鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)骨橋蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

段哲萍，于新江，吳大勇，李菁菁，趙娟

(1河北省人民醫(yī)院，石家莊050051；2河北醫(yī)科大學(xué))

鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)骨橋蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

段哲萍1，于新江1，吳大勇1，李菁菁2，趙娟2

(1河北省人民醫(yī)院，石家莊050051；2河北醫(yī)科大學(xué))

目的 觀察鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)骨橋蛋白(OPN)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用常規(guī)貼塊法分離培養(yǎng)SD大鼠VSMC，收集對(duì)數(shù)生長期的第3～5代細(xì)胞隨機(jī)分為14組，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，OPN組加入終濃度為20 mg/mL的OPN，鼠婦水提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物，OPN+鼠婦水提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，OPN+鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物，各組均培養(yǎng)24 h；采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況(OD值)，采用Western boltting法檢測細(xì)胞FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 OPN組OD值及FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于其他各組(P均<0.05)；OPN+各濃度鼠婦水提取物及OPN+各濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組OD值及FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于OPN組(P均<0.05)，各濃度組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖均具有抑制作用，抑制FAK胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)可能是二者共同的作用機(jī)制。

鼠婦水提取物；鼠婦乙酸乙酯提取物；骨橋蛋白；血管平滑肌細(xì)胞增殖；黏著斑激酶

血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)向血管內(nèi)膜下遷移、增殖，同時(shí)釋放細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是多種血管重塑性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。骨橋蛋白(OPN)可以誘導(dǎo)VSMC的增殖和遷移過程，黏著斑激酶(FAK)在這一過程中發(fā)揮重要作用[1]。鼠婦為無脊椎動(dòng)物節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱潮蟲亞目的俗稱，具有解毒、止痛、平喘、破血、利尿、通經(jīng)等作用[2～6]，但其對(duì)VSMC增殖的影響未見報(bào)道。2015年6～10月，本研究觀察了鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1 材料、方法與結(jié)果

1.1 材料 雄性SD大鼠1只，體質(zhì)量90～100 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；β-actin多抗、小鼠抗FAK單抗(sc-20019)和化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz公司；重組鼠OPN購自Sigma公司；鼠婦水提取物及鼠婦乙酸乙酯提取物由河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備、鑒定并測定濃度。

1.2 VSMC分離及培養(yǎng) 采用常規(guī)貼塊法分離培養(yǎng)SD大鼠VSMC。SD大鼠腹腔注射25%烏來糖2 mL行全身麻醉，取主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈分叉處血管離斷，放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，去除血管周圍脂肪及管腔內(nèi)殘留血液；清洗后的血管轉(zhuǎn)移到新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，縱向剪開血管，將血管壁剪成小于1.0 mm×1.0 mm的小片；將剪好的血管壁小片分成3份，分別貼于干凈的小培養(yǎng)瓶中，倒置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～3 h，使貼片穩(wěn)固貼于培養(yǎng)瓶；倒轉(zhuǎn)小培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液充分浸潤貼壁的血管小片，定期在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況；2～3天更換培養(yǎng)液，5～7天將原代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行傳代。

1.3 鼠婦對(duì)VSMC增殖能力的影響 收集對(duì)數(shù)生長期的第3～5代VSMC，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/mL，包埋于96孔板，隨機(jī)分為14組，對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，OPN組細(xì)胞加入終濃度為20 mg/mL的OPN，鼠婦水提物高、中、低劑量組分別加入終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物，OPN+鼠婦水提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，OPN+鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物；各組均于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，步驟參照試劑盒說明書。將各孔細(xì)胞置于酶聯(lián)免疫檢測儀，檢測490 nm波長處各孔吸光度值(OD值)。結(jié)果顯示，OPN組OD值高于其他各組(P均<0.05)；各濃度鼠婦水提取物及鼠婦乙酸乙酯提取物組OD值與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；OPN+各濃度鼠婦水提取物及OPN+各濃度鼠婦乙酸乙酯提取物+OPN組OD值均高于對(duì)照組(P均<0.05)、均低于OPN組(P均<0.05)；其余組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

1.4 鼠婦對(duì)VSMC FAK蛋白表達(dá)的影響 采用Western blotting法。采用RIPA裂解液提取1.3中對(duì)照組，OPN組，OPN+鼠婦水提取物高、中、低劑量組，OPN+鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組，培養(yǎng)24 h的細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定各組蛋白濃度。每組取80 g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，與特異性FAK一抗(1∶3 000)4 ℃孵育過夜，TTBS洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(1∶5 000)室溫孵育 1 h，洗膜后采用ECL化學(xué)發(fā)光法行電泳蛋白條帶顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄每組數(shù)據(jù)，測量各組條帶積分光密度值，與對(duì)應(yīng)的β-actin積分光密度值進(jìn)行比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，OPN組FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于其他各組(P均<0.05)；OPN+各濃度鼠婦水提取物組及OPN+各濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于OPN組(P均<0.05)，各濃度組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖情況及FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與OPN組比較，△P<0.05。

2 討論

VSMC的黏附、增殖和遷移等過程均有ECM成分參與，如纖連蛋白(FN)、OPN和多種生長因子等。細(xì)胞生物學(xué)研究證實(shí)，細(xì)胞黏附、鋪展及遷移是一系列精確周密的周期性動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，受多種胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的綜合調(diào)控，各條傳導(dǎo)通路之間相互作用、相互交叉。研究發(fā)現(xiàn)，ECM介導(dǎo)的整合素信號(hào)通路參與細(xì)胞的黏附、遷移過程[7]。整合素是一種跨膜受體，是由α和β兩個(gè)亞單位組成的異源二聚受體。VSMC表達(dá)整合素αvβ3，結(jié)合配體包括FN、OPN和玻連蛋白(VN)等。但是，整合素自身并不具有激酶活性，需經(jīng)由β亞單位胞內(nèi)區(qū)與FAK、整合素連接激酶(ILK)、talin及paxillin等相互作用后將其募集到胞膜內(nèi)側(cè)，共同組成黏著斑復(fù)合物，由此啟動(dòng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起VSMC的黏附和遷移，參與細(xì)胞骨架的重組，完成血管炎性增生和血管重塑等復(fù)雜過程[8,9]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦的主要藥理成分為蛋白質(zhì)、糖原、還原糖、黏多糖等多種飽和及不飽和脂肪酸。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦可治療小鼠心律失常，對(duì)其具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。臨床亦有用鼠婦治療慢性喘息性氣管炎、骨質(zhì)增生、尋常疣、口腔炎、癌痛、手術(shù)后疼痛等報(bào)道[2～6]。目前中藥有效成分的提取方法主要包括蒸餾法、酶提取法、酸堿法等，提取時(shí)主要采用葡萄糖、乙醇、水、乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑。但不同提取方法、不同提取溶劑、甚至不同濃度的同一種溶劑，提取回收率和有效成分含量存在極大差異[10,11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦水提取物及乙酸乙酯提取物對(duì)VSMC凋亡均無影響，本研究結(jié)果顯示二者單獨(dú)使用對(duì)VSMC增殖無明顯影響，說明這兩種鼠婦提取物對(duì)于正常生長的細(xì)胞是安全無害的；本研究亦發(fā)現(xiàn)，同時(shí)給予OPN和鼠婦水提取物或乙酸乙酯提取物，則這兩種提取物均可發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。由于兩種方法所提取的有效成分不同，故乙酸乙酯提取物隨濃度增高表現(xiàn)出對(duì)OPN刺激VSMC增殖的抑制作用愈強(qiáng)，而鼠婦水提取物隨濃度增高表現(xiàn)為對(duì)OPN刺激VSMC增殖的抑制作用愈弱，但組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

FAK是一種非受體型酪氨酸激酶，是細(xì)胞內(nèi)諸多信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯合點(diǎn)，參與細(xì)胞的遷移、黏附、鋪展、增殖和凋亡等過程[12]。在與細(xì)胞增殖等密切相關(guān)的眾多疾病(如心血管病、纖維類疾病、惡性腫瘤等)的病理發(fā)展過程中，F(xiàn)AK發(fā)揮至關(guān)重要的分子生物學(xué)作用。在血管再狹窄類疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，F(xiàn)AK的活化及表達(dá)均顯著增加，且FAK蛋白表達(dá)增加的程度與新生血管內(nèi)膜過度增生水平密切相關(guān)，提示FAK的活化和高表達(dá)促進(jìn)VSMC增殖。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OPN與位于VSMC表面的整合素相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的FAK信號(hào)分子，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移[13，14]。本研究結(jié)果顯示，OPN可促進(jìn)VSMC中FAK蛋白表達(dá)，鼠婦乙酸乙酯提取物和水提取物均可抑制OPN的上述作用；提示兩種鼠婦提取物可能均通過抑制FAK胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)而抑制VSMC的增殖。

總之，鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖均具有抑制作用，抑制FAK胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)可能是其共同作用機(jī)制。

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河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(20100164)。

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2016-01-12)