水稻半顯性矮稈基因Si－dd 1的表型分析和精細(xì)定位

崔永濤 吳立文 胡時(shí)開(kāi) 任德勇 葛常偉 葉衛(wèi)軍 董國(guó)軍 郭龍彪胡興明

（中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：guolongb＠m(xù)ail.hz.zj.cn；huxingmingx＠126.com）

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水稻半顯性矮稈基因Si－dd 1的表型分析和精細(xì)定位

崔永濤 吳立文 胡時(shí)開(kāi) 任德勇 葛常偉 葉衛(wèi)軍 董國(guó)軍 郭龍彪＊胡興明＊

（中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：guolongb＠m(xù)ail.hz.zj.cn；huxingmingx＠126.com）

崔永濤，吳立文，胡時(shí)開(kāi)，等.水稻半顯性矮稈基因Si－dd1的表型分析和精細(xì)定位.中國(guó)水稻科學(xué)，2016，30（2）：152－160.

摘 要：以粳稻品種日本晴在組織培養(yǎng)過(guò)程中分離出來(lái)的一個(gè)半顯性矮稈突變體Si－dd1為研究對(duì)象，通過(guò)形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與野生型日本晴相比，矮稈Si－dd1（AA）和半矮稈Si－dd1（Aa）植株的株高降低。結(jié)實(shí)率下降，生育期延長(zhǎng)，一次枝梗和二次枝梗增加。激素處理結(jié)果表明突變體Si－dd1（AA）與野生型對(duì)油菜素內(nèi)酯反應(yīng)基本相同，而在高濃度赤霉素處理下，突變體Si－dd1（AA）表現(xiàn)為一定程度上的鈍感。Western blot對(duì)GID2表達(dá)量分析也確定這一結(jié)果。組織切片實(shí)驗(yàn)表明，突變體Si－dd1（AA）相對(duì)于野生型葉片主脈氣孔變小，葉肉細(xì)胞增多，莖維管束數(shù)目增加。遺傳分析結(jié)果表明該突變體基因受一對(duì)核基因控制。進(jìn)一步利用分子標(biāo)記將該基因定位在水稻第6染色體約244kb區(qū)間內(nèi)，目前該區(qū)段并未發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的矮稈相關(guān)基因。

關(guān)鍵詞：水稻；半顯性；矮稈；遺傳分析；圖位克隆

株高是作物的重要農(nóng)藝性狀之一，與作物抗倒伏、產(chǎn)量等性狀密切相關(guān)。綠色革命是植株半矮化成功利用的典范。目前在水稻育種中廣泛利用的sd1［1］編碼一個(gè)缺陷的GA20氧化酶，該酶突變后植株內(nèi)源赤霉素含量降低，導(dǎo)致了植株半矮化，通過(guò)抗倒伏提高了產(chǎn)量。迄今為止在水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了很多矮稈突變體，雖然大多數(shù)矮稈突變體無(wú)法直接應(yīng)用到育種中，但是人們通過(guò)研究矮稈材料，對(duì)水稻矮稈的理化機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。

水稻矮稈突變體的類型非常豐富，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多矮稈基因，其中大多和激素如赤霉素、油菜素內(nèi)酯、獨(dú)腳金內(nèi)酯等相關(guān)。例如D1、SD1、SUI3、SUI1、DGL1、DBS1、D18、OsCPS1、GID2、GID 1、OsGA 20OX 1、SLR 1、D 35等屬于與赤霉素途徑相關(guān)的矮稈突變體［1－11］；基因D1、D61、D－2、SDG725、BRD2、TUD1、BRD1、D11、OsBZR1等參與油菜素內(nèi)酯的合成與信號(hào)傳遞［12－20］；基因D3、D10、D－14、HTD1、D53、D－27、FC1等參與獨(dú)腳金內(nèi)酯的合成與信號(hào)傳遞［21－27］；而基因OsGH3－2、TDD1等屬于生長(zhǎng)素途徑的突變體［28－29］。此外也發(fā)現(xiàn)了一些與激素不相關(guān)的矮稈基因，例如與細(xì)胞壁合成相關(guān)的矮稈基因D50、OsNST1、OsCD1，突變后都會(huì)導(dǎo)致植物矮化或半矮化［30－32］。這些現(xiàn)象說(shuō)明了水稻的株高受到很多因素的影響，因此，通過(guò)研究水稻矮稈突變體有助于人們更好地了解植株的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成。

本研究利用在日本晴組織培養(yǎng)過(guò)程中得到的一個(gè)穩(wěn)定遺傳的半顯性矮稈突變體（semi－dominant dwarf1，Si－dd1），對(duì)該突變體的形態(tài)學(xué)特征、對(duì)激素的反應(yīng)以及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了分析，同時(shí)對(duì)突變基因進(jìn)行了遺傳分析和精細(xì)定位，從而為Si－DD1基因的進(jìn)一步克隆與功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用的突變體是粳稻品種日本晴在組織培養(yǎng)過(guò)程中分離出來(lái)的一個(gè)半顯性矮稈突變體Sidd1。收獲突變體種子，持續(xù)多代自交種植，確定該突變體能夠穩(wěn)定遺傳，分別收獲矮稈突變體和半矮稈突變體。矮稈突變體是純合體，結(jié)實(shí)率低，產(chǎn)生的后代為完全顯性矮稈；半矮稈突變體是雜合體，結(jié)實(shí)率正常，后代可分離。所有材料均于正季種植于中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地，種植與管理方法同大田生產(chǎn)。在半矮稈突變體產(chǎn)生的分離群體中隨機(jī)選取野生型（WT）、半矮稈（Si－dd1，Aa）和矮稈（Sidd1，AA）各15株，調(diào)查株高、結(jié)實(shí)率、分蘗數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)等農(nóng)藝性狀。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2 遺傳分析和基因定位群體的構(gòu)建

在富陽(yáng)正季用Si－dd1（AA）分別與秈稻品種9311、南京6號(hào)（NJ06）正反交，同年冬天在海南種植F1，收獲F2種子，次年在富陽(yáng)種植F2群體。在F2群體中，分別調(diào)查顯性矮稈、半顯性矮稈和野生型植株的數(shù)目，同時(shí)用半顯性矮稈植株（Si－dd1，Aa）與9311、南京6號(hào)正反交，在F1中調(diào)查顯性矮稈、半顯性矮稈和野生型植株的數(shù)目。利用SAS軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，收取F2群體中高稈和顯性矮稈全部葉片，提取DNA用于分子標(biāo)記分析。

1.3 赤霉素和油菜素內(nèi)酯處理

收獲顯性矮稈Si－dd1（AA）和野生型植株的種子，用濕潤(rùn)的毛巾包好放到37℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)1～2 d。露白后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的Si－dd1（AA）和野生型的種子均勻播種于沙土中（不添加激素），待水稻幼苗長(zhǎng)至3葉期時(shí)，分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致的水稻用于水培實(shí)驗(yàn)。水培營(yíng)養(yǎng)液中加入不同濃度的GA3（最終濃度分別為0μmol／L、1×10－8μmol／L、1×10－7μmol／L、1×10－6μmol／L、1×10－5μmol／L、1×10－4μmol／L），以加入等量蒸餾水作對(duì)照，調(diào)pH值至5.0，每隔3d換一次培養(yǎng)液，并用同樣方法添加不同濃度的GA3，依次處理10d后，測(cè)量不同濃度處理后的水稻株高。另隨機(jī)挑選顯性矮稈Si－dd1 （AA）和野生型植株的種子，催芽后播種于沙土中，一周后用不同濃度的油菜素內(nèi)酯（最終濃度分別為0μmol／L、1×10－7μmol／L、1×10－6μmol／L、1× 10－5μmol／L）點(diǎn)于第1葉葉夾角處，一周后觀察第1葉葉夾角變化情況。

1.4 GA處理后GID2的蛋白表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探究該突變體在GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中是否起到作用，我們選取了GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)相關(guān)蛋白GID2作為研究對(duì)象，探究GA處理后GID2的表達(dá)量是否發(fā)生變化。對(duì)不同濃度GA3處理過(guò)后的WT和Si－dd1（AA）分別取樣，并提取蛋白，分別選取0mol／L、1×10－6mol／L、1× 10－4mol／L GA3處理后的WT和Si－dd1（AA）進(jìn)行Western blot分析，方法見(jiàn)文獻(xiàn)［34］。

1.5 石蠟切片分析觀察

在分蘗盛期選取新鮮、生長(zhǎng)正常且有代表性的矮稈Si－dd1（AA）和野生型植株的劍葉以及倒2節(jié)間，用鋒利的刀片用力均勻地切割材料，避免組織破裂，分別將水稻的葉和莖切割成3 mm左右大小。將切下來(lái)的材料立刻置于FAA固定液中（70%酒精∶冰醋酸∶36%甲醛的體積比為18∶1∶1）固定，此后石蠟切片具體操作方法見(jiàn)文獻(xiàn)［35］。

1.6 Si－DD1基因的精細(xì)定位

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的均勻分布于水稻12條染色體的SSR引物對(duì)突變體Si－dd1與9311、NJ06進(jìn)行多態(tài)性篩選，分別挑選Si－dd1／9311、Si－dd1／NJ06的F2植株中的高稈和矮稈葉片，提取DNA對(duì)Si－DD1展開(kāi)定位研究。首先用21個(gè)Si－dd1／NJ06中F2高稈單株進(jìn)行連鎖分析，初步確定目標(biāo)基因所在的染色體位置。進(jìn)一步在連鎖標(biāo)記附近開(kāi)發(fā)標(biāo)記，以2000個(gè)高稈和1200個(gè)矮稈材料進(jìn)行精細(xì)定位。基因組DNA采取CTAB法提?。?3］。PCR體系如下：模板DNA 1μL，正反向引物（10 μmol／L）0.5μL，dNTPs（10μmol／L）0.1μL，10× PCR緩沖液1μL，Taq酶0.2μL，加ddH2O補(bǔ)足10μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃下預(yù)變性2min；94℃下30s，56℃下30s（復(fù)性溫度根據(jù)引物Tm值作相應(yīng)調(diào)整），72℃下30s，進(jìn)行35次循環(huán)；72℃下延伸10min。PCR產(chǎn)物使用相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體Si－dd1的表型分析

在大田條件下，本研究中的半矮稈和矮稈材料在3葉期前與野生型并無(wú)太大差別。此后，株高差距開(kāi)始顯現(xiàn)，至抽穗后，差距達(dá)到最大。選取抽穗之后的野生型、Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）植株進(jìn)行表型觀察。相比野生型（WT），Si－dd1（Aa）和Sidd1（AA）基因型的植株株高都有所降低，其中Sidd1（Aa）材料株高相對(duì)于野生型下降20cm，而Sidd1（AA）材料株高明顯變矮，株高平均為40cm，約為野生型的一半（圖1－A、C、D，表1），Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）都呈現(xiàn)包穗表型（圖1－A）。此外，突變體生育期延長(zhǎng)，其中Si－dd1（Aa）生育期比野生型長(zhǎng)5d左右，Si－dd1（AA）生育期比野生型長(zhǎng)15 ～20d。3種表型植株分蘗數(shù)并無(wú)明顯差異，但是突變體穗頸節(jié)明顯縮短，穗粒明顯變密（圖1－B），并伴隨包穗的表型。野生型、Si－dd1（Aa）和Si－dd1 （AA）的一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)依次升高，結(jié)實(shí)率依次下降，Si－dd1（AA）下降尤為明顯（表1）。因此，該基因的突變除了影響株高外，對(duì)穗部產(chǎn)量性狀也產(chǎn)生了很大的影響。值得一提的是，Si－dd1（Aa）雖然結(jié)實(shí)率有所下降，但其總粒數(shù)有所增加，而且由于它為半矮稈，因此可能具有一定的育種價(jià)值。

2.2 突變體的遺傳分析

Si－dd1（Aa）F2群體植株的株高統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，其后代分離比WT∶Si－dd1（Aa）∶Si－dd1 （AA）呈現(xiàn)出1∶2∶1的分離比。用Si－dd1（AA）與9311、NJ06分別進(jìn)行正反交后發(fā)現(xiàn)F1代都呈現(xiàn)出半矮稈表型（表2）。F2群體中植株株高仍呈現(xiàn)出1∶2∶1的分離比；此外，用Si－dd1（Aa）作為母本與9311、NJ06雜交，F(xiàn)1群體并無(wú)Si－dd1（AA）的出現(xiàn)，只出現(xiàn)高稈和半矮稈，且比例呈1∶1（表3）。因此，本研究中的突變性狀是由半顯性、單基因控制的質(zhì)量性狀，且無(wú)胞質(zhì)效應(yīng)。

A－整株表型；B－穗表型；C－莖節(jié)間長(zhǎng)；D－各節(jié)間對(duì)比。從左至右依次為野生型、中間型和突變型。A，Whole plant；B，Panicle；C，Internode；D，Comparison of every internode.From left to right，wild type，Si－dd1（Aa）and Si－dd1（AA）in turn.圖1 Si－dd1突變體成熟期表型Fig.1.Phenotypes of Si－dd1 at maturation stage.

表1 野生型，Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）分蘗、株高及穗部性狀比較Table 1.Comparison of tiller，plant height and panicle traits among wild type，Si－dd1（Aa）and Si－dd1（AA）.

表2 Si－dd1（AA）與NJ06、9311組合F2的遺傳分析Table 2.Genetice analysis of F2population of Si－dd1（AA）／NJ06（9311）.

表3 雜合Si－dd1（Aa）與NJ06、9311組合F1遺傳分析Table 3.Genetice analysis of F1population of Si－dd1（Aa）／NJ06and Si－dd1（Aa）／9311.

2.3 目的基因的精細(xì)定位

我們對(duì)Si－dd1與9311、NJ06兩個(gè)秈稻品種雜交的4組F2群體表型進(jìn)行了觀察記錄以及分析，最終選用這4個(gè)F2群體中表現(xiàn)穩(wěn)定的高稈和矮稈用于后續(xù)的圖位克隆。我們所用的標(biāo)記引物是本試驗(yàn)室現(xiàn)有的均勻分布于水稻12條染色體上的SSR引物，共計(jì)216對(duì)。對(duì)矮稈、高稈、F1以及F2混池DNA進(jìn)行連鎖篩選（由于F2代呈1∶2∶1比例分布，因此，我們選取F2中顯性矮稈和野生型高稈作為定位群體取樣）。在以Si－dd1（AA）／NJ06顯性矮稈表型的F2混池進(jìn)行初定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，在第6染色體的引物標(biāo)記M1、M2以及M3處（表4），F(xiàn)1電泳呈現(xiàn)雙帶，而混池偏擴(kuò)增于Si－dd1（AA）的帶型；以高稈表型的F2混池進(jìn)行初定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，在同樣的引物標(biāo)記處，F(xiàn)1電泳條帶呈現(xiàn)雙帶，而混池偏擴(kuò)增于野生型帶型。利用這3對(duì)引物對(duì)Si－dd1（AA）／9311中 F2突變體表型群體的93個(gè)高稈單株進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確認(rèn)了該突變基因位于第6染色體的引物標(biāo)記M2和M3之間。

為進(jìn)一步對(duì)突變體基因進(jìn)行精細(xì)定位，我們擴(kuò)大了F2群體的數(shù)量，并且繼續(xù)在F2代植株中選取高稈和矮稈作為定位群體。根據(jù)NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）、RGP（http：／／rice.plantbiology.msu.edu／index.shtml）和Gramene（http：／／www.gramene.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)公布的9311序列和日本晴序列第6染色體上的序列開(kāi)發(fā)出若干位于M2和M3之間的多態(tài)性標(biāo)記（表5）。以初定位結(jié)果為基礎(chǔ)，篩選了以Si－dd1（AA）和9311為雙親的F2分離群體中高稈和矮稈個(gè)體用于基因的精細(xì)定位和物理作圖。最終將基因Si－DD1定位在標(biāo)記P3和P4之間，物理距離約為244kb（圖2）。此區(qū)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的矮稈相關(guān)基因。

表4 Si－DD1基因初定位的標(biāo)記Table 4.Makers for primary mapping of Si－DD1.

表5 Si－DD1基因精細(xì)定位的部分標(biāo)記Table 5.Makers for fine mapping of Si－DD1.

A－Si－DD1與標(biāo)記M2和M3連鎖；B－利用4500個(gè)分離單株將Si－DD1定位到244kb區(qū)段內(nèi)。A，Si－DD1 was linkaged with M2and M3；B，Si－DD1 was mapped to 244kb genome region based on 4500separated plants.圖2 Si－DD1的精細(xì)定位Fig.2.Fine mapping of Si－DD1.

2.4 激素處理結(jié)果

水稻植株變矮很多都是由于激素合成或信號(hào)傳導(dǎo)出現(xiàn)問(wèn)題，為了驗(yàn)證該突變體是否也是由于體內(nèi)某類激素反應(yīng)異常所致，我們選取了赤霉素和油菜素內(nèi)酯兩種激素作為研究對(duì)象，來(lái)探究該突變體是否和這兩種激素相關(guān)。激素處理結(jié)果表明不同濃度GA3處理WT和Si－dd1（AA）后，WT和Si－dd1 （AA）的株高都呈現(xiàn)逐日增高的趨勢(shì)，而當(dāng)GA3濃度增加到1×10－4mol／L后，WT和Si－dd1（AA）則出現(xiàn)一定程度的生長(zhǎng)抑制，說(shuō)明突變體與野生型在一定濃度的外源赤霉素處理?xiàng)l件下，兩者對(duì)赤霉素的反應(yīng)是基本相同的。值得指出的是，當(dāng)GA3濃度增加到1×10－4mol／L后，突變體受抑制程度相比野生型?。▓D3－A、B），暗示在高濃度下，突變體對(duì)赤霉素表現(xiàn)為鈍感。用BR處理后發(fā)現(xiàn)不同濃度BR處理WT和Si－dd1（AA），無(wú)論是WT還是Sidd1（AA）除了葉夾角都隨BR濃度增加而增加，而且增幅一致，說(shuō)明了該基因?qū)R反應(yīng)與野生型類似。此外，我們?cè)趯?duì)該突變體形態(tài)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該突變體突變類型與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的BR類型突變體大不相同，節(jié)間突變屬于sh類型，而不是dm這種典型的BR類突變體，因此，我們基本排除該突變體是BR類突變體（圖1－D，圖3－C）。

A－不同濃度赤霉素（GA）處理后表型；B－不同濃度GA處理后株高；C－不同濃度油菜素內(nèi)酯（BR）處理后葉夾角。WT，Wild type；GA，Gibberellic acid；BR，Brassinolide.A，Plant phenotype after GA treatment at different concentrations；B，Plant height after GA treatment at different concentrations；C，Leaf angle after BR treatment at different concentrations.圖3 Si－dd1突變體的GA，BR激素處理結(jié)果Fig.3.Si－dd1 exposed to GA and BR.

2.5 GID2蛋白表達(dá)量分析

為了進(jìn)一步探究該突變體在GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中是否起作用，我們選取了GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)相關(guān)蛋白GID2作為研究對(duì)象，探究GA處理后GID2的表達(dá)量是否發(fā)生變化。對(duì)不同濃度GA3處理過(guò)后的野生型（WT）和Si－dd1（AA）分別取樣，并提取蛋白，分別選取0 mol／L、1×10－4mol／L、1×10－6mol／L GA處理后的WT和Si－dd 1（AA）進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，WT和Si－dd1 （AA）中GID2蛋白表達(dá)量在0mol／L和1×10－6mol／L GA處理下并無(wú)太大差異，而隨著GA濃度升高，GID2蛋白在野生型中的表達(dá)量比突變體中少，說(shuō)明相對(duì)于野生型該突變體在高濃度條件下對(duì)GA3反應(yīng)鈍感（圖4）。

圖4 GID2蛋白表達(dá)量分析Fig.4.Expression analysis of GID2.

2.6 組織切片的觀察結(jié)果

為了探究突變體矮化的生理特征，我們分別選取了野生型、Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）植株的劍葉和倒2節(jié)間作為研究對(duì)象進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察。對(duì)劍葉的觀察發(fā)現(xiàn)，突變體Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）主葉脈氣腔和薄壁細(xì)胞等部位與野生型相比有差異。其中Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）中脈氣腔相比野生型變??；但是兩氣腔之間的薄壁細(xì)胞明顯變大，最終導(dǎo)致總面積增加，而其兩側(cè)的薄壁細(xì)胞并未出現(xiàn)明顯變化（圖5－A～C）。莖縱切分析表明Sidd1（Aa）和WT的細(xì)胞都呈規(guī)則形狀（矩形），而Si－dd1（AA）的細(xì)胞呈不規(guī)則排列，在單位面積下，WT、Si－dd1（Aa）、Si－dd1（AA）的細(xì)胞數(shù)目依次增多，細(xì)胞大小依次變小，但是變化并不明顯。根據(jù)WT、Si－dd1（Aa）、Si－dd1（AA）倒2節(jié)間長(zhǎng)度（圖1－D）推測(cè)，雖然突變體單位面積細(xì)胞數(shù)目增多，而整個(gè)倒2節(jié)間細(xì)胞數(shù)目卻明顯變少，因此，我們推測(cè)是細(xì)胞數(shù)目減少導(dǎo)致突變體的莖稈變矮（圖5－D～F）。莖的橫切面結(jié)構(gòu)一般由薄壁細(xì)胞和維管束組成，維管束均勻分布于薄壁細(xì)胞之間。對(duì)倒2節(jié)間的觀察表明，在Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）的外層薄壁細(xì)胞層數(shù)明顯比WT多；且維管束數(shù)目相比WT也有所增加（圖5－G～I(xiàn)）。

A，B，C－野生型（WT），Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）葉主脈橫切；D，E，F(xiàn)－野生型，Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）倒2節(jié)間縱切；G，H，I－野生型，Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）倒2節(jié)間橫切；J，K－維管束（1／4）和莖縱切細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)。A，B，C，Cross sections of leaf main vein of WT，Si－dd1（Aa）and Si－dd1（AA）；D，E，F(xiàn)，Longitudinal section of the second internode from the top of WT，Si－dd1（Aa）and Si－dd1（AA）；G，H，I，Cross sections of the second internode from the top of WT，Si－dd1（Aa）and Si－dd1（AA）.J，K，Numbers of vascular bundles and longitudinal stem cells.圖5 野生型，Si－dd1（Aa）和Si－dd1（AA）莖和葉的顯微結(jié)構(gòu)比較Fig.5.Comparison of microscopic structure among WT，Si－dd1（Aa）and Si－dd1（AA）.

3 討論

迄今為止，發(fā)現(xiàn)的矮稈突變體大部分和激素直接相關(guān)，例如赤霉素、油菜素內(nèi)酯、獨(dú)腳金內(nèi)酯等，但也有與激素不直接相關(guān)的矮稈突變體，如細(xì)胞壁合成相關(guān)突變體D50、OsNST1、OsCD1［30－32］。外源施用激素處理敏感的突變體一般屬于激素合成突變體，不敏感的屬于激素信號(hào)突變體。本研究中，激素處理和蛋白分析結(jié)果表明，半顯性矮稈突變體可能不屬于赤霉素或油菜素內(nèi)酯相關(guān)途徑突變體，這為矮稈資源又提供了一份寶貴的材料。我們對(duì)半顯性矮稈突變體進(jìn)行遺傳分析和分子標(biāo)記定位，把該矮稈基因定位在第6染色體短臂上的分子標(biāo)記P3和P4之間，物理距離約為244kb，該區(qū)段尚未有矮稈基因的報(bào)道。

本研究中，突變體和野生型對(duì)比，兩者地上節(jié)間數(shù)相同，除倒1節(jié)間縮短比例較小外，其余節(jié)間縮短的比例都很大，屬于典型的sh突變類型。根據(jù)石蠟切片觀察結(jié)果來(lái)看，相對(duì)于野生型，突變體倒2節(jié)細(xì)胞數(shù)目變少，說(shuō)明了突變體變矮可能是由細(xì)胞數(shù)目變少導(dǎo)致，在突變體生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞分裂速度受到了一定程度的抑制。

株高是作物重要的農(nóng)藝性狀之一，與作物的產(chǎn)量、抗倒伏、光合效率等密切相關(guān)。因此，株高一直受到育種家的重視，水稻第一次綠色革命就是水稻矮化運(yùn)用的典范，水稻半矮化協(xié)調(diào)了較高的水肥條件與易倒伏之間的矛盾，從而提高了收獲指數(shù)。然而，目前鑒定的大部分矮稈基因除了植株矮化外，都會(huì)伴隨一些不良性狀，很難在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。如小粒矮稈基因d1［11］、矮稈包穗基因eui2等［36－37］。本研究中雖然顯性突變體伴隨著很多不良性狀，如生育期延長(zhǎng)，著粒密度變密，結(jié)實(shí)率嚴(yán)重下降等，但其半矮稈突變體除株高降低外，其莖稈比野生型粗壯，且結(jié)實(shí)率下降不明顯，可以提高種植密度從而解決結(jié)實(shí)率問(wèn)題。因此可以考慮將該半顯性矮稈材料轉(zhuǎn)化為不育系，或許可以擴(kuò)大恢復(fù)系選擇范圍，提高配組效率，獲得更多優(yōu)良雜交組合。當(dāng)然在育種實(shí)踐中，該基因是否能夠?yàn)樯a(chǎn)提供效益還需要進(jìn)一步研究。

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Phenotypical Analysis and Fine Mapping of a Semi－dominant Dwarfism Gene Si－dd 1in Rice

CUI Yong－tao，WULi－wen，HUShi－kai，RENDe－yong，GEChang－wei，YE Wei－jun，DONGGuo－jun，GUOLong－biao＊，HUXing－ming＊
（State Key Laboratory of Rice Biology，China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China；＊Corresponding authors，E－mail：guolongb＠m(xù)ail.hz.zj.cn；huxingmingx＠126.com）

CUI Yongtao，WU Liwen，HU Shikai，et al.Phenotypical analysis and fine mapping of a semi－dominant dwarfism gene Si－dd1 in rice.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：152－160.

Abstract：A semi－dominant dwarf rice mutant（termed as Si－dd1）was obtained from japonica rice variety Nipponbare by tissue culture mutagenesis.Morphological analysis showed that Si－dd1（AA）and Si－dd1（Aa）exhibited shorter plant height，decreased seed－setting rate，delayed heading，increased number of primary rachis branch and secondary rachis branch compared to the wild type（WT，Nipponbare）.Physiological test results showed Si－dd1 had similar response to 24－Epibrassinosteroid to the WT，while it was insensitive to Gibberellin at 10(－4)μmol／L.Moreover，Western blot results also confirmed GID2expression level in Si－dd1 differed greatly from WT.The cytological analysis showed that Si－dd1 had smaller stomas in the leaf midrib，increased mesophyll cells and stem vascular bundles compared to WT.Genetic analysis and map－based clone showed that the Si－dd1 is controlled by a single semi－dominant gene，and locates in a 244kb region on chromosome 6.

Key words：rice；semi－dominant；dwarf；genetic analysis；map－based clone

中圖分類號(hào)：Q755；S511.01

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001－7216（2016）02－0152－09

基金項(xiàng)目：深圳市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（JCYJ20140504111101999）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271700，31461143014）。

收稿日期：2015－07－13；修改稿收到日期：2015－10－18。