不同產地苦丁茶質量標準研究

張玲玉 陳良 趙翡翠 姜林

摘要：目的 建立苦丁茶的質量控制標準，為藥用植物資源的開發(fā)和利用提供依據。方法 收集10批不同產地苦丁茶樣品，對苦丁茶性狀進行描述，對苦丁茶葉的橫切和粉末進行顯微鑒別，以綠原酸為對照品對苦丁茶進行薄層鑒別，測定10批苦丁茶樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分，采用高效液相色譜法對苦丁茶中綠原酸進行含量測定。結果 對苦丁茶的性狀、顯微特征進行了描述，制訂了苦丁茶中綠原酸的薄層色譜鑒別方法。檢查項中暫訂苦丁茶的水分不得超過13%，總灰分不得超過13%，酸不溶性灰分不得超過5%。確定了苦丁茶中綠原酸的含量測定方法，并根據測定結果暫訂本品含綠原酸不得低于0.60%。結論 本研究建立的方法可用于控制苦丁茶的質量。

關鍵詞：中藥產地；苦丁茶；綠原酸；質量標準

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0096-04

Study on Quality Standard of Leaf of Chinese Holly from Different Habitats ZHANG Ling-yu1， CHEN Liang2， ZHAO Fei-cui2， JIANG Lin2 （1. College of TCM， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 2. Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective To set up the quality control standard for Leaf of Chinese Holly； To provide basis for the utilization and development of Leaf of Chinese Holly. Methods Ten batches of Leaf of Chinese Holly samples from different habitats were collected， and the properties were described. The crosscutting and powder of leaf was under microscopic identification. Chlorogenic acid was set as reference substance to conduct thin-layer identification. Moisture， total ash， and acid-insoluble ash of the 10 batches were detected. HPLC was used to detect chlorogenic acid in Leaf of Chinese Holly. Results The properties and microscopic identification were described. Thin-layer chromatography method for chlorogenic acid in Leaf of Chinese Holly was formulated. Check items temporarily required that the moisture in Leaf of Chinese Holly should be less than 13%， total ash less than 13%， and acid-insoluble ash less than 5%. Content determination method for chlorogenic acid in Leaf of Chinese Holly was confirmed. It temporarily required that the content of chlorogenic acid should be more than 0.60%. Conclusion The established method can be used for the formulation of quality control of Leaf of Chinese Holly.

Key words： place of production （TCD）； Leaf of Chinese Holly； chlorogenic acid； quality standard

苦丁茶Llex kudingcha C. J. Tseng是冬青科冬青屬植物，多以嫩葉或葉入藥。苦丁茶主產于我國南方，以西南地區(qū)的四川、重慶等地及華南的江西、云南等地居多[1]?？喽〔杈哂猩蛑箍?、提神醒腦、清熱解毒、清火明目作用，有降壓降脂、保肝護肝、改善心腦血管血液循環(huán)及抗菌消炎等功效[2-5]。但苦丁茶的市場品種良莠不齊。目前苦丁茶只有地方標準，且僅有性狀和顯微的鑒別項，難以達到控制其藥材質量的目的。本試驗對苦丁茶的性狀及顯微進行研究，增加

薄層鑒別項、檢查項試驗，并采用高效液相色譜法（HPLC）對其主要成分綠原酸含量進行測定，使苦丁茶的質量標準更加完善。

1 儀器與試藥

Waters2489高效液相色譜儀，美國Waters公司；AG-135電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SI-234電子分析天平，丹佛儀器（北京）有限公司；DM3000B顯微成像系統(tǒng)，德國萊卡公司；SK250LHC超聲波清洗機，上?？茖С晝x器有限公司；Direct-QTM5超純水儀，Millipore公司；YOKO-ZS紫外線分析攝影儀，武漢藥科新技術開發(fā)公司；KDC-40低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中性分公司；QJGW-2型箱式電阻爐，煤炭科學研究總院北京煤化所煤質儀器研制中心；101A-2型干燥箱，上海市實驗儀器總廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠。

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201314），甲醇為色譜純，水為純水，其他試劑均為分析純。

苦丁茶樣品分別來自廣西、福建、四川、海南等不同產地，經新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥鑒定室李永和主任藥師鑒定為冬青科苦丁茶Llex kudingcha C. J. Tseng，樣品來源詳見表1。

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別

觀察不同產地的苦丁茶藥材，根據藥材實際進行性狀描述?？喽〔璩书L圓狀橢圓形，長約8～18 cm，寬約3～10 cm，邊緣鋸齒狀，主脈于上表面凹下，于下表面凸起，側脈每邊8～16條。葉柄直徑約2～3 mm。葉片厚，革質[6]。上表面灰黃色、灰綠色或灰棕色，有光澤，下表面黃綠色。氣微，味苦，微甘。

2.2 顯微鑒別

2.2.1 葉的橫切面 上表皮細胞最長為55 μm，寬8～18 μm，柵欄組織由2列細胞組成，約占葉肉的1/4，具草酸鈣簇晶，直徑約15～62 μm。外韌維管束腎形，韌皮部位于木質部下方及兩端，中柱鞘纖維較寬，位于韌皮部的外側。木質部發(fā)達，導管3～12個排列成行，射線1～2列。

2.2.2 粉末顯微鑒別 黃綠色至綠色。草酸鈣簇晶，直徑17～58 μm。氣孔環(huán)式及不定式[7]。螺紋及網紋導管，直徑10～40 μm。木薄壁細胞類長方形。

2.3 薄層色譜鑒別

苦丁茶含有多酚類兒茶素、黃酮類物質、咖啡堿等活性成分，其中多酚類中主要含綠原酸及其衍生物等[8]。薄層鑒別方法為：取苦丁茶藥材粉末0.5 g，加50%甲醇20 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，用甲醇作為溶劑，制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述對照品溶液和供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為醋酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.4 檢查項

參照2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅸ H和附錄Ⅸ K[9]測定法測定10批苦丁茶的水分、總灰分、酸不溶性灰分，結果見表2。根據10批樣品測定結果分析可知：水分測定結果最高值為11.23%，平均值為10.54%；總灰分測定結果最高值為11.56%，平均值為10.88%；酸不溶性灰分測定結果最高值為4.60%，平均值為4.09%。以上述結果為基礎，暫訂苦丁茶中水分應不得超過13%，總灰分不得超過13%，酸不溶性灰分不得超過5%。

2.5 綠原酸含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Symmetry ShieldTM Rp C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（15∶85），流速1.0 mL/min，檢測波長為327 nm，理論塔板數按綠原酸峰計算應不低于5000。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品適量，精密稱定0.4 mg對照品，置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含0.04 mg的溶液，即得。

2.5.3 供溶液品溶液制備 取苦丁茶藥材粉末（過二號篩）1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率180 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心，精密量取上清液1 mL，置5 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，過濾，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.5.5 線性關系考察 精密稱取綠原酸對照品4.6 mg，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，得對照品母液。精密吸取該母液0.25、0.5、1、2、3 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液10 μL，過濾，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標，對照品溶液的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=28 007.544 1X-18 960.088 9（r=0.999 9）。結果表明，綠原酸在0.115～1.38 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.6 精密度試驗 精密稱取苦丁茶藥材（批號141220）1 g，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，每次進樣10 μL，連續(xù)重復進樣6次，測定綠原酸峰面積，結果計算得峰面積RSD=0.95%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 重復性試驗 精密稱取苦丁茶藥材（批號141220）6份，每份1 g，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液6份，每次進樣10 μL，測定綠原酸含量，結果RSD=1.29%，表明重復性良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗 精密稱取苦丁茶藥材（批號141220），按“2.5.3”項下方法制備，置于室溫，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進行測定，記錄峰面積，結果綠原酸峰面積的RSD=1.3%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗 精密稱取苦丁茶藥材（批號141220），按“2.5.3”項下方法制備9份，各精密吸取1 mL溶液，分別定量加入綠原酸對照品，依法測定，結果加樣平均回收率為98.80%，RSD=1.33%，表明本方法回收率較好，見表3。

2.5.10 樣品含量測定 取不同批號、不同產地的樣品，按“2.5.3”項下方法配制供試品溶液各3份平行樣，依法測定峰面積，根據標準曲線計算樣品中綠原酸的含量，色譜圖見圖1，結果見表4。根據10批樣品的測定結果，暫定本品按干燥品計算，含綠原酸不得低于0.60%。

3 討論

本研究參照《廣西中藥材標準》對苦丁茶進行鑒別，粉末鑒別項下，苦丁茶中草酸鈣簇晶及螺紋導管和網紋導管量大而明顯，可作為鑒別的依據。

在苦丁茶薄層色譜鑒別研究中，參照2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）中茵陳的薄層鑒別方法[9]，分別以醋酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）、石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-丙酮（6∶3∶0.5）為展開劑試驗，結果以前者的展開系統(tǒng)斑點分離較清晰。

苦丁茶的主要成分為綠原酸，本研究參照2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）茵陳藥材項下綠原酸的含量測定方法，建立HPLC測定苦丁茶中綠原酸含量的方法，簡便、準確、重復性好，為苦丁茶的質量標準建立提供了一定的依據。試驗考察了回流和超聲2種提取方法，超聲和回流提取的有效成分含量相似，超聲較回流方法簡單，故選用超聲提取。根據10批樣品的測定結果，暫定本品按干燥品計算，含綠原酸（C16H18O9）不得低于0.60%，用于控制苦丁茶藥材的質量，為其資源的開發(fā)利用提供了依據。不同苦丁茶樣品中有效成分含量相差較大，可能與其采收時間、加工方式以及產地有關。

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