水果果肉中總DNA提取方法的比較研究

齊玲倩，劉秀，丁夢(mèng)璇，劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)，柯潤(rùn)輝，尹建軍（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

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水果果肉中總DNA提取方法的比較研究

齊玲倩，劉秀*，丁夢(mèng)璇，劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)，柯潤(rùn)輝，尹建軍
（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

摘要：為了獲得高效通用的水果果肉DNA提取方法，本研究以11種水果為試驗(yàn)材料，從前處理方法、裂解液成分、異丙醇沉淀時(shí)間等方面對(duì)CTAB法進(jìn)行了改進(jìn)，并比較了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法、試劑盒法、改良CTAB法3種方法的提取效果，發(fā)現(xiàn)改良CTAB法提取的水果果肉DNA濃度都在46.25μg/mL以上，純度都在1.8左右，且能擴(kuò)增出137bp的18SrDNA條帶，從而確定了高效通用的水果果肉DNA提取方法:改良CTAB法。

關(guān)鍵詞：水果；DNA提??；改良CTAB法

果汁是重要的健康飲品，但如今果汁摻假問題日趨嚴(yán)重，例如在蘋果汁中摻加梨汁或白葡萄汁，在橙汁中摻加柑橘汁、西柚汁、胡柚汁，在紅色漿果汁中摻加蘋果汁等[1-2]，這對(duì)消費(fèi)者的利益和國際貿(mào)易的進(jìn)行造成了極大的損害，因此亟待建立果汁中水果成分的檢測(cè)方法。基因檢測(cè)方法以其特異、快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在果汁中水果成分的鑒定上[3-9]。

作為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照品的水果DNA的提取，是運(yùn)用基因檢測(cè)方法鑒定果汁中水果成分的前提。但是，水果果肉中富含的多酚類物質(zhì)能使DNA氧化成棕褐色凝膠狀物，多糖類物質(zhì)能與DNA結(jié)合成黏稠的膠狀物[10-14]，這嚴(yán)重影響其DNA的提取。目前，國內(nèi)外關(guān)于從水果果肉中提取DNA的研究較多，其提取方法主要有試劑盒法和改良十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，以下簡(jiǎn)稱CTAB）法，李富威等[15-16]應(yīng)用天根試劑盒提取多種水果中的DNA，建立了食品中木瓜和香蕉成分的基因檢測(cè)方法；韓建勛等[17]使用改良CTAB法提取多種水果果肉的DNA，建立了果汁中梨成分的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，以下簡(jiǎn)稱PCR）檢測(cè)方法；Ng，C.C.等[18]利用由改良CTAB法提取的水果果肉的DNA進(jìn)行果汁真實(shí)性的鑒別。此外，在標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3729-2013《出口食品及飲料中常見水果品種的鑒定方法第2部分：杏成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法》[19]中也包含了果實(shí)DNA的提取方法。但是，目前為止，鮮見報(bào)道這3種方法的比較研究。

本研究以11種水果為供試材料，比較了試劑盒法、改良CTAB法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法在DNA提取上的效果，以期獲得高效通用的水果果肉DNA提取方法，為后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

11種供試水果（木瓜、蘋果、梨、葡萄、芒果、香蕉、桃、山楂、菠蘿、橘、橙):均購自北京超市，分別對(duì)其編號(hào)木瓜A、蘋果B、梨C、葡萄D、芒果E、香蕉F、桃G、山楂H、菠蘿I、橘J、橙K。

1.2試劑

DNA提取試劑：CTAB裂解液（0.1 mol/L Tris-HCl、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L Na2EDTA、20 g/L CTAB，pH=8）、CTAB沉淀液（5 g/L CTAB、40 mmol/L NaCl）、分離液（700 mmol/L NaCl、0.01 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl、2 % PVP-40，pH=8）、CTAB核裂解液（0.1 mol/L Tris-HCl、1.4 mol/L NaCl、0.05 mol/L EDTA、20 g/L CTAB、2 % PVP-40，pH=8）、1.2 mol/L NaCl溶液、3.2 mol/L NaCl溶液（pH=5.2），Tirs飽和酚/氯仿（25∶24，體積比）、氯仿/異戊醇（24∶1，體積比）：均為國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心分子實(shí)驗(yàn)室自制；其它試劑或溶劑均為分析純級(jí)或生化純級(jí)。

DP305植物基因組提取試劑盒、RNaseA酶、DNA Marker DL 2000、Goldview：天根生化科技有限公司；應(yīng)用于PCR擴(kuò)增的Buffer、dNTPs、Taq DNA聚合酶:北京全式金生物有限公司；BSA（Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白）：北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司；PCR擴(kuò)增引物：由英濰捷基（上海）生物有限公司合成。

1.3儀器與設(shè)備

5804R型，5424型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；微量移液器：德國Eppendorf公司；Biodrop超微量核酸蛋白分析儀：英國柏點(diǎn)公司；普通PCR擴(kuò)增儀：英國BIOMETRA公司；JY-300C電泳儀：北京君意儀器公司；QUANTUM ST4凝膠成像儀：法國VILBER公司。

1.4DNA提取方法

用以下3種方法從水果果肉中提取DNA。

1.4.1行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法

參見行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3729-2013《出口食品及飲料中常見水果品種的鑒定方法》[19]中的果肉DNA提取方法。

1.4.2試劑盒法

稱取0.25 g果肉于預(yù)冷的2 mL離心管內(nèi)，依次加入預(yù)冷的鋼珠、0.5 mL分離液和30 μL 2 %的β-巰基乙醇，放入預(yù)冷的樣品破碎儀里破碎均勻，再加入1 mL分離液混勻。冰浴靜置10min，4℃，12 000r/min離心10min，棄上清，在沉淀中加入600 μL分離液，混勻，4℃，12 000r/min離心10min，棄上清，在沉淀中加入1 mL 65℃預(yù)熱的GP1緩沖液，后續(xù)步驟詳見試劑盒操作說明書[植物基因組提取試劑盒（目錄號(hào):DP305）]。

1.4.3改良CTAB法

稱取0.25 g果肉于預(yù)冷的2 mL離心管內(nèi)，依次加入預(yù)冷的鋼珠、0.5 mL分離液和30 μL 2 %的β-巰基乙醇，放入預(yù)冷的樣品破碎儀里破碎均勻，再加入1 mL分離液混勻。冰浴靜置10min，4℃，12 000r/min離心10min，棄上清，在沉淀中加入600 μL分離液，混勻，4℃，12 000r/min離心10min，棄上清，在沉淀中加入700 μL CTAB核裂解液，14 μL β-巰基乙醇，混勻，65℃溫浴1 h，期間不時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管幾次，取出后，加入等體積Tirs飽和酚/氯仿，振蕩混勻，靜置5min，4℃，12 000r/min離心10min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，振蕩混勻，靜置5min，4℃，12 000r/min離心10min，取上清，加入1/10體積3.2 mol/L NaCl，等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h，4℃，12 000r/min離心15min～20min，棄上清，70 %乙醇洗沉淀2次，倒置晾干后加入30 μL雙蒸水，混勻，-20℃保存。

1.5DNA的濃度和純度檢測(cè)

DNA的純度是由260 nm和280 nm處的光吸收（即OD260/OD280）的比值決定的。取果肉DNA溶液1 μL，用超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.6PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)

采用引物18SrDNA-F（5′-TCTGCCCTATCAACTT TCGATGGTA-3′）和18SrDNA-R（5′-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3′），擴(kuò)增植物內(nèi)源基因18SrDNA基因（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度137 bp）[19]以檢測(cè)DNA的質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR擴(kuò)增緩沖液[含（NH4）2SO4及Mg2+]2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L引物0.5 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，20 mg/mL的BSA 0.2 μL，模板DNA量為2 μL，加入雙蒸無菌水（ddH2O）將總體積調(diào)整為25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃下保溫。

反應(yīng)結(jié)束后，用2 %的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1DNA提取結(jié)果

用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法、試劑盒法以及改良CTAB法提取11種果實(shí)（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K）的基因組，用Biodrop超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定以上3種方法提取的DNA的純度和濃度，結(jié)果見表1。

表1　不同提取方法提取的果實(shí)DNA的濃度和純度（a±SD，n=3）Table 1 DNA yields and purity of fruit pulp from different extraction methods（a±SD，n=3）

從表1數(shù)據(jù)可以看出，試劑盒法（天根植物基因組提取試劑盒）對(duì)于果實(shí)樣品木瓜（A）、芒果（E）、香蕉（F）、菠蘿（I）、橘（J）的DNA提取效果良好，但無法從其他果實(shí)樣品中提取出核酸。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法在提取芒果（E）DNA時(shí)，效果較好，也可以從木瓜（A）、葡萄（D）、香蕉（F）、桃（G）、菠蘿（I）、橘（J）中成功提取DNA，但濃度較低，而在其他果實(shí)樣品DNA提取時(shí)，效果較差。改良CTAB法提取的DNA樣品的OD260/OD280接近1.8，且DNA含量更高，說明使用改良CTAB法更適合提取果實(shí)DNA。其中，應(yīng)用改良CTAB法提取葡萄（D）DNA時(shí)濃度相對(duì)較低，可能是由于花青素或酚類物質(zhì)的存在，影響了核酸的釋放。

2.2PCR擴(kuò)增結(jié)果

用真核生物通用引物18SrDNA基因?qū)Ω牧糃TAB法提取的11種水果果肉的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1　水果果肉基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜Fig.1 Electrophoresis profile of PCR products amplified by 18SrDNA gene primer in different fruit pulp

如圖1所示，使用改良CTAB法提取的DNA樣品，均可擴(kuò)增出片段大小為137 bp的18SrDNA基因條帶，且條帶明亮清晰，說明提取的果汁基因組DNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的PCR檢測(cè)研究。

3　討論

本試驗(yàn)采取3種DNA提取方案從果實(shí)中提取DNA，通過比較DNA的純度、濃度，檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增效率，確定了提取效率較高的方法-改良CTAB法，該方法針對(duì)果肉中含富含多糖、多酚、色素及次生代謝物的問題，對(duì)傳統(tǒng)CTAB法進(jìn)行了以下改進(jìn):

1）前處理方法：針對(duì)果肉中多糖、多酚及色素含量多的特點(diǎn)，采用預(yù)加分離液進(jìn)行破碎，一方面分離液中含PVP-40和β-巰基乙醇，可有效防止多酚氧化；另一方面預(yù)加分離液洗滌果肉，可去除部分可溶性多糖和水溶性色素雜質(zhì)，利于后續(xù)操作的進(jìn)行，提高了DNA的提取效率。同時(shí)，DNA的釋放受果肉樣品破碎程度的影響，本試驗(yàn)采用樣品破碎儀進(jìn)行破碎，相對(duì)于較為常用的研缽研磨法，方便快捷，提高了樣品破碎的效率。

2）裂解液成分：針對(duì)植物樣品中多酚含量多的特點(diǎn)，在CTAB核裂解液中加入2 %（體積分?jǐn)?shù)）的PVP-40和2 %（體積分?jǐn)?shù)）的β-巰基乙醇，進(jìn)一步抑制多酚氧化，阻止多酚氧化物與DNA的不可逆結(jié)合，從而提高DNA的質(zhì)量及PCR擴(kuò)增效率。

3）異丙醇沉淀時(shí)間：Sonia Ramos-Gómez等[20]研究發(fā)現(xiàn)沉淀時(shí)間對(duì)于DNA純度有重要影響，沉淀時(shí)間越長(zhǎng)，DNA濃度越高但純度越低，考慮到DNA的濃度、純度以及提取過程的時(shí)耗，選擇在-20℃下沉淀1 h。

另外，在試驗(yàn)耗時(shí)方面，試劑盒法提取DNA的總時(shí)間大約是3.0 h～3.5 h，但是提取果肉DNA的效果不理想，利用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法從果肉中提取果肉DNA所用的總時(shí)間大約是6.0 h～6.5 h，而改良CTAB法則為4.5 h～5 h，耗時(shí)少；在經(jīng)濟(jì)性方面，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法提取果肉DNA所需的果肉為500 mg，而改良CTAB法所需的果肉為250 mg，耗費(fèi)的原料較少，同時(shí)改良CTAB法的花費(fèi)大約為3.5元，低于天根試劑盒法的二分之一。

綜上所述，最終建立的不同果實(shí)的有效通用DNA提取方法-改良CTAB法，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟和時(shí)間，縮減了實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)，提高了DNA的提取效率，可為以后的果汁真實(shí)性基因檢測(cè)提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘇光明,胡小松,廖小軍,等.果汁鑒偽技術(shù)研究新進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(6):151-156

[2]陳穎,吳亞君.話說我國果汁業(yè)中的果汁摻假問題[J].中國果業(yè)信息,2013,30(6):39-41

[3]陳穎,吳亞君.基因檢測(cè)技術(shù)在食品物種鑒定中的應(yīng)用[J].色譜, 2011,29(7):594-600

[4] Jianxun Han,Yajun Wu,Wensheng Huang,et al.PCR and DHPLC methods used to detect juice ingredient from 7 fruits [J].Food Control,2012,25(2):696-703

[5] Knight A.Development and validation of a PCR-based heteroduplex assay for the quantitative detection of mandarin juice in processed orange juices[J].Agro- Food-Industry Hi-Tech,2000,11(2):7-8

[6] Popping Bert.The application of biotechnological methods in authenticity testing[J].Journal of biotechnology ,2002,98(1):107-112

[7]劉偉紅,許文濤,商穎,等.果汁DNA提取方法比較及柑橘屬植物分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2012,12(4):195-201

[8] Chang-Chai Ng,Chen-Chin Chang,I-Chieh Wu,et al.Rapid molecular identification of freshly squeezed and reconstituted orange juice [J].Int.J.Food Sci.Technol.,2006,41(6):646-651

[9]梁宇斌,牟靖芳,李曉明,等.果汁中柑橘屬成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[J].食品研究與開發(fā),2014,35(16):84-90

[10]段婧婧,肖琳,陳軍.用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的水果果肉總DNA提取法[J].食品科學(xué),2009,30 (3):231-234

[11]沈夏艷,陳穎,黃文勝,等.果汁鑒偽技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2007,17(4):63-66

[12]高媛,杜國強(qiáng),師校欣.適于轉(zhuǎn)基因蘋果種子和果肉總DNA提取的方法[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(16):238-241

[13]趙琳娜,胡鳳月,吳孝槐,等.用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的番木瓜基因組DNA提取方法的比較[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(2):188-191

[14]高媛,杜國強(qiáng),師校欣.適于轉(zhuǎn)基因蘋果種子和果肉總DNA提取的方法[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(16):238-241

[15]李富威,張舒亞,葉軍,等.食品中木瓜成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[J].食品研究與開發(fā),2013,34(11):51-56

[16]李富威,張舒亞,葉軍,等.實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)食品中香蕉成分[J].食品科學(xué),2013,34(12):243-246

[17]韓建勛,黃文勝,吳亞軍,等.果汁中梨成分分子生物學(xué)鑒偽-實(shí)時(shí)熒光PCR方法研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2010,10(1):207-213

[18] Ng C C,Lin C Y,Tzeng W S,et al.Establishment of an internal transcribed spacer (ITS）sequence-based differentiation identification procedure for mei (Prunus mume）and plum (Prunus salicina）and its use to detect adulteration in preserved fruits [J].Food Research International,2005,38(1):95-101

[19]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局.SN/T 3729-2013出口食品及飲料中常見水果品種的鑒定方法第2部分:杏成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法[S].北京,中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2013

[20] Sonia Ramos-Gómez,María D.Busto,Manuel Perez-Mateos,et al.Development of a method to recovery and amplification DNA by real-time PCR from commercial vegetableoils[J].FoodChemistry,2014, 158(5):374-383

Comparative Study on DNA Extraction from Fresh Fruit

QI Ling-qian，LIU Xiu*，DING Meng-xuan，LIU Yuan-yuan，KE Run-hui，YIN Jian-jun
（China National Research Institute Food & Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：In order to obtain an efficient and general DNA extraction method from fresh fruit，eleven kinds of fruit were taken as experimental material，the CTAB method was developed from several aspects，such as the pre-treatment methods，the composition of lysis buffer，the time of Isopropyl alcohol precipitation and so on.Furthermore，the three methods were compared on their extraction efficiency which included industry standard method，DNA extraction kit method and modified CTAB method.The results showed that modified CTAB method was the most suitable for the DNA extraction from fresh fruit，the concentration of isolated genomic DNAs was in more than 46.25 μg/mL，the value of OD260 / OD280 was close to 1.8，and the isolated genomic DNAs also amplified the 137 bp size banding of endogenous 18SrDNA .

Key words：fruit；DNA extraction；modified CTAB method

DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.014

作者簡(jiǎn)介：齊玲倩（1989—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向:果汁真實(shí)性的分子鑒別方法。

*通信作者：劉秀（1979—），男（漢），高級(jí)工程師，主要從事食品真實(shí)性檢測(cè)。

收稿日期：2015-05-22