油橄欖加工廢液對(duì)小麥和玉米種子萌發(fā)及相關(guān)酶活性的影響

劉　娜,白萬(wàn)明,蘇玲玲,郭曉敏,孔維寶,3

( 1 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,蘭州 730070;2 隴南田園油橄欖科技開(kāi)發(fā)有限公司,甘肅隴南 746000;3 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,蘭州 730070)

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油橄欖加工廢液對(duì)小麥和玉米種子萌發(fā)及相關(guān)酶活性的影響

劉娜1,白萬(wàn)明2,蘇玲玲1,郭曉敏1,孔維寶1,3

( 1 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,蘭州 730070;2 隴南田園油橄欖科技開(kāi)發(fā)有限公司,甘肅隴南 746000;3 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,蘭州 730070)

摘要:用不同稀釋倍數(shù)的油橄欖加工廢液(OMWS)處理小麥和玉米種子,采用計(jì)數(shù)法、測(cè)量法和比色法測(cè)定了發(fā)芽率、根長(zhǎng)和相關(guān)生化參數(shù),以探索OMWS對(duì)種子萌發(fā)特性及相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明:不同稀釋倍數(shù)的OMWS對(duì)小麥和玉米種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和生長(zhǎng)存在不同程度的影響;低稀釋倍數(shù)(高濃度)的OMWS(原液和5倍稀釋液)在抑制種子發(fā)芽的同時(shí),對(duì)葉芽和根的生長(zhǎng)存在延緩甚至毒害作用;隨著稀釋倍數(shù)的提高(濃度降低),這種抑制作用逐漸減弱,而高稀釋倍數(shù)(30和50倍稀釋液)處理則表現(xiàn)出一定程度的促生作用,這種影響存在濃度依賴性。OMWS處理同樣可導(dǎo)致種子可溶性蛋白質(zhì)含量以及過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化,呈現(xiàn)高濃度抑制和低濃度誘導(dǎo)增強(qiáng)的趨勢(shì);OMWS處理后小麥和玉米根的生長(zhǎng)與POD和PAL活性存在明顯正相關(guān)性。研究認(rèn)為,OMWS對(duì)小麥和玉米種子的發(fā)芽及生長(zhǎng)存在高濃度抑制和低濃度誘導(dǎo)的雙重作用,并可能以多酚的影響為主;鑒于OMWS中多酚及其氧化產(chǎn)物可能產(chǎn)生的高濃度抑制、植物毒性和低濃度誘導(dǎo)化感作用,其在用做有機(jī)肥料或土壤改良劑時(shí)應(yīng)做適當(dāng)稀釋處理。

關(guān)鍵詞:油橄欖加工廢液;小麥;玉米;種子;發(fā)芽力;酶活性

油橄欖(OleaeuropaeaL.)是世界著名的木本油料樹(shù)種,其成熟果實(shí)經(jīng)物理壓榨分離后可制取橄欖油,橄欖油富含不飽和脂肪酸、酚類(lèi)物質(zhì)和脂溶性維生素等多種活性成分,是廣受世界人民青睞的高級(jí)食用植物油[1]。目前,在橄欖油加工過(guò)程中,油橄欖鮮果經(jīng)磨漿、離心分離、生產(chǎn)初榨橄欖油后產(chǎn)生大量的油橄欖加工廢棄物(OMW),其中含有可觀的果渣油、橄欖多酚和萜類(lèi)化合物等多種生物活性物質(zhì)。這一具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的加工副產(chǎn)物在國(guó)內(nèi)未能得到深入研究和有效利用,造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[2]。隨著中國(guó)油橄欖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,油橄欖種植面積、鮮果產(chǎn)量和國(guó)產(chǎn)橄欖油產(chǎn)量逐年增長(zhǎng),加之油橄欖果實(shí)加工的時(shí)間段相對(duì)集中,產(chǎn)生的OMW產(chǎn)量也隨之增加。對(duì)于國(guó)內(nèi)油橄欖加工企業(yè)來(lái)說(shuō),如何在生產(chǎn)橄欖油的同時(shí)開(kāi)發(fā)利用好OMW廢棄資源,是企業(yè)實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境雙重效益亟待考慮并解決的重要問(wèn)題[3-4]。

OMW中含有大量的植物營(yíng)養(yǎng)素,其最簡(jiǎn)單的利用方式是經(jīng)預(yù)處理(脫油脂、過(guò)濾、自然發(fā)酵或堆肥)之后直接還田用做有機(jī)肥料。但是因OMW中含有高濃度的多酚及其氧化產(chǎn)物,使其對(duì)土壤生物和植物有一定的植物毒性。Piotrowska等[5]研究發(fā)現(xiàn),施用OMW對(duì)土壤的短期影響主要表現(xiàn)為土壤物理、化學(xué)和生化特性的改變,例如微生物生物量、基礎(chǔ)呼吸、可溶性C和N、土壤水解酶和氧化還原酶活性的變化;同時(shí),由于OMW存在的植物毒性使西紅柿種子的發(fā)芽能力大大降低。Altieri等[6]以不同濃度(0,25%,50%,75%)的OMW作為泥碳替代物,評(píng)價(jià)其作為草莓無(wú)土栽培生長(zhǎng)基質(zhì)的可行性,結(jié)果表明雖然高濃度的OMW添加量(75%)可造成培養(yǎng)早期對(duì)草莓輕微的植物毒性,但是產(chǎn)量數(shù)據(jù)和組織分析結(jié)果顯示OMW可替代泥炭作為一種有效、廉價(jià)的無(wú)土栽培營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)OMW的有效脫毒,Annibale等[7]用香菇(Lentinulaedodes)處理OMW評(píng)價(jià)真菌的脫毒效果,硬質(zhì)小麥的發(fā)芽能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用香菇處理后OMW的植物毒性顯著降低;用未稀釋和稀釋2倍的經(jīng)香菇真菌脫毒處理后的OMW進(jìn)行小麥發(fā)芽實(shí)驗(yàn),其發(fā)芽率分別為34%和57%,而未經(jīng)真菌處理對(duì)照組的發(fā)芽幾乎完全被抑制。這說(shuō)明,OMW作為有機(jī)肥使用時(shí),須慎重考慮其對(duì)土壤生物、植物種子和植物體存在的毒性問(wèn)題。本試驗(yàn)以小麥和玉米種子為供試植物材料,研究國(guó)產(chǎn)油橄欖三相分離廢棄物之一——油橄欖加工廢液(OMWS)對(duì)種子萌發(fā)特性及其相關(guān)抗氧化酶活性的影響,以期為認(rèn)識(shí)OMWS對(duì)種子萌發(fā)特性的影響及其農(nóng)業(yè)還田循環(huán)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和應(yīng)用參考。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1材料與試劑小麥和玉米種子分別為市售‘隴春25號(hào)’和‘豫玉22號(hào)’種子。油橄欖加工廢液(OMWS)由隴南田園油橄欖科技開(kāi)發(fā)有限公司提供,廢液置于密封塑料桶中在4 ℃下存放。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水,HgCl2、磷酸鹽、Tris堿、HCl、H2O2、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、考馬斯亮藍(lán)-G250、L-苯丙氨酸等所有試劑均為分析純,牛血清蛋白為生化試劑。

1.1.2儀器設(shè)備主要包括培養(yǎng)皿、BS210S型分析天平(北京賽多利斯)、Labtech UV-8100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科)、CT15RT型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海天美)、奧立龍MODEL868型pH計(jì)(美國(guó)熱電)、GZP-250S光照恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏)和恒溫水浴鍋(江蘇金壇)。

1.2材料培養(yǎng)與處理

1.2.1油橄欖加工廢液(OMWS)浸種液的制備量取一定量OMWS,以5 000 g離心15 min,取上清液作為浸種原液,取適量浸種原液將其用無(wú)菌蒸餾水分別稀釋成不同濃度的OMWS,共設(shè)計(jì)原液(不稀釋)以及稀釋5、10、20、30、50倍6個(gè)處理液水平,處理液2 ℃低溫封存待用。測(cè)得OMWS浸種原液中總多酚和總糖含量分別為8.3和6.8 g·L-1,在不同稀釋倍數(shù)下處理液中的總多酚和總糖含量詳見(jiàn)圖1所示。

1.2.2種子的處理與培養(yǎng)分別將小麥和玉米種子分選清洗后先用0.1%的HgCl2溶液浸泡15 min消毒,再用蒸餾水反復(fù)沖洗3次,接著在20 ℃水浴鍋中用蒸餾水浸種吸水(小麥浸種12 h、玉米浸種24 h,中間換水間歇1次),然后隨機(jī)取種子置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中(小麥種子每皿50粒,玉米種子每皿20粒),分別用適量不同稀釋度的OMWS噴施,以蒸餾水作對(duì)照,在無(wú)光照、(18±2) ℃溫度下進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn),每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行組,每隔12 h噴4 mL OMWS處理液或蒸餾水(對(duì)照組)。每天觀察發(fā)芽及生根情況并做好記錄和計(jì)數(shù),發(fā)芽生長(zhǎng)10 d后結(jié)束培養(yǎng)。

1.2.3粗酶液的提取發(fā)芽結(jié)束時(shí)取小麥和玉米幼苗,用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈,再用濾紙吸干表面水分。將稱重后的樣品放入預(yù)冷的研缽中,加入約20倍(mL)預(yù)冷至4 ℃的提取液(pH 7.0,50 mmol·L-1磷酸緩沖液)和適量石英砂,充分研磨勻漿后將勻漿液移入50 mL離心管中,再用預(yù)冷的相同緩沖液洗滌完全研缽中的勻漿液,并一同移入離心管中,總提取液體積控制在40 mL左右,在4 ℃振蕩浸提30 min后以5 000 g離心20 min,取上清液用緩沖液定容至50 mL,適當(dāng)稀釋后做為測(cè)定蛋白質(zhì)和酶活力的試樣。

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1種子萌發(fā)指標(biāo)種子培養(yǎng)期間每天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)的粒數(shù),萌發(fā)以胚芽突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)芽率以每皿發(fā)芽種子數(shù)占總種子總數(shù)的百分比計(jì)。發(fā)芽勢(shì)以發(fā)芽3 d時(shí)發(fā)芽種子數(shù)占供試種子數(shù)的百分比計(jì)。發(fā)芽10 d結(jié)束時(shí),采用測(cè)量法測(cè)定發(fā)芽種子的根長(zhǎng)(cm)。

D0為原液,D5～D50分別表示原液稀釋5、10、20、30、50倍;下同

1.3.2蛋白質(zhì)含量吸取上述粗酶液樣品0.5 mL,加蒸餾水0.5 mL,加5 mL考馬斯亮蘭染液,充分混合均勻,放置2～5 min后,以加1 mL水和5 mL染液試管作為空白對(duì)照,用1 cm光程比色杯在595 nm下測(cè)定光密度A595,計(jì)算蛋白質(zhì)含量,單位表示為mg·g-1(鮮重)[8]。以不同濃度牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定其相應(yīng)光密度值A(chǔ)595,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到OMWS廢液中蛋白質(zhì)含量的計(jì)算公式:C=499.49A-1.031 7(R2=0.993 4)。式中,C為蛋白質(zhì)含量(mg·L-1),A為595 nm下的吸光值。

1.3.3酶活性相關(guān)酶活力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[8],并作適當(dāng)改良。

(1)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性準(zhǔn)確吸取2.5 mL pH 7.0、50 mmol·L-1磷酸緩沖液和0.4 mL 0.1 mol·L-1H2O2,加入0.1 mL 粗酶液樣品后迅速搖勻啟動(dòng)反應(yīng),每隔30 s記錄1次240 nm處的吸光值A(chǔ)240,記錄3 min,以每分鐘A240下降0.1計(jì)為1個(gè)酶活力單位U,結(jié)果以U·g-1(鮮重)表示。

(2)過(guò)氧化物酶(POD)活性準(zhǔn)確吸取2.5 mL pH 7.0 50 mmol·L-1磷酸緩沖液和0.4 mL 0.1 mol·L-1愈創(chuàng)木酚(含5 mmol·L-1H2O2),加入0.1 mL試樣粗酶液迅速搖勻后啟動(dòng)反應(yīng),每隔30 s記錄1次470 nm處的吸光值A(chǔ)470,記錄3 min,以每分鐘A470上升0.1計(jì)為1 U,結(jié)果以U·g-1(鮮重)表示。

(3)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在試管中加入1.5 mL 0.1 mol·L-1pH 8.8 的Tris-HCl緩沖液,再加入1 mL 0.1 mol·L-1的L-苯丙氨酸底物,加入0.5 mL試樣粗酶液,搖勻后在37 ℃水浴中反應(yīng)1 h,反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定290 nm處的吸光值A(chǔ)290,以1 mL 0.1 mol·L-1的L-苯丙氨酸加2 mL 0.1 mol·L-1pH 8.8的Tris-HCl緩沖液的試管作為空白對(duì)照。以每小時(shí)A290上升0.01計(jì)為1個(gè)酶活力單位U,結(jié)果以U·g-1(鮮重)表示。

1.4數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)和繪圖,用Origin Pro 8.0軟件做顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度OMWS處理對(duì)小麥和玉米種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)的影響

不同濃度OMWS處理對(duì)小麥種子的萌發(fā)有一定的影響。OMWS處理液在高濃度(如原液、D5)時(shí)對(duì)初期小麥種子的萌發(fā)有一定的抑制作用,而隨著稀釋倍數(shù)的增大,這種抑制作用隨之減緩。小麥種子萌發(fā)期間用原液直接處理的種子,雖然在初期得以萌發(fā),但后期因持續(xù)處理卻使已萌發(fā)的種子大部分死亡,不能正常生長(zhǎng)(圖2,A中用虛線示意部分),而其他濃度處理組的小麥種子發(fā)芽率均達(dá)到了100%(圖2,A)。另外,除OMWS原液處理組的小麥種子發(fā)芽勢(shì)為83.3%之外,其他處理組均達(dá)到了100%(圖2,C)。說(shuō)明適當(dāng)稀釋后的OMWS對(duì)小麥種子的發(fā)芽影響較小,同時(shí)也表明實(shí)驗(yàn)用小麥種子的活力較強(qiáng)、發(fā)芽整齊度較高。

同時(shí),不同濃度OMWS處理對(duì)玉米種子發(fā)芽的影響也較為顯著,且OMWS的處理濃度越高(即稀釋倍數(shù)越小),抑制玉米種子發(fā)芽和延遲萌發(fā)的作用越明顯(圖2,B)。其中,高濃度的OMWS處理玉米種子后,其萌發(fā)特性和小麥種子類(lèi)似,起始萌發(fā)的種子經(jīng)OMWS持續(xù)處理后部分死亡;而隨著OMWS處理濃度的降低,玉米種子的發(fā)芽率逐漸升高,D50處理組的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照組基本持平。由圖2,C可知,與小麥種子的發(fā)芽勢(shì)表現(xiàn)不同,玉米種子發(fā)芽勢(shì)在不同濃度處理組別之間存在較大差異,反映出不同濃度OMWS處理對(duì)其發(fā)芽存在的抑制作用,導(dǎo)致供試玉米種子發(fā)芽的整齊度差異較大。由圖2也反映出小麥種子的萌發(fā)時(shí)間較短,在發(fā)芽第2天即完全萌發(fā),而玉米種子萌發(fā)的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),在發(fā)芽第5天發(fā)芽率趨于恒定。

2.2不同濃度OMWS處理對(duì)小麥和玉米幼苗葉芽生長(zhǎng)及生根的影響

從發(fā)芽10 d時(shí)各濃度處理組的典型性幼苗表現(xiàn)來(lái)看,不同濃度OMWS處理對(duì)小麥和玉米種子葉芽生長(zhǎng)和生根作用的影響顯著(圖3)。與對(duì)照組相比,小麥和玉米種子萌發(fā)后其葉芽和根的生長(zhǎng)與OMWS的處理濃度存在很高的相關(guān)性,即OMWS稀釋倍數(shù)越小、濃度越高,葉芽和根的長(zhǎng)度越短,而且OMWS處理組的葉芽和根相比于對(duì)照組要粗壯一些。以上結(jié)果表明,OMWS處理對(duì)小麥和玉米的葉芽生長(zhǎng)和生根有較大影響,較高濃度的OMWS在抑制和延緩種子萌發(fā)的同時(shí),還抑制了葉芽和根的生長(zhǎng);而OMWS稀釋度較高、濃度較低的處理組(如D30和D50),對(duì)小麥和玉米葉芽和根的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用;這種抑制或促進(jìn)作用存在明顯的OMWS濃度依賴性。

進(jìn)一步的根長(zhǎng)調(diào)查結(jié)果顯示,不同濃度OMWS處理對(duì)小麥和玉米種子發(fā)芽后的生根作用影響顯著(圖4);與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組測(cè)得平均根長(zhǎng)均存在顯著性差異(P<0.05)。OMWS原液持續(xù)處理最終導(dǎo)致已發(fā)芽小麥種子的死亡,因此未能進(jìn)行取樣測(cè)試。其中,小麥D5和D10處理組的根長(zhǎng)分別顯著小于對(duì)照組96.5%和55.4%,而小麥D20、D30和D50組的根長(zhǎng)分別顯著大于對(duì)照組71.5%、109.7%和172.2%;玉米原液組、D5、D10、D20和D30組的根長(zhǎng)均顯著小于對(duì)照組,降幅為98.3%～41.7%,只有D50組的根長(zhǎng)顯著大于對(duì)照組,增幅為16.7%。綜上結(jié)果可知,OMWS對(duì)小麥、玉米種子的發(fā)芽特性和生根的影響作用存在顯著的濃度依賴性,高濃度的OMWS在抑制種子發(fā)芽的同時(shí)也抑制根的生長(zhǎng),而使用較低濃度的OMWS處理(如D50)對(duì)種子的發(fā)芽影響較小,而且表現(xiàn)出一定的促進(jìn)生長(zhǎng)效果。

不同小寫(xiě)字母表示處理組間在0.05水平存在顯著性差異;下同

2.3不同濃度OMWS處理對(duì)小麥和玉米全株幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

圖5結(jié)果顯示,不同濃度的OMWS處理對(duì)發(fā)芽結(jié)束時(shí)小麥和玉米全株幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量有不同程度的影響。其中,小麥幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量在高濃度OMWS處理組(原液組、D5和D10)與對(duì)照組存在顯著性差異,原液組顯著低于對(duì)照15.6%,D5和D10處理組分別顯著高于對(duì)照16.6%和14.3%,而其余處理組與對(duì)照組不存在顯著性差異;玉米幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量在原液、D5、D30、D50組處理下均顯著低于對(duì)照,降幅為39.6%～8.4%,在D10處理下卻顯著高于對(duì)照8.5%,而在D20組處理下與對(duì)照的含量相當(dāng)。以上結(jié)果說(shuō)明不同濃度的OMWS處理時(shí)導(dǎo)致種子處于不同的發(fā)芽態(tài)勢(shì),導(dǎo)致其蛋白質(zhì)分解程度的差異,進(jìn)而導(dǎo)致全株幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的差異。

圖3　不同OMWS處理組中小麥和玉米

圖4　不同濃度OMWS對(duì)小麥和

2.4不同濃度OMWS處理對(duì)小麥和玉米幼苗相關(guān)酶活性的影響

各實(shí)驗(yàn)組全株幼苗發(fā)芽結(jié)束時(shí)抗氧化和生根相關(guān)的酶活性如圖6所示。首先,不同濃度OMWS處理對(duì)小麥和玉米幼苗過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響顯著(圖6,A)。小麥和玉米幼苗的CAT活性在不同濃度OMWS處理下均顯著低于對(duì)照組,降幅分別為90.5%～41.1%和88.5%～12.3%,而且隨著OMWS處理濃度的降低總體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì);在OMWS處理組中,兩種作物幼苗CAT活性均以原液組呈現(xiàn)最低,而小麥幼苗CAT活性以D20和D30處理組的相對(duì)較高,玉米幼苗CAT活性則以D10組的相對(duì)較高。其次,小麥和玉米幼苗過(guò)氧化物酶(POD)活性均隨著OMWS處理濃度的降低(即稀釋倍數(shù)的增大)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì);各OMWS處理中,小麥和玉米幼苗的POD活性在原液、D5和D10組均顯著低于對(duì)照,小麥幼苗D20組和玉米幼苗的D20、D30處理組與對(duì)照無(wú)顯著差異,小麥幼苗D30、D50處理組和玉米幼苗的D50處理組均顯著高于對(duì)照組(圖6,B)。此外,小麥和玉米幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在不同濃度OMWS處理下的變化趨勢(shì)與POD活性類(lèi)似,即隨著OMWS處理濃度的降低均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì);幼苗PAL活性均在D20濃度時(shí)與對(duì)照組相當(dāng),處理濃度低于D20時(shí)顯著高于對(duì)照,處理濃度高于D20時(shí)顯著低于對(duì)照(圖6,C)。以上結(jié)果說(shuō)明OMWS處理在影響小麥和玉米種子萌發(fā)的同時(shí),也從生理生化水平上影響幼苗抗氧化酶及相關(guān)酶活性,而且其影響程度也隨著OMWS處理濃度的高低而存在差異。

圖5　小麥和玉米幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量

圖6　不同濃度OMWS處理下小麥和玉米

3討論

OMWS的主要成分為水、酚類(lèi)物質(zhì)、糖類(lèi)、有機(jī)酸和礦物質(zhì)等,其化學(xué)需氧量和生物需氧量高,有機(jī)物含量高、可生化處理特性強(qiáng),富含生物活性物質(zhì),可開(kāi)發(fā)利用價(jià)值高[9]。OMWS中酚類(lèi)物質(zhì)的主要種類(lèi)有苯醇類(lèi)(羥基酪醇)、環(huán)烯醚萜類(lèi)(橄欖苦苷)、酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)等[10]。OMWS用作有機(jī)肥或土壤改良劑時(shí),主要利用其中有益的有機(jī)碳、氮和礦物質(zhì)等,而其中存在的高濃度多酚及其氧化產(chǎn)物對(duì)土壤生物和植物存在一定的植物毒性,應(yīng)通過(guò)一定的預(yù)處理方式降低其毒性[11]。研究顯示酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)苜蓿種子萌發(fā)存在顯著的濃度依賴性,而且因種類(lèi)差異而存在不同程度的影響;在高濃度下(10-3mol·L-1),阿魏酸、香豆素、香草酸和香豆酸4種酚酸對(duì)苜蓿種子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用,其抑制作用隨著濃度的降低而逐漸減弱[12]。

首先,本研究中用不同濃度的OMWS處理小麥和玉米種子會(huì)對(duì)其萌發(fā)特性(發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì))產(chǎn)生不同程度的影響。其中,高濃度的OMWS中因含有較高濃度的多酚(如原液組含量為8.3 g·L-1,D5組含量為1.66 g·L-1)會(huì)使種子萌發(fā)受到抑制(甚至產(chǎn)生毒害),導(dǎo)致已萌發(fā)的小麥和玉米種子在持續(xù)的處理過(guò)程中全部或部分死亡;而隨著OMWS處理濃度的降低,這種抑制作用逐漸減弱,相反在較低濃度(D30,0.28 g·L-1;D50,0.17 g·L-1)處理組種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照組相當(dāng)或略高。這主要是由于OMWS中高濃度多酚對(duì)種子萌發(fā)存在抑制作用,低濃度酚類(lèi)物質(zhì)存在一定的化感促生作用,而且其中含有的糖類(lèi)和礦物質(zhì)為種子萌發(fā)及生長(zhǎng)提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。OMWS中的高濃度多酚對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)產(chǎn)生的毒性可能源于3個(gè)方面[12]:(1)高濃度多酚及氧化產(chǎn)物抑制種子萌發(fā)所需的關(guān)鍵酶類(lèi)及細(xì)胞分裂,使種子萌發(fā)過(guò)程缺乏必須的能量以及合成代謝所需的中間產(chǎn)物,從而降低種子活力、抑制其萌發(fā);(2)高濃度多酚改變種子萌發(fā)時(shí)種皮的滲透性以及種子的吸水作用,增加種子內(nèi)部物質(zhì)的大量滲透;(3)高濃度處理液中的糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致微生物污染、生物酸化,從而造成種子腐爛或產(chǎn)生毒害。

其次,本研究中用不同濃度的OMWS持續(xù)處理小麥和玉米種子時(shí),其在影響萌發(fā)特性的同時(shí)還影響生根和葉芽的生長(zhǎng)。高濃度的OMWS在抑制萌發(fā)率和發(fā)芽勢(shì)的同時(shí)還抑制根和葉芽的生長(zhǎng),而隨著OMWS濃度的降低這種抑制作用逐漸消除。幼苗根和葉芽的生長(zhǎng)與OMWS的稀釋倍數(shù)存在較高的相關(guān)性,小麥和玉米幼苗根的長(zhǎng)度與OMWS稀釋倍數(shù)的相關(guān)系數(shù)r分別為0.961和0.994,與多酚濃度的相關(guān)系數(shù)分別為-0.588和-0.602。這一結(jié)果提示OMW作為土壤改良劑時(shí)對(duì)植物存在較強(qiáng)的化感作用,因酚類(lèi)物質(zhì)的濃度不同而對(duì)植株的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響,外觀方面反映在幼苗根和葉芽的生長(zhǎng)上。宋亮等[12]研究發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)苜蓿幼苗生物量的影響同樣存在濃度依賴性。高濃度(10-3mol·L-1)的酚酸均顯著降低苜蓿幼苗地下生物量,而低濃度組(10-6mol·L-1)則表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用;酚酸化感物質(zhì)處理苜蓿幼苗后,隨濃度的增加幼苗的地上及地下鮮重與對(duì)照相比逐漸降低。另有研究顯示[13],二硝基重氮酚廢水中的硝基酚類(lèi)化合物污染土壤對(duì)上海青和小白菜2種蔬菜種子萌發(fā)與生長(zhǎng)存在明顯的濃度梯度影響。土壤硝基酚類(lèi)化合物含量在0～12 mg·kg-1時(shí)對(duì)上海青、小白菜的發(fā)芽率有不顯著的促進(jìn)作用,超過(guò)24 mg·kg-1時(shí)對(duì)上海青發(fā)芽率產(chǎn)生明顯抑制,達(dá)到36 mg·kg-1時(shí)明顯抑制小白菜發(fā)芽率;污染土壤中硝基酚類(lèi)化合物含量與2種蔬菜根和芽伸長(zhǎng)抑制率呈顯著線性相關(guān)。酚酸對(duì)大豆種子萌發(fā)亦有影響,苯甲酸、肉桂酸、香草酸、2種混合酚酸及3種混合酚酸的協(xié)同處理均不同程度地抑制大豆種子的萌發(fā),不僅降低其萌發(fā)率,胚根長(zhǎng)和干重也有不同程度的降低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果相似。

第三,OMWS處理同樣影響小麥和玉米幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量及CAT、POD和PAL活性。在發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),較高濃度的OMWS原液處理嚴(yán)重抑制種子的萌發(fā)能力,導(dǎo)致種子蛋白質(zhì)酶解作用受阻;中等濃度OMWS處理(D10)在適度抑制和延緩種子萌發(fā)的同時(shí),造成蛋白質(zhì)水解和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的緩慢進(jìn)行,使其可溶性蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高;而低濃度OMWS處理組在促進(jìn)種子萌發(fā)的同時(shí),使較多的種子蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化合成其它幼苗生長(zhǎng)所需的物質(zhì),進(jìn)而導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)含量降低。Roshchina等[15]研究了酚酸對(duì)大豆等4種種子的化感作用,認(rèn)為對(duì)羥基苯甲酸和香草酸等化感物質(zhì)通過(guò)抑制受體植物的抗氧化酶(SOD和CAT)活性,導(dǎo)致體內(nèi)活性氧增多,造成膜質(zhì)過(guò)氧化,從而破壞膜結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比,本研究中OMWS處理對(duì)小麥和玉米幼苗CAT、POD和PAL活性有不同程度的影響,且在高濃度條件下抑制作用顯著;與對(duì)照組相比,隨著OMWS濃度的降低,CAT活性呈先升后降,而POD和PAL活性呈逐漸增高趨勢(shì)。這種抑制主要和OMWS中存在的酚類(lèi)物質(zhì)等對(duì)種子的發(fā)芽與生長(zhǎng)存在化感作用相關(guān)。分析認(rèn)為,在不同濃度OMWS處理?xiàng)l件下,發(fā)芽結(jié)束時(shí)各組的幼苗處于不同的生長(zhǎng)階段:高濃度組(原液和D5)抑制作用顯著導(dǎo)致種子死亡或發(fā)芽遲緩,中濃度(D10和D20)組雖有抑制延緩作用但種子能正常生長(zhǎng),而低濃度(D30和D50)組存在一定的誘導(dǎo)作用使種子萌發(fā)和生長(zhǎng)相對(duì)較快。在OMWS作用下使種子處于不同的發(fā)芽程度是導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)組酶活性存在較大差異的原因之一。另一原因可能和OMWS處理液中不同濃度的還原性酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)CAT、POD和PAL活性存在一定的抑制或誘導(dǎo)作用有關(guān)。種子活力、生長(zhǎng)特性與OMWS中多酚的濃度直接造成幼苗酶活性的差異。這一結(jié)果與酚酸物質(zhì)對(duì)苜蓿幼苗POD活性的影響方式類(lèi)似[12],即總體呈現(xiàn)高濃度抑制和低濃度誘導(dǎo)的趨勢(shì)。而CAT活性在低濃度組(D30和D50)逐漸降低可能歸因于OMWS中適宜濃度的多酚為種子發(fā)芽和生長(zhǎng)提供了良好的抗氧化物質(zhì)和還原力,進(jìn)而抑制了CAT的活性。

另外,本研究發(fā)現(xiàn),整株P(guān)OD和PAL活性的變化趨勢(shì)與幼苗生根存在高度的相關(guān)性。其中,根長(zhǎng)與其POD和PAL活性的相關(guān)系數(shù)在小麥中分別為0.827和0.740,在玉米中則分別為0.717和0.722;隨著OMWS濃度的降低,小麥和玉米的根長(zhǎng)不斷增加,POD和PAL的活性也不斷升高。這一結(jié)果反映出POD和PAL在植株生根過(guò)程中存在促進(jìn)作用。蔣小滿等[16]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)南瓜組培苗不定根形成過(guò)程中,POD活性及同工酶譜的變化與生根作用密切相關(guān),不定根形成時(shí)POD活性迅速升高。POD活性與光葉楮扦插根的生長(zhǎng)和延伸同樣存在密切關(guān)系[17]。PAL是苯丙烷類(lèi)化合物生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶,同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)植物體合成木質(zhì)素具有重要作用,因此PAL的活性直接影響植株體內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)合成和根的生長(zhǎng)[18]。

綜上所述,OMWS中存在的多種酚類(lèi)物質(zhì)直接通過(guò)化感作用影響小麥和玉米種子的萌發(fā)、幼苗和根的生長(zhǎng),以及幼苗蛋白質(zhì)含量和相關(guān)酶(CAT、POD和PAL)活性,而且這種影響存在高度的濃度依賴性。OMWS中存在的多酚和糖類(lèi)物質(zhì)等對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)存在雙重作用和影響,即在高濃度處理時(shí)多酚對(duì)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制和毒害作用占主導(dǎo)地位,而在低濃度處理時(shí)其中的酚類(lèi)物質(zhì)、多糖和礦物質(zhì)等通過(guò)協(xié)同化感作用產(chǎn)生促進(jìn)作用。由此導(dǎo)致的種子發(fā)芽程度的不同進(jìn)一步造成其生理生化參數(shù)的改變,最終影響幼苗的生長(zhǎng)和生根作用。這一結(jié)果暗示OMWS作為有機(jī)肥或改良劑施用時(shí)應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屘幚硪越档蛯?duì)植物的毒害作用,而在較低濃度水平施用可起到良好的化感作用和促生效果。今后進(jìn)一步將從OMWS組成分析、微生物發(fā)酵預(yù)處理及其對(duì)土壤理化特性、土壤生物種類(lèi)和豐度、植株地上/地下生物量的影響等方面進(jìn)行探討。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Effect of Olive Mill Wastewater on the Germinability and Related Enzyme Activities of Wheat and Maize Seeds

LIU Na1,BAI Wanming2,SU Lingling1,GUO Xiaomin1,KONG Weibao1,3

(1 College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China;2 Longnan Tianyuan Olive S&T Development Co.,Ltd.,Longnan,Gansu 746000,China;3 Bioactive Products Engineering Research Center for Gansu Distinctive Plants,Lanzhou 730070,China)

Abstract:The effects of different diluted olive mill wastewater(OMWS) on the germinability and related enzyme activities of wheat and maize seeds were investigated.The germination rate,root length,and related biochemical parameters were tested using the methods of counting,weigh,and colorimetry,respectively.The results showed that the influence on the germination rate,germination vigor,and growth was based on the concentrations of OMWS.The OMWS with low dilution ratio(Original and D5) treatments were not only inhibited the seeds germination,but also delayed the growth of leafbud and root,even had more phytotoxicity.The inhibition reduced with the decreasing of OMWS concentration.However,higher dilution ratio groups(D30 and D50) promoted the seed growth behavior.The effects of OMWS on the changes in soluble protein content,catalase(CAT),peroxidase(POD),and phenylanlanine ammonia lyase(PAL) activities also displayed the tendency of inhibition under high,and induction under low concentration.There was significant positive correlation between root length and POD and PAL activities.It was concluded from the results that the influence of OMWS on the germination and growth of wheat and maize seeds had dual effects with inhibition and induction according to the dilution of OMWS.The most important effect was possibly attributed to the contents of phenolic compounds in OMWS.In view of the phytotoxicity caused by phenolics and oxidation products,we suggest to do a dilution pretreatment when OMWS used as organic fertilizer or soil conditioner.

Key words:olive mill wastewater;wheat;maize;seeds;germinability;enzyme activity

中圖分類(lèi)號(hào):Q945.34;Q945.79

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:劉娜(1982-),女,碩士,實(shí)驗(yàn)師,主要從事資源植物學(xué)研究。E-mail:liuna@nwnu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31360192);甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目(1506RJIA116)

收稿日期:2015-11-15;修改稿收到日期:2016-01-06

文章編號(hào):1000-4025(2016)03-0565-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0565