糖尿病性ED大鼠陰莖海綿體平滑肌中CaSR的表達①

秦文波，張　鵬，武　寧，李　璐

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，黑龍江佳木斯154002;2.鄭州市第七人民醫(yī)院兒科，河南鄭州450000)

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糖尿病性ED大鼠陰莖海綿體平滑肌中CaSR的表達①

秦文波1，張鵬1，武寧1，李璐2

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，黑龍江佳木斯154002;2.鄭州市第七人民醫(yī)院兒科，河南鄭州450000)

摘要:目的:觀察CaSR在糖尿病性勃起功能障礙(Diabetes mellitus－induced erectile dysfunction，DMED)大鼠陰莖海綿體平滑肌內(nèi)的表達，揭示其與勃起功能障礙的關(guān)系。方法: 3月齡雄性Wistar大鼠(動物實驗中心)隨機分成3組:正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病NPS2390組。采用ICP檢測3組大鼠陰莖海綿體壓力變化、采用免疫熒光法觀察海綿體組織CaSR蛋白表達。HE染色法觀察陰莖海綿體毛細血管數(shù)。結(jié)果:正常大鼠的陰莖海綿體平滑肌細胞有CaSR蛋白表達，且與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組大鼠陰莖海綿體組織CaSR蛋白含量增加(P＜0.01)，而陰莖海綿體毛細血管數(shù)減少(P＜0.01) ;且與糖尿病模型組比較，糖尿病NPS2390組CaSR蛋白含量明顯減少(P＜0.01)，而陰莖海綿體毛細血管數(shù)明顯增加(P＜0.01)。結(jié)論: CaSR有在陰莖海綿體平滑肌表達; CaSR參與了大鼠DMED的發(fā)生。

關(guān)鍵詞:糖尿病;勃起功能障礙;鈣敏感受體。

勃起功能障礙(Erectiledysfunedon，ED)是指持續(xù)或反復(fù)不能勃起或者勃起狀態(tài)維持的時間不足以完成滿意的性生活。國外流行病學(xué)調(diào)查顯示，約7%～60%的男性患有程度不同的ED。而ED患者中，約40%患有糖尿?。?，2］。在男性糖尿病患者中發(fā)生ED的概率為未患有糖尿病ED的3～6倍［3，4］。對于糖尿病ED，其發(fā)生機制復(fù)雜，尚未完全清楚，缺少有效的治療手段，已成為男性學(xué)科的熱點。鈣敏感受體(calcium－sensing receptor，CaSR)屬G蛋白偶聯(lián)受體C家族成員(該家族成員還包括mGluR、GABAb受體和信息素受體)。1993年，Brown EM等人在牛甲狀腺中首次克隆出了CaSR［5］。2003年，Wang等［6］首次證實在大鼠心肌組織中存在著CaSR。而關(guān)于在陰莖海綿體平滑肌細胞有無CaSR的功能表達及其病理生理意義，目前相關(guān)報道很少。因此，本實驗通過DMED模型的建立，及NPS2370的干擾，初步探討CaSR與勃起功能障礙的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料

SPF(Specific pathogen Free，SPF)級純系3月齡雄性Wistar大鼠(佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供) 40只，體重180～230g。STZ購自北京市博愛科貿(mào)有限責(zé)任公司，NPS2390購自美國Sigma公司，阿撲嗎啡購自美國Sigma公司，兔源CaSR多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，抗熒光淬滅劑購自武漢博士德生物工程有限公司，考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所，PBS液購自佳木斯大學(xué)實驗室。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物模型建立及分組

(1)正常對照組: 10只，僅經(jīng)腹腔注射檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖液(30mg/kg) ; (2)糖尿病模型組: 10只，除對照組外大鼠高脂高糖飲食4w后，禁食16～18h，30只大鼠經(jīng)腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液(30mg/kg)，3d后，尾靜脈取血，測空腹血糖，并觀察大鼠禁食情況、飲水、尿量及體重變化。有多飲、多食、多尿、消瘦且血糖持續(xù)3周≥16.67mmol/L為造模成功未達標(biāo)準(zhǔn)者淘汰。將成模20只大鼠隨機分為糖尿病模型組和糖尿病NPS2390(CaSR激活劑)組; (3) :糖尿病NPS2390組:另每周經(jīng)尾靜脈注射NPS2390(100mg/kg)二次。

1.2.2 APO實驗

選擇一安靜的房間，在每只大鼠頸項背部皮下注射阿樸嗎啡(100μg/kg)。注射以后觀察每只大鼠在1h內(nèi)有沒有陰莖勃起，是否有張嘴反應(yīng)并予以記錄。龜頭充血或陰莖體勃起成角大于90°記錄為1次勃起。以每組中有陰莖勃起的大鼠的百分比為勃起率。

1.2.3陰莖海綿體中蛋白測定(考馬斯亮藍法測定)

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定法:取6只試管，1只做為空白對照，僅加入蒸餾水1.0mL，其余5只分別加入不同體積以及濃度為100μg/mL牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)液，添加蒸餾水至1.0mL。再在每只試管內(nèi)分別加入考馬斯亮藍G－250試劑5.0mL，蓋上塞子，震蕩，靜置5min后在紫外線下在分光光度計585nm處測定吸光值。以牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)蛋白樣品:備100ug/mL的待測陰莖海綿體勻漿溶液。取一只試管做為空白對照，只添加蒸餾水1.0mL，一支加入0.5mL待測液，補充蒸餾水到1.0mL。然后每支試管均加入5.0mL考馬斯亮藍G－250試劑，蓋上塞子，震蕩，靜置10min，在585nm處，用紫外可見分光光度計測定吸光值。用測得的結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相當(dāng)于牛血清清蛋白的數(shù)量，計算得出待測陰莖海綿體勻漿溶液中蛋白質(zhì)的含量。為減小測定誤差，測定中，每一個濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測蛋白質(zhì)樣品需做3支平行管。根據(jù)所測樣品的吸光度值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(μg)，按下式計算:

樣品蛋白質(zhì)含量鮮重= (查得的蛋白質(zhì)含量×提取液總體積) /(樣品鮮重×測定時取用提取液的體積)

1.2.4 HE染色觀察陰莖海綿體組織毛細血管數(shù)目

采用蘇木素－伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色觀察陰莖海綿體血管:取大鼠陰莖海綿體做常規(guī)石蠟切片，對標(biāo)本HE染色，對比二者改變。每張切片隨機選取20個不同視野，鏡下計錄毛細血管數(shù)目。

1.2.5激光共聚焦顯微鏡熒光分析

(1)常規(guī)脫蠟至水:放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min→100%酒精Ⅰ10min、100%酒精Ⅱ10min→95%、90%、80%、70%酒精各10min→蒸餾水2min三次。

(2)熱修復(fù)抗原:放入0.01M枸椽酸鹽緩沖液(pH =6.0)中，在微波爐加熱下至液體沸騰后，自然冷卻至室溫，反復(fù)1次(10min后)，PBS(pH 7.2～7.6)洗滌5min，3次。

(3)抗原修復(fù)液修復(fù):滴加抗原修復(fù)液，濕盒置于37℃恒溫水浴箱中孵育15min，之后PBS洗滌5min，3次。

(4)血清封閉:用紙巾吸干組織周圍多余液體，擺放濕盒中，滴加血清封閉，濕盒置于37℃恒溫水浴箱中孵育20min，不洗。

(5)加一抗:滴加CaSR抗體于切片上，濕盒置于4℃冰箱過夜。

(6)取出濕盒恢復(fù)室溫30min，之后PBS洗滌5min，3次。

(7)滴加熒光標(biāo)記二抗:濕盒置于37℃恒溫水浴箱孵育90min。PBS洗滌5min，3次。

(8)激光掃描共聚焦顯微鏡取圖，取圖條件:激發(fā)光波長: 488nm;掃描方式: xyz;物鏡: 20倍干鏡(NA為0.75) ;激光功率: (20±2) mw;掃描強度: 50%;光電倍增管的增益(PMT) : 852;探測針孔: 2.02;掃描次數(shù): 4。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS(9.13版)軟件處理實驗數(shù)據(jù)，調(diào)用Proc GLM過程進行方差分析，各實驗組與對照組的比較采用dunnet t檢驗，P＜0.01表示有統(tǒng)計學(xué)意義，保留且進行相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1勃起次數(shù)及勃起率測定

與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組陰莖勃起次數(shù)和勃起率均降低;與正常組相比較，糖尿病組陰莖勃起次數(shù)和勃起率明顯降低，而糖尿病NPS2390組相比較有所回升，與正常組非常接近，見表1。

表1　各組勃起率的變化情況(±s，n =10)

表1　各組勃起率的變化情況(±s，n =10)

組別　　勃起次數(shù)　　勃起率(%)正常對照組　3.5±0.4　100(10/10)糖尿病模型組　2.2±0.3　60(6/10)糖尿病NPS2390組　3.2±0.2　90(9/10)

2.2免疫熒光檢測大鼠陰莖海綿體平滑肌鈣敏感

受體蛋白的表達

與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織鈣敏感受體蛋白表達增加(P＜0.01)，且糖尿病模型組與糖尿病NPS239組比較，大鼠陰莖海綿體平滑肌組織鈣敏感受體蛋白表達明顯增加，差異有顯著性(P＜0.01)，見表2，圖1～3。

表2　大鼠陰莖海綿體組織鈣敏感受體蛋白表達(±s，n =10)

表2　大鼠陰莖海綿體組織鈣敏感受體蛋白表達(±s，n =10)

組別　　熒光強度(means±s.e.m)正常對照組1.09±0.03糖尿病模型組　1.72±0.08糖尿病NPS2390組1.23±0.05

2.3大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數(shù)目檢測

與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數(shù)目減少(P＜0.01)，且糖尿病模型組與糖尿病NPS2390組比較，大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數(shù)目明顯減少，差異有顯著性(P＜0.01)。

表3　各組大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數(shù)目(±s，n =10)

表3　各組大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數(shù)目(±s，n =10)

組別　　毛細血管數(shù)目(根/HP)正常對照組13.90±3.40糖尿病模型組　8.20±2.30糖尿病NPS2390組11.35±1.50

圖1　正常對照圖CaSR蛋白表達(免疫熒光，×600)

圖2　糖尿病模型組CaSR蛋白表達(免疫熒光，×600)

圖3　糖尿病NPS2390組蛋白表達(免疫熒光，×600)

3　討論

陰莖勃起的基礎(chǔ)是陰莖海綿體平滑肌的舒張。眾多證據(jù)提示，與其他血管組織一樣，陰莖海綿體平滑肌緊張性的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)是鉀通道、鈣通道。而Ca2 +是觸發(fā)肌細胞收縮的關(guān)鍵介質(zhì)，其阻滯細胞內(nèi)［Ca2 +］i的升高是導(dǎo)致平滑肌松弛的有效途徑。綜上所述，研究陰莖海綿體平滑肌細胞膜鈣通道對ED的發(fā)生機制有至關(guān)重要的作用［7］。鈣敏感受體(calcium－sensing receptor，CaSR)是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員。由Brown et al于1993年首次于牛甲狀旁腺克隆出CaSR。CaSR的主要作用是維持Ca2 +和其他金屬離子穩(wěn)態(tài)，也可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、離子通道開啟、激素分泌等。細胞外Ca2 +是CaSR的主要配體，而Mg2 +、Gd3 +、新霉素、精胺(spermine)等多價陽離子亦可是CaSR的激動劑［8］。實驗首先建立糖尿病大鼠模型，通過APO (100μg/kg)進行陰莖勃起，結(jié)果顯示糖尿病模型組陰莖勃起次數(shù)和勃起率降低，同時經(jīng)尾靜脈注射NPS2390(CaSR抑制劑)后，改善海綿體內(nèi)壓的降低?？芍蒘TZ誘發(fā)的DM可影響雄性大鼠的性功能，并可導(dǎo)致DMED，CaSR的激活顯著影響了糖尿病大鼠的性功能，進一步加重了DMED的發(fā)生。采用免疫熒光檢測大鼠陰莖海綿體平滑肌CaSR蛋白的表達。與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織中CaSR蛋白表達增加，而糖尿病NPS2390組增加不明顯。且通過免疫熒光實驗進一步證實了大鼠陰莖海綿體組織中CaSR的存在以及DMED時陰莖海綿體中CaSR表達增加。

本課題還研究了CaSR與大鼠陰莖海綿體毛細血管的關(guān)系，制取大鼠陰莖海綿體做石蠟切片，HE染色，觀察陰莖海綿體毛細血管數(shù)，并對比兩者改變。結(jié)果示:與正常組相比較，糖尿病及糖尿病NPS2390組的血管數(shù)目較低，并且糖尿病組的血管數(shù)目減低明顯，兩組比較有顯著的差異性。因此，2型糖尿病時NPS2390抑制CaSR后可遏制陰莖海綿體毛細血管的減少，緩解海綿體血供不足的問題，進而參與DMED的發(fā)生。由此可知，CaSR在DMED的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但對于該過程的具體調(diào)控和相關(guān)的分子機制以及是否涉及其它信號分子，是否還有其他途徑的參與，還需更深入的研究。

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(收稿日期:2015－01－04)

通訊作者:張鵬(1981～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生，主治醫(yī)師。E－mail: zhangpeng1981@163.com。

作者簡介:①秦文波(1956～)男，黑龍江寶清人，學(xué)士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

中圖分類號:R587.1

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－00102－03