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      分子檢測(cè)技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的研究進(jìn)展

      2016-05-12 06:59:35王桂榮黃海榮
      中國(guó)防癆雜志 2016年8期
      關(guān)鍵詞:基因芯片利福平骨關(guān)節(jié)

      王桂榮 黃海榮

      ?

      ·綜述·

      分子檢測(cè)技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的研究進(jìn)展

      王桂榮 黃海榮

      骨關(guān)節(jié)結(jié)核約占肺外結(jié)核的15%,由于癥狀不典型,易導(dǎo)致漏診、誤診。細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度低、耗時(shí)長(zhǎng),不能滿足骨關(guān)節(jié)結(jié)核快速診斷的需要。近年來(lái)分子診斷技術(shù)在結(jié)核病診斷中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用,作者綜述了基因芯片技術(shù)、線性探針技術(shù)和Xpert MTB/RIF技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的研究進(jìn)展,以便為選擇骨關(guān)節(jié)結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷方法提供依據(jù)。

      結(jié)核,骨關(guān)節(jié); 分子診斷技術(shù); 結(jié)核, 抗多種藥物性; 綜述

      結(jié)核病(tuberculosis,TB)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性傳染性疾病,可累及全身幾乎所有的器官和組織。結(jié)核病在全球?qū)е滤劳龅母腥拘约膊≈信琶诙?,僅次于人類(lèi)獲得性免疫缺陷綜合征[1]。據(jù)WHO《2015年全球結(jié)核病年報(bào)》報(bào)告,2014年我國(guó)新增結(jié)核病患者93萬(wàn)例,其中22%為肺外結(jié)核患者[1]。我國(guó)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,中國(guó)的MDR-TB患者例數(shù)占世界的17.33%[1-2]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核絕大多數(shù)繼發(fā)于肺結(jié)核,結(jié)核分枝桿菌通過(guò)血行或淋巴系統(tǒng)傳播至骨關(guān)節(jié),發(fā)生于供血豐富、負(fù)重程度大的骨質(zhì)或活動(dòng)較多的關(guān)節(jié)滑膜。骨關(guān)節(jié)結(jié)核占所有結(jié)核病患者例數(shù)的3%~5%,占肺外結(jié)核患者例數(shù)的15%[3]?;颊呷糸L(zhǎng)期得不到有效治療,會(huì)大大增加后遺癥風(fēng)險(xiǎn),如脊柱彎曲、棘突隆起、背部“駝峰”畸形、截癱等,這些后遺癥將給患者造成終生身體和精神上的痛苦[4]。因此,在MDR-TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家中,快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性,對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷和早期治療,以及對(duì)結(jié)核病疫情的控制均具有重要意義。

      由于骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床表現(xiàn)不典型、病變位置深、標(biāo)本不易獲得,加之病灶含菌量少,給骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法中膿液涂片抗酸染色陽(yáng)性率為10%~30%[5],膿液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為10%~60%[6],而且耗時(shí)較長(zhǎng),不能滿足骨關(guān)節(jié)結(jié)核快速診斷的需要。準(zhǔn)確及時(shí)的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)是指導(dǎo)臨床早期開(kāi)展個(gè)體化治療、控制結(jié)核病流行的前提。而傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”),從培養(yǎng)到獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果需8~12周,不能滿足耐藥骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期治療。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)在快速診斷結(jié)核病及其耐藥性中已發(fā)揮重要作用,而且該領(lǐng)域仍在不斷改進(jìn)和發(fā)展中,使其操作更加簡(jiǎn)便、成本更加低廉。筆者將綜述常用分子檢測(cè)技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的研究進(jìn)展。

      一、基因芯片技術(shù)

      基因芯片技術(shù)的基本原理是通過(guò)微陣列技術(shù)將多種DNA探針有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上,然后與標(biāo)記的樣品雜交,通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息[7]?;蛐酒夹g(shù)作為一種高通量自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù),在病原微生物分子診斷方面可用于菌種鑒定、分型、診斷、耐藥性檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域,具有快速、準(zhǔn)確、高通量、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。Zhang等[8]評(píng)估了CapitalBioTM基因芯片診斷脊柱結(jié)核及其對(duì)利福平和異煙肼的耐藥情況,結(jié)果表明與BACTEC MGIT 960系統(tǒng)相比,CapitalBioTM基因芯片診斷脊柱結(jié)核的敏感度為93.55%,檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為88.9%,特異度為90.7%;檢測(cè)異煙肼耐藥的敏感度為80.0%,特異度為91.0%。劉軍蘭等[9]報(bào)道基因芯片檢測(cè)關(guān)節(jié)液中結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確率為86.44%。程鵬等[10]報(bào)道采用基因芯片技術(shù)對(duì)脊柱結(jié)核臨床分離株進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)對(duì)鏈霉素、乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星和卷曲霉素耐藥的敏感度分別為90.36%、61.90%、94.59%、66.00%和65.52%,其對(duì)應(yīng)的特異度分別為70.37%、58.11%、58.00%、91.95%和80.56%;在26株全敏感菌株中,對(duì)5種抗結(jié)核藥物耐藥檢測(cè)的特異度均為100%??梢?jiàn)基因芯片法診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線、二線抗結(jié)核藥物耐藥檢測(cè)的敏感度、特異度均較高。

      基因芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):特異度強(qiáng)、敏感度高、檢測(cè)快速、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè);缺點(diǎn):需要特殊儀器及相關(guān)軟件分析系統(tǒng)、結(jié)果判斷需要較高水平的專(zhuān)業(yè)人員、自動(dòng)化程度不夠易造成交叉污染等。與痰標(biāo)本和結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株相比,骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床標(biāo)本具有異質(zhì)性大、標(biāo)本含菌量少、標(biāo)本處理難度大等特點(diǎn),因此應(yīng)用基因芯片技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性時(shí),標(biāo)本的處理較復(fù)雜。目前,分子檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的診斷中獲得越來(lái)越多的重視,然而分子檢測(cè)技術(shù)仍無(wú)法完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法?;蛐酒夹g(shù)可與傳統(tǒng)方法結(jié)合使用,指導(dǎo)臨床開(kāi)展早期、有效化療。

      二、線性探針技術(shù)

      線性探針技術(shù)(line probe assay, LPA)的原理是通過(guò)應(yīng)用生物素標(biāo)記的特異引物進(jìn)行靶核酸(DNA)的擴(kuò)增,并將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后與固定在尼龍膜上的特異寡核苷酸探針雜交,通過(guò)酶聯(lián)免疫顯色法顯示結(jié)果,1次雜交可以檢測(cè)多種靶序列[11]。比較有代表性的線性探針技術(shù)試劑盒有INNO-LPA(Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium)、GenoType MTBDRplus(Hain Lifescience, Nehren, Germany)、GenoType MTBDRsl(Hain Lifescience, Nehren, Germany)、AID(AID Diagnostika, Germany)等。INNO-LPA是最早應(yīng)用于臨床的LPA試劑盒,可用于結(jié)核分枝桿菌臨床分離株和涂陽(yáng)痰標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥檢測(cè)[12]。GenoType MTBDRplus試劑盒可用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及異煙肼和利福平耐藥,2008年WHO推薦GenoType MTBDRplus 試劑盒用于涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性檢測(cè)[13]。GenoType MTBDRsl試劑盒可檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)和二線注射類(lèi)抗結(jié)核藥物耐藥情況[14]。AID試劑盒含有3個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)模塊,模塊1可同時(shí)檢測(cè)利福平和異煙肼是否耐藥,模塊2可同時(shí)檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)和乙胺丁醇是否耐藥,模塊3可同時(shí)檢測(cè)卡那霉素、阿米卡星和鏈霉素是否耐藥[15]。

      Meta分析顯示GenoType MTBDRplus試劑盒檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為98.1%,特異度為98.7%;檢測(cè)異煙肼耐藥的敏感度為84.3%,特異度為99.5%[16]。Gu等[17]的研究結(jié)果顯示,以臨床診斷參考標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn),GenoType MTBDRplus 試劑盒診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度為72%,特異度為100%;以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),GenoType MTBDRplus試劑盒檢測(cè)利福平和異煙肼的敏感度分別為83.3%和85.7%,特異度均為100.0%。Molina-Moya等[18]的研究結(jié)果顯示,AID試劑盒與BACTEC MGIT 960系統(tǒng)檢測(cè)異煙肼、利福平、氟喹諾酮類(lèi)、乙胺丁醇、卡那霉素或卷曲霉素、鏈霉素耐藥的一致性分別為98.3%(59/60)、100.0%(60/60)、91.5%(54/59)、72.9%(43/59)、100.0%(51/51) 和98.0%(50/51)。Brossier等[14]報(bào)道GenoType MTBDRsl試劑盒(版本2.0)檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐藥的敏感度分別為94.8%、90.5%、91.3%和83.0%。

      LPA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):具有較高的敏感度和特異度,并可同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性,而且有些試劑盒可檢測(cè)二線藥物的耐藥情況。缺點(diǎn):LPA所含探針數(shù)量有限,不能檢測(cè)出一些基因區(qū)(如ahpC、kasA、furA等)的突變,可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果[19];對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及工作人員水平要求較高。

      LPA技術(shù)檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的敏感度和特異度高,檢測(cè)時(shí)間短,并且可同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性,可用于早期診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性。由于骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床標(biāo)本與痰標(biāo)本性質(zhì)差異較大,盡量留取多種骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本,并優(yōu)化標(biāo)本前處理過(guò)程,可獲得較好的檢測(cè)結(jié)果[20]。

      三、Xpert MTB/RIF技術(shù)

      Xpert MTB/RIF技術(shù)是以半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動(dòng)核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù),以rpoB基因?yàn)榘谢?,可? h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和是否對(duì)利福平耐藥[21-22]。2010年WHO推薦Xpert MTB/RIF技術(shù)用于肺結(jié)核的診斷,2013年WHO又推薦Xpert MTB/RIF技術(shù)用于肺外結(jié)核的診斷[23-24]。Meta分析顯示Xpert MTB/RIF診斷肺外結(jié)核的敏感度為77%~83%,特異度為97%~98%[25-26]。國(guó)內(nèi)外研究表明,Xpert MTB/RIF診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度為63.57%~95.60,特異度為96.20%~100.00%;檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核利福平耐藥的敏感度為93.33%~100.00%,特異度為94.12%~100.00%[17,27-30]。

      Xpert MTB/RIF技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):自動(dòng)化檢測(cè)平臺(tái),操作簡(jiǎn)便,對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的水平要求較低;檢測(cè)時(shí)間短,2 h即可報(bào)告結(jié)果;準(zhǔn)確率較高;全封閉系統(tǒng),可降低交叉污染率,并可降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)。缺點(diǎn):儀器和試劑較昂貴;僅能檢測(cè)利福平耐藥?;蛐酒夹g(shù)、線性探針技術(shù)和Xpert MTB/RIF技術(shù)的特點(diǎn)見(jiàn)表1。

      不同標(biāo)本類(lèi)型及不同標(biāo)本處理方法均會(huì)不同程度地影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性,為盡可能減少誤差,WHO對(duì)不同標(biāo)本的預(yù)處理方法做了推薦[31],骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本的預(yù)處理可參照淋巴結(jié)和其他組織的推薦處理步驟,使Xpert MTB/RIF技術(shù)應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷具有一定可行性。由于Xpert MTB/RIF在骨關(guān)節(jié)結(jié)核快速診斷中敏感度和特異度高,檢測(cè)時(shí)間短,生物安全性好,并且可同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥,適用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的快速診斷。

      表1 各類(lèi)項(xiàng)目在基因芯片、線性探針和Xpert MTB/RIF技術(shù)中的特點(diǎn)

      總之,骨關(guān)節(jié)結(jié)核若能早期診斷、早期治療,不僅可控制病情進(jìn)展,縮短治療療程,還可以減輕患者經(jīng)濟(jì)壓力,減少或避免脊柱畸形。在骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中應(yīng)在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的基礎(chǔ)上,輔以分子檢測(cè)技術(shù),相信隨著檢查方法的不斷進(jìn)步,骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷將會(huì)更快速、更準(zhǔn)確。

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      [31] World Health Organization. Xpert MTB/RIF implementation manual: technical and operational “how-to”: practical consi-derations. Geneva: World Health Organization, 2014.

      (本文編輯:郭萌)

      Research progress on molecular tests in diagnosis of bone and joint tuberculosis and detection of drug resistance

      WANGGui-rong,HUANGHai-rong.

      NationalClinicalLaboratoryonTuberculosis,BeijingKeyLaboratoryforDrugResistantTuberculosisResearch,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorInstitute,Beijing101149,China

      HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

      Bone and joint tuberculosis (BJTB) accounts for about 15% of extrapulmonary TB. The atypical clinical symptoms often caused its misdiagnosis. Although, bacteriological confirmation ofM.tuberculosisremains as a gold standard for the diagnosis of TB. Conventional techniques are not sensitive enough and time consuming, which can’t provide rapid BJTB diagnosis. Nowadays, molecular tests play an important role in TB rapid diagnosis. The progresses on DNA microarray, molecular line probe assay and Xpert MTB/RIF assay in diagnosis of BJTB are discussed, which will provide a reliable basis for selecting laboratory examination methods for BJTB.

      Tuberculosis, osteoarticular; Molecular diagnostic techniques; Tuberculosis, multidrug-resistant; Review

      10.3969/j.issn.1000-6621.2016.08.015

      北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2014-3-084);首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)-臨床科研合作基金(16JL75)

      101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室 北京市耐藥結(jié)核病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

      黃海榮,Email:huanghairong@tb123.org

      2016-04-10)

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