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    制川貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

    2016-05-12 07:18:42林莉劉奇
    中藥與臨床 2016年6期
    關(guān)鍵詞:川貝母貝母三氯甲烷

    林莉,劉奇

    ·品種品質(zhì)·

    制川貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

    林莉1,劉奇2

    目的:建立制川貝母的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法:參照2010年版《中國藥典》川貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)方法,建立制川貝母顯微鑒別、薄層鑒別、水分測定、總灰分測定、浸出物測定,以西貝母堿為指標(biāo)的總生物堿含量項(xiàng)目的檢查方法并規(guī)定限度,采用HPLC法建立制川貝母中貝母辛含量測定方法并擬定含量限度,以此對制川貝母進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。結(jié)果:川貝母炮制前后顯微鑒別特征變化不大,薄層鑒別顯示炮制品和生品提取物沒有太大差別,制川貝母的水分不應(yīng)超過13.0%,總灰分不得超過1.60%,浸出物不得少于25.0 %,總生物堿含量以西貝母堿計(jì)不得少于0.04%,貝母辛含量不得少于0.02%。結(jié)論:本研究可為制川貝母的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

    制川貝母;總生物堿;貝母辛;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

    川貝母系川產(chǎn)道地貴細(xì)藥材,主產(chǎn)于四川、云南、西藏、青海、陜西等地區(qū),貝母屬植物約有130種,我國約有30余種[1~2]。據(jù)《中國藥典》2010 版一部中川貝母收載有六種基源種,為百合科植物川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂貝母Fritillaria delavayi Franch.、太白貝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var. wabuensis (S. Y. Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen的干燥鱗莖。性苦、甘、微寒,歸肺、心經(jīng)。主治肺熱燥咳,干咳少痰,陰虛勞嗽,咯痰帶血,瘰疬、乳癰、肺癰[3],現(xiàn)代藥理研究表明,貝母還具有抗菌、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗?jié)?、抗腫瘤等多種功效[4]。川貝母主要含生物堿、多糖、皂苷等成分,其中生物堿是川貝母的主要活性成分[5~7],《中國藥典》2010 版一部中川貝母六種基源種之間生物堿成分差別較大,其中西貝母堿、貝母辛、貝母素甲、貝母素乙是六中基源種共有成分[8]。

    川貝母現(xiàn)已被制成中藥方劑或中成藥制劑,如蛇膽川貝露、川貝枇杷露等,可增強(qiáng)治療疾病的效果,主要用于急性氣管炎、支氣管炎、肺結(jié)核等病癥。本文研究的制川貝母是采用蜂蜜和雪梨汁、川貝母所制[9],為保證制川貝母的用藥安全,保證臨床療效,必須建立嚴(yán)格規(guī)范的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究按照《中國藥典》2010 版一部川貝母項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn),并新增了貝母辛的含量測定,對制川貝母質(zhì)量進(jìn)行了研究,以期為其質(zhì)量評價和控制提供相關(guān)依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    DM2500光學(xué)顯微鏡(德國徠卡Leica儀器有限公司);CPA225D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);A580型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(翱藝儀器上海有限公司)、LC-20AT島津高效液相色譜儀(日本島津科技有限公司)、RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)、DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)

    1.2 試藥

    制川貝母由四川藏域川貝生物研究中心有限公司提供[9](批號:140603、140605、140608、140610、140615、140622、140701、140702、140706、140711、140725、140801);川貝母對照藥材,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬云桐教授鑒定為百合科暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia的干燥鱗莖,符合《中國藥典》2010版一部川貝母項(xiàng)下各項(xiàng)規(guī)定。貝母素乙對照品,購自中國食品藥品檢定研究院(Peiminine ,批號:110751-201110 ID:4D1S-ZK7Y 供含量測定用,含量99.9%);西貝母堿對照品,購于中國食品藥品檢定研究院(Sipeimine,批號:110767-201208 ID:R3WR-Q508,供含量測定用,含量99.1%);貝母辛對照品,購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司(Peimisine,批號:131202,含量≥98%);乙腈(色譜純,美國Fisher公司)、三氯甲烷(四川西隴化工有限公司)、氨水(分析純,成都市科龍化工試劑廠)、甲醇(分析純,成都市科龍化工試劑廠)、溴甲酚綠、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀(試劑均購自成都市科龍化工儀器廠)

    2 方法與結(jié)果

    2.1 顯微鑒別

    取供試品(批號:140605)粉末過四號篩,挑取少許置載玻片上,滴加水合氯醛試液1-2滴,在酒精燈上加熱透化,并滴加稀甘油,蓋上蓋玻片,置顯微鏡下觀察。見圖1,結(jié)果顯示,制川貝淀粉粒甚多,廣卵形、長圓形或不規(guī)則圓形,有的邊緣不平整略作分枝狀,臍點(diǎn)短縫狀、點(diǎn)狀、人字狀或馬蹄狀,層紋隱約可見,未見表皮細(xì)胞及螺紋導(dǎo)管。

    圖1 制川貝顯微圖

    2.2 薄層鑒別

    取供試品(批號:140605)粉末10.0 g,加濃氨試液10 mL,密塞,浸泡1 h,加二氯甲烷40 mL,超聲處理1 h,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解,作為供試品溶液。取川貝母對照藥材粉末10.0 g,加濃氨試液10 mL,密塞,浸泡1 h,加二氯甲烷40 mL,超聲處理1 h,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解,作為對照藥材溶液溶液;另取貝母素乙對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄附錄VI B)試驗(yàn),吸取對照品溶液2 μL,供試品溶液6 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液-水(18∶2∶1∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干;依次噴以稀碘化鉍鉀和亞硝酸鈉乙醇試液。如圖2,供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色斑點(diǎn),即制川貝能檢出貝母素乙,故收入標(biāo)準(zhǔn)正文。見圖2。

    1 貝母素乙對照,2 川貝母對照藥材,3 供試品圖2 制川貝薄層色譜圖

    2.3 水分測定

    制川貝母水分按照《中國藥典》2010 版(附錄IX H 第一法)進(jìn)行測定,結(jié)果見表1.根據(jù)測定結(jié)果制川貝母水分含量為7.7924%~9.8264%,平均為9.16%,并規(guī)定本制川貝母水分不得超過13.0%。

    2.4 總灰分測定

    制川貝母總灰分按照《中國藥典》2010 版(附錄IX K)進(jìn)行測定,結(jié)果見表1。根據(jù)測定結(jié)果,制川貝母總灰分為1.22%~1.46%,平均為1.32%,并規(guī)定本制川貝母總灰分不得超過1.60%。

    2.5 浸出物測定

    制川貝母浸出物照醇溶性浸出物測定法《中國藥典》2010 版(附錄X A)項(xiàng)下的熱浸法測定,結(jié)果見表1。根據(jù)測定結(jié)果,制川貝母浸出物測定結(jié)果為23.83%~33.44%,平均為30.86%,并規(guī)定本制川貝母浸出物不少于25.0%。

    表1 制川貝母水分、總灰分、浸出物測定結(jié)果(n=3)

    2.6 西貝母堿含量測定[10]

    2.6.1 對照品溶液的制備 取西貝母堿對照品1.95 mg,精密稱定,加三氯甲烷制成0.195 mg·mL-1的溶液。

    2.6.2 供試品溶液的制備 取制川貝粉末(過三號篩)約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加濃氨試液3 mL,浸潤1小時。加三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液40 mL,置80 ℃水浴加熱回流2小時,放冷,濾過,濾液置50 mL量瓶中,用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2~3次,洗液并入同一量瓶中,加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液至刻度,搖勻。精密量取4 mL置25 mL具塞試管中,水浴上蒸干,精密加入三氯甲烷10 mL使溶解,精密加水5 mL,再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液(取溴甲酚綠0.05 g,用0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液6 mL使溶解,加磷酸二氫鉀1 g,加水使溶解并稀釋至100 mL,即得)2 mL,密塞,劇烈振搖,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,放置30分鐘。取三氯甲烷液,用干燥濾紙濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

    2.6.3 測定波長的選擇 吸取西貝母堿對照品溶液0.6 mL,補(bǔ)加三氯甲烷至10.0 mL,照“2.6.2”項(xiàng)下,自“精密加水5 mL”起依法制備,置于紫外可見分光光度計(jì)下,以相應(yīng)的試劑為空白,在330~600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,測得最大波長為415 nm。

    2.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取西貝母堿對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL,置25 mL具塞試管中,精密加入三氯甲烷10 mL使溶解,自“精密加水5 mL”起依法制備供試品溶液,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可見分光光度法(附錄V A),在415 nm波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)x,吸光度為縱坐標(biāo)y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=1.811x-0.004,R2=0.9997(n=6),結(jié)果表明西貝母堿質(zhì)量濃度在0.0209~0.4187 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.6.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.6.1”項(xiàng)下西貝母堿對照品溶液0.6 mL,按“2.6.4”項(xiàng)操作,平行測定吸光度值6次,其RSD(n=6)為1.55%,結(jié)果表明,本方法精密度較好。

    2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定供試品(批號:140605)6份,每份2 g,按“2.6.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,以相應(yīng)的試劑為空白,在415 nm處測定吸光度,其RSD (n=6)為2.0 %,結(jié)果表明,本方法重復(fù)性較好。

    2.6.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定供試品(批號:140605)

    2 g,按“2.6.2”下方法制成供試品溶液,以相應(yīng)的試劑為空白,在時間間隔為0、15、30、45、60、75、90 min時在415 nm處測定吸光度,RSD為0.91%,結(jié)果表明在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.6.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定已知量的供試品(批號:140605)6份,約1 g,置25 mL具塞錐形瓶中,分別加入0.195 mg·mL-1的西貝母堿對照品溶液2.5 mL,按“2.6.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,在415 nm處測定吸光度,計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,由表2可知平均回收率為98.49%,RSD為2.01%,表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

    表2 制貝母中西貝母堿回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

    2.6.9 制川貝母中西貝母堿含量測定

    將10批樣品按“2.6.2”項(xiàng)下制成供試品溶液,平行制備3份,在415 nm處測定其吸光度,根據(jù)“2.6.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,測定西貝母堿含量,結(jié)果見表3。并規(guī)定,本品按干燥品計(jì)算,含總生物堿以西貝母堿(C27H43NO3)計(jì),不得少于0.040%。

    表3 制川貝母中西貝母堿含量測定試驗(yàn)結(jié)果(n=12)

    2.7 貝母辛含量測定

    2.7.1 對照品溶液的制備 精密稱取貝母辛對照品9.61 mg,置5 mL容量瓶中,加甲醇制成1.922 mg·mL-1的對照品儲備液。再精密吸取對照品儲備液溶液0.625 mL,加甲醇稀釋成10 mL,即得對照品溶液。

    2.7.2 供試品溶液的制備 取供試品5.0 g,置于250 mL圓底燒瓶中,加濃氨水10 mL,浸潤2 h,加入三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液150 mL,混勻,置70 ℃水浴加熱回流3 h,放冷,濾過,用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2~3次,合并濾液與洗液置于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL容量瓶中,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,即得。2.7.3 色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB- C18(5 μm×4.6 mm×250 mm)色譜柱;流動相為乙腈-0.02%三乙胺水溶液(30∶70),等度洗脫;檢測波長為205 nm;流速為1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量10 μL;柱溫箱30 ℃。取空白溶劑、2.7.1項(xiàng)下對照品溶液、2.72項(xiàng)下供試品溶液,按以上色譜條件進(jìn)行測定,見圖1,結(jié)果顯示貝母辛峰型良好,且色譜峰附近不存在干擾物質(zhì)。

    圖3 貝母辛對照品(A)及制貝母樣品(B)色譜行為/1. 貝母辛

    2.7.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.7.1”項(xiàng)下對照品儲備液適量,依次稀釋成1、2、4、8、16、32、64、128倍,按“2.7.3”項(xiàng)下色譜條件測定,以貝母辛峰面積為縱坐標(biāo)y,貝母辛濃度為橫坐標(biāo)x,得回歸方程y=1E+07x-5947.8,R2=0.9982(n=8)。結(jié)果表明貝母辛質(zhì)量濃度在0.015~1.922 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.7.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取貝母辛對照品溶液10 μL,按“2.7.3”項(xiàng)下色譜條件測定,連續(xù)進(jìn)樣6次,測得的貝母辛的峰面積,計(jì)算貝母辛的RSD(n=6)為1.66 %,結(jié)果表明儀器精密度良好。

    2.7.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定供試品(批號:140605)6份,每份5.0 g,照“2.7.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.7.3”項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣10 μL,測得貝母辛的峰面積,計(jì)算貝母辛的RSD(n=6)為1.85%,表明本法重現(xiàn)性好,方法可行。

    2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定供試品(批號:140605)5.0 g,按“2.7.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.7.3”項(xiàng)下色譜條件,分別于0、12、24、28、32、40 h后進(jìn)樣,測得貝母辛的峰面積,計(jì)算貝母辛RSD(n=6)為1.86%,表明供試品溶液在40 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.7.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定供試品(批號:140605)6份,每份5.0 g,分別置于250 mL圓底燒瓶中,同時加入1 mL濃度分別為0.1105 mg·mL-1貝母辛對照品溶液,按“2.7.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液,按“2.7.3”項(xiàng)下色譜條件測定,見表4,結(jié)果表明制貝母加樣回收率試驗(yàn)符合要求。

    表4 制貝母中貝母辛回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    2.7.9 制川貝母中貝母辛含量測定

    將10批次供試品,按“2.7.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.7.3”項(xiàng)下色譜條件,見表5,根據(jù)測定結(jié)果,制川貝中貝母辛含量為0.024%~0.047%,平均為0.031%,故暫定制川貝,含貝母辛(C27H41NO3)不得少于0.020%。

    表5 貝母辛含量測定試驗(yàn)結(jié)果(n=12)

    3 討論

    川貝母為名貴的川產(chǎn)道地藥材,常生長在海拔3500~4500 m區(qū)域[11],生長周期長,加之近幾年過度采挖,導(dǎo)致野生川貝母資源日漸匱乏,已被列入國家三級保護(hù)植物名單,且貨源緊缺,價格昂貴,僅能滿足5%~10%的市場需求[12]。本課題前期研究表明,經(jīng)過秘制處理的川貝母口感更好,便于服用,增強(qiáng)了其清熱潤肺、化痰止咳的功效[9],擴(kuò)大了其臨床用藥范圍,對提高川貝母的利用價值具有重要意義。生物堿作為貝母公認(rèn)的有效成分之一,一直被用作貝母品質(zhì)評價的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)[13]。貝母辛是《中國藥典》2010 版一部中川貝母六種基源種的共有生物堿成分之一[14],也是貝母的主要活性成分和特征性成分[15]。本文將貝母辛納入制川貝母的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,可加強(qiáng)對制川貝母的質(zhì)量控制。經(jīng)本文測定,水分、總灰分、浸出物限度制定均高于藥典中川貝母對映項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn),總生物堿以西貝母堿計(jì)比生品具有一定程度降低。綜上,除西貝母堿含量測定外,本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)要求及結(jié)果均在《中國藥典》規(guī)定的川貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi),并新增了貝母辛的含量測定。本研究制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對制川貝母新工藝規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化起到重要指導(dǎo)作用,同時可作為控制制川貝母的質(zhì)量依據(jù)。

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    (責(zé)任編輯:陳思敏)

    Quality standard of prepared Chuan Beimu

    /LIN Li1, LIU Qi2/ / (1.Sichuan Provincial People’s Hospital , Chengdu 610021, Sichuan ;2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine , Chengdu 611137, Sichuan)

    Objective: To establish the quality standard of prepared Chuan Beimu. Method: According to the methods recorded in Chinese Pharmacopeia (2010 edition) for the quality standard for prepared Chuan Beimu, the microscopic identification, TLC identifcation, the moisture content, ash content, extract and content determination of total alkaloids with imperialine as indicator were carried out. In addition, peimisine content of prepared Chuan Beimu was detected by HPLC. The limitations of total alkaloids and peimisine were made for the quality standard for prepared Chuan Beimu. Result: The thin layer identifcation showed that there were no significant difference of microscopic characteristics between processed product and raw product of Chuan Beimu. TLC identifcation of extract of processed product and raw product of Chuan Beimu was almost the same. The moisture content should be below 13.0%, and the total ash content should be less than 1.60%. The content of extract, total alkaloids calculated using imperialine as indicator and peimisine content of prepared Chuan Beimus should be more than 25.0 %, 0.04%, 0.020%, respectively. Conclusion: The research can be used as the reference for quality standard of prepared Chuan Beimu.

    Prepared Chuan Beimu; total alkaloids; peimisine; quality standard

    R 285.5

    A

    1674-926X(2016)06-002-05

    四川省2015年中藥炮制飲片規(guī)范

    1. 四川省人民醫(yī)院 四川 成都 6100211;

    2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 四川 成都 610075

    劉莉,主管藥師,主要從事中藥飲片質(zhì)量及管理工作 Tel:13981922472

    2016-04-05

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