HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物中的多種維生素方法

吳蓉

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210000）

HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物中的多種維生素方法

吳蓉

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210000）

采用等度洗脫反相高效液相色譜法，SunFireTMC18反相色譜柱，柱溫30℃，10mmol/L己烷磺酸鈉-乙腈（體積比為90∶10，pH=3.0）為流動(dòng)相，流速1mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量，建立同時(shí)測(cè)定復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物中維生素C、煙酸、煙酰胺、維生素B1、維生素B2和維生素B6（包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺）等多種B族維生素的高效液相色譜（HPLC）分析方法。結(jié)果表明，維生素C、煙酸、煙酰胺在0.000 2～0.050 0mg/mL，維生素B2、維生素B6在0.000 5～0.050 0mg/mL及維生素B1在0.000 8～0.050 0mg/mL范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4，精密度（RSD）0.88%～3.26%，回收率93.5%～101.0%。該法具有樣品前處理及上機(jī)操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、適用性廣等特點(diǎn)。

復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物；高效液相色譜法；紫外檢測(cè)器

維生素是參與人體代謝和生命活動(dòng)不可或缺的一類有機(jī)化合物，按照其物理性質(zhì)，可將其分為兩大類，脂溶性維生素和水溶性維生素[1]，而維生素C及B族維生素則是生活中最為常見的一種水溶性維生素，人們的生理生活均離不開它。因此，通過復(fù)合營(yíng)養(yǎng)食品攝取已成為補(bǔ)充人體維生素的一個(gè)重要渠道。

目前，在現(xiàn)有的國(guó)標(biāo)方法中，檢測(cè)食品中維生素C的方法主要是熒光分光光度法，檢測(cè)B族維生素的方法主要有微生物法[2]、紫外分光光度法[3]、熒光分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]。分光光度法普遍存在準(zhǔn)確度低、靈敏度差且檢測(cè)方法單一等缺點(diǎn)，因此未能被廣泛應(yīng)用于食品中；而微生物法則耗時(shí)太長(zhǎng)、干擾太大且操作繁瑣，所以也較少使用。因此，高效液相色譜法因其準(zhǔn)確度高、樣品前處理方法簡(jiǎn)單及儀器分析速度快，被廣泛應(yīng)用于食品中水溶性維生素的測(cè)定。

高效液相色譜儀配有紫外檢測(cè)器及熒光檢測(cè)器2種，在現(xiàn)有的國(guó)標(biāo)方法中，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器（HPLC-FLD）被廣泛應(yīng)用于維生素B1、維生素B2及維生素B6的測(cè)定，但實(shí)測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)比真實(shí)值高，回收率差；且該方法一次只能測(cè)定單一組分，對(duì)于多種B族維生素的測(cè)定存在較大困擾。因此，建立一種高效、準(zhǔn)確且同時(shí)測(cè)定多組分的方法已是刻不容緩。

本文采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLCDAD）等度洗脫同時(shí)測(cè)定復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物中的多種維生素，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，具有基線穩(wěn)定、分離度強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、樣品前處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。該方法的建立能夠?yàn)槭称分芯S生素C及B族維生素的測(cè)定提供準(zhǔn)確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物購于江蘇省南京市各大超市。濃鹽酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑；己烷磺酸鈉（色譜純），山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；乙腈（色譜純），德國(guó)默克股份兩合公司；甲醇（色譜純），德國(guó)默克股份兩合公司；水（超純水）；維生素C（純度≥99.3%）、維生素B1、維生素B6（包括咇哆醛、吡哆醇、吡多胺）、煙酸和煙酰胺（純度≥100%），Accustandard公司；維生素B2（純度≥98.9%），Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；2996型紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；XS 205DU型電子分析天平，美國(guó)梅特勒-托利多儀器公司；VM-8型渦旋儀，Blue Martin 公司；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；J-E型離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫爾特公司。

1.3 溶液的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取維生素C、煙酸、煙酰胺、咇哆醛、吡哆醇、吡多胺、維生素B2和維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品適量分別于10mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度均為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。按照試驗(yàn)所需要求，吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.01mol/L的鹽酸溶液逐級(jí)稀釋成所需的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以上操作均需避光。

1.3.2 鹽酸-甲醇溶液的制備

鹽酸-甲醇溶液（0.01mol/L）：吸取0.9mL濃鹽酸，溶于1 000mL水中，制成濃度為0.01mol/L的鹽酸溶液，再將其與甲醇以2∶8的比例混合均勻，即為20% 0.01mol/L鹽酸-甲醇溶液。

1.3.3 己烷磺酸鈉溶液的制備

己烷磺酸鈉溶液（10mmol/L）：準(zhǔn)確稱取1.88g己烷磺酸鈉，加800mL超純水溶解，用0.01mol/L鹽酸調(diào)pH為3.0，定容至1 000mL，混勻。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。

1.4 色譜條件

色譜柱，Agilent C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫30℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10μL；紫外檢測(cè)器（DAD）；檢測(cè)維生素C、煙酸、煙酰胺及維生素B1254nm，維生素B2及維生素B6280nm；流動(dòng)相，流動(dòng)性A為10mmol/L己烷磺酸鈉，B為乙腈，A∶B=90∶10，等度洗脫。

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎樣品1～5g（精確至0.000 1g）于50mL離心管中，試驗(yàn)需要避光操作，加入20%0.01mol/L鹽酸-甲醇溶液25mL，渦旋混勻，超聲30min，1萬r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜流動(dòng)相的優(yōu)化

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該試驗(yàn)可以采用己烷磺酸鈉-乙腈、磷酸二氫鉀-乙腈[1]作為流動(dòng)相。試驗(yàn)證明，采用磷酸二氫鉀-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，基線不穩(wěn)，且各組分并不能完全有效分離；而采用己烷磺酸鈉-乙腈時(shí)，不僅能夠達(dá)到較好的分離度，且準(zhǔn)確度高。因而，該試驗(yàn)最終采用己烷磺酸鈉-乙腈作流動(dòng)相。同時(shí)，以己烷磺酸鈉-甲醇作流動(dòng)相，分別采用梯度洗脫及等度洗脫，經(jīng)試驗(yàn)證明，梯度洗脫不僅基線不穩(wěn)且耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，該試驗(yàn)以己烷磺酸鈉-乙腈作流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，同時(shí)比較了多種等度洗脫條件，最終確定將己烷磺酸鈉與乙腈的比例調(diào)到90∶10，可以在35min內(nèi)有效地將8種水溶性維生素完全分離，且樣品分離效果良好，見圖1～4。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（254nm）

圖2 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（280nm）

圖3 樣品色譜圖（254nm）

圖4 樣品色譜圖（280nm）

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的簡(jiǎn)化

在現(xiàn)有的國(guó)標(biāo)方法中，前處理步驟復(fù)雜，如維生素B1及維生素B2的測(cè)定均要先調(diào)pH再過夜酶解，致使樣品回收率較低、準(zhǔn)確度不高且耗時(shí)長(zhǎng)。因此，該試驗(yàn)采用20% 0.01mol/L鹽酸-甲醇溶液作為提取液，直接提取且無需過夜酶解，能有效沉淀蛋白，將國(guó)標(biāo)中復(fù)雜的前處理步驟簡(jiǎn)化，且回收率高。

2.3 最低檢出限

吸取適量的維生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋，定容，配制成維生素標(biāo)準(zhǔn)混合液。其中，維生素C、煙酸、煙酰胺的濃度為50μg/mL，維生素B6、維生素B2、維生素B1的濃度為100μg/mL，用0.01mol/L鹽酸逐級(jí)稀釋成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（n=6），按照1.3.2的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合，以3倍信噪比（S/ N=3）計(jì)算儀器檢出限（LOD），測(cè)得各種維生素（維生素C、煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1）的檢出限（LOD）。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線及線性范圍

分別準(zhǔn)確吸取1.3.1中配制的維生素C、煙酸、煙酰胺、咇哆醛、吡哆醇、吡多胺、維生素B2和維生素B1標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，按1.4色譜條件，注入到高效液相色譜儀中，得到峰面積（或峰高），以峰面積（或峰高）為縱坐標(biāo)（Y），以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)（X），計(jì)算得到線性回歸方程，線性相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見表1。

表1 8種維生素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和線性范圍

2.5 精密度測(cè)定

準(zhǔn)確吸取8種維生素的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液10μg/mL，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.88%～3.26%，精密度很好，見表2。

2.6 回收率試驗(yàn)

稱取復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物樣品6份，按2種加標(biāo)量分別加標(biāo)，按照1.5節(jié)樣品前處理方法處理樣品后，按照1.4節(jié)色譜條件上機(jī)測(cè)定，測(cè)得復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物中各種維生素的加標(biāo)回收率及精密度（RSD）見表3。

表2 8種維生素的精密度結(jié)果

表3 樣品的回收率結(jié)果

3 結(jié)論

該文建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物中的多種維生素。結(jié)果表明，該法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度好、分離效果好、適用性廣等特點(diǎn)。該方法可以為復(fù)合營(yíng)養(yǎng)谷物中多種維生素的測(cè)定提供更加準(zhǔn)確的測(cè)定方法，從而為食品的安全及質(zhì)量提供更有力的技術(shù)保障。

[1]任丹丹,謝云峰,劉佳佳,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中9種水溶性維生素[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014,5(3):899-904.

[2]殷曉紅,楊金寶,劉波,等.微生物法測(cè)定食品中的煙酸和煙酰胺[J].中國(guó)乳品工業(yè),2003,31(2):32-35.

[3]吳秀生,張爽,張麗媛,等.紫外可見分光光度法測(cè)定維生素B1含量[J].黑龍江醫(yī)學(xué),2011,24(2):170-171.

[4]任一平,陳恒武,陳青俊,等.柱后光化學(xué)衍生熒光檢測(cè)高效液相色譜法測(cè)定食品中的維生素B1[J].分析化學(xué),2000,28(5):554-558.

[5]李莎.HPLC測(cè)定谷維素雙維B片中維生素B1和維生素B6的含量[J].中國(guó)生化藥物雜志,2010,31(3):176-178.

Simultaneous Determination of Vitamins in Compound Nutrition Grains by HPLC

Wu Rong
(Jiangsu Institute of Product Quality Supervision and Inspection,Jiangsu Nanjing 210000)

Using isocratic reversed-phase HPLC,SunFireTMC18 column,the column temperature was 30℃,10mmol/L sodium 1-octanesulfonate - acetonitrile (the volume ratio of 90∶10,pH=3.0) as mobile phase,flow rate 1mL/min,UV detector and quantified by external standard method,HPLC analysis method of simultaneous determination of composite grains of vitamin C,niacin,nicotinamide,vitamin B1,vitamin B2and vitamin B6(pyridoxine,pyridoxal,pyridoxamine including high performance liquid) and other vitamin B was established.The results showed that the linear relationship was in the range of 0.000 2～0.050 0mg/mL for vitamin C,nicotinic acid and nicotinamide,0.000 5～0.050 0mg/mL for vitamin B2and vitamin B6,0.000 8～0.050 0mg/mL for vitamin B1,the correlation coefficients were greater than 0.999 4,the precision (RSD) was from 0.88% to 3.26%,the recovery rate was from 93.5% to 101.0%.The method has the advantages of simple sample pretreatment,simple operation,good accuracy,high sensitivity and wide applicability.

Compound nutrition grain;High performance liquid chromatography;Ultraviolet detector

TS201

A

2096-0387（2016）06-0024-04

吳蓉（1990-），女，安徽省宣城市人，碩士，助理工程師，研究方向：環(huán)境工程。