

作者簡介:沙娜瓦爾·色買提(1990-)，女，新疆和田人，碩士研究生，研究方向為植物病理學(xué)，(E-mail)senever352@163.com通訊作者:郭慶元(1962-)，男，四川人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為植物病理學(xué)，(E-mail)guoqingyuan3009@sina.com

基金項目:新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目“新疆特色果樹高效安全生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究集成與示范”(201130102)

收稿日期：2015-11-13

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.016

Fund project:Supported by science and technology planning projects of Xinjiang Uygur Autonomous Region "integration and demonstration of the key technology of high efficiency and safety production of Xinjiang featured fruit tress" (201130102)