網(wǎng)線接頭上脫落細(xì)胞采集方法對(duì)STR分型的影響

吳淵虬劉宗偉陶陸陽(yáng)（蘇州大學(xué) 江蘇 蘇州 5007；常熟市公安局 江蘇 蘇州 5500）

網(wǎng)線接頭上脫落細(xì)胞采集方法對(duì)STR分型的影響

吳淵虬1劉宗偉2陶陸陽(yáng)1
（1蘇州大學(xué) 江蘇 蘇州 215007；2常熟市公安局 江蘇 蘇州 215500）

探究網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型的可行性及脫落細(xì)胞不同的采集方法對(duì)STR分型結(jié)果的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型37例中檢出12個(gè)以上基因座達(dá)33例，顯著高于擦拭法，得出剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型效果更優(yōu)的結(jié)論。

法醫(yī)物證 網(wǎng)線接頭 脫落細(xì)胞 STR分型

接觸性DNA檢材是法醫(yī)學(xué)DNA檢驗(yàn)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題之一，這類檢材所含有的DNA樣本屬于低拷貝(Low Copy Number，LCN)模板，即DNA含量小于100pg的樣本。接觸性DNA檢材不僅存在于犯罪現(xiàn)場(chǎng)，往往也會(huì)存在于犯罪嫌疑人或被害對(duì)象的用具、衣物等客體上。隨著犯罪嫌疑人警惕性的不斷提高，一些明顯可見的生物物證（如血痕、毛發(fā)、精斑等）常被犯罪嫌疑人銷毀破壞，但來自人體粘膜或皮膚表面的脫落細(xì)胞由于微小痕量卻常被忽略，如遺留在口罩、飲料瓶、煙蒂上的口腔上皮細(xì)胞；遺留在刀柄、指紋、手套上的體表脫落細(xì)胞，對(duì)于這類生物物證，一旦能夠成功檢驗(yàn)分析出其中的DNA樣本，就能為案件的偵破提供有效的科學(xué)證據(jù)[1]。本文以現(xiàn)場(chǎng)遺留的網(wǎng)線接頭作為檢材，通過擦拭法和切割法兩種方法提取網(wǎng)線接頭上的微量脫落上皮細(xì)胞并進(jìn)行STR分型，探究網(wǎng)線接頭提取DNA檢材的可行性并篩選出高檢出率的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2012 年以來本實(shí)驗(yàn)室受理案件中的網(wǎng)線接頭70份，其中33份由現(xiàn)場(chǎng)勘查人員采用擦拭法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞，標(biāo)記為檢材I；37份由本實(shí)驗(yàn)室人員采用剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞，標(biāo)記為檢材II。

1.2 主要設(shè)備和試劑

GeneAmp PCR System 9700型定量PCR儀，ABI3500XL型熒光分析儀，GeneMapper ID-X分析軟件，AmpFISTR Identifiler Plus（AB）試劑盒，D盾超敏DNA提取試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法和樣品的準(zhǔn)備

1.3.1 檢材采集方法

（1）擦拭法：取一根干棉簽吸取適量去離子水，在網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片表面來回擦拭一次，再取第二根干棉簽擦拭水晶頭彈片表面，將兩根棉簽置于D盾超敏DNA提取試劑盒1.5mL離心管的套管內(nèi)；再以同樣方法擦拭網(wǎng)線接頭表面的其余部位，將棉簽置于上述離心管套管內(nèi)。

（2）剪取法：用剪刀將網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片剪下，置于D盾超敏DNA提取試劑盒1.5mL離心管底部，在離心管內(nèi)加置離心套管；取一根干棉簽吸取適量去離子水，在網(wǎng)線接頭表面的其余部位往復(fù)擦拭一次，再取第二根干棉簽擦拭網(wǎng)線接頭表面的其余部位，將兩根棉簽置于上述離心管套管內(nèi)。

1.3.2 改良硅珠法DNA提取和純化步驟

（1）檢材I的DNA提取和純化：①在放有棉簽的離心套管內(nèi)加入180μL裂解液，99℃裂解5分鐘；②8000g離心2分鐘，棄套管，加入吸附液1000μL，硅珠16μL，蝸旋后靜置15分鐘；③8000g離心1分鐘，棄上清，加入800μL漂洗液，充分混勻后8000g離心1分鐘，棄上清；④置于56℃金屬浴上烘干沉淀物，后加入20μL洗脫液，充分混勻后置于56℃金屬浴上洗脫15分鐘；⑤16000g離心2分鐘，取上清液進(jìn)行PCR。

（2）檢材II的DNA提取和純化：①在放有棉簽的離心套管內(nèi)加入180μL裂解液，99℃裂解5分鐘；②8000g離心2分鐘，棄套管，試管在99℃二次裂解5分鐘；③8000g離心2分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至另一試管內(nèi)，加入吸附液1000μL，硅珠16μL，蝸旋后靜置15分鐘；④8000g離心1分鐘，棄上清，加入800μL漂洗液，充分混勻后8000g離心1分鐘，棄上清；⑤置于56℃金屬浴上烘干沉淀物，后加入20μL洗脫液，充分混勻后置于56℃金屬浴上洗脫15分鐘；⑥16000g離心2分鐘，取上清液進(jìn)行PCR。

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)體系為15μL，包括mix 6μL，prime set 3μL，模板DNA6μL。熱循環(huán)條件為95℃11分鐘、94℃20秒、59℃3分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后60℃延伸10分鐘。

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用ABI3500XL型熒光分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper ID-X軟件分析STR基因型。

2 結(jié)果

2012 年以來涉案電腦附件網(wǎng)線接頭的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下表所示。表中結(jié)果顯示，33例擦拭法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型檢出12個(gè)以上基因座22例，其中單一個(gè)體12例，混合個(gè)體10例，檢出12個(gè)以下基因座11例；37例剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型檢出12個(gè)以上基因座32例，其中單一個(gè)體21例，混合個(gè)體11例，檢出12個(gè)以下基因座5例。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型效果更優(yōu)。

表 涉案檢材相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

3 討論

相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明人體只需接觸物體表面5秒鐘就可能有上皮脫落細(xì)胞遺留在物體的表面[2,3]。手是犯罪嫌疑人在作案過程中接觸現(xiàn)場(chǎng)物體最多的部位，在其接觸過的物體表面很可能會(huì)遺留下手指上的脫落細(xì)胞。正常情況下，人體皮膚表面的脫落細(xì)胞多數(shù)為已經(jīng)角質(zhì)化的細(xì)胞，這是由于人體皮膚表面的細(xì)胞會(huì)隨著新陳代謝不斷更新，為了抵御外界的各種刺激逐漸移動(dòng)、分化，并最終成為角質(zhì)細(xì)胞，而角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核已經(jīng)解體，無(wú)法從中獲得足夠多的DNA樣本進(jìn)行STR分型，但在某些情況下，如與物體摩擦或皮膚出汗時(shí)，會(huì)留下較多的有核上皮細(xì)胞[4,5]。犯罪嫌疑人在盜竊電腦過程中將網(wǎng)線接頭拔出時(shí)手指必定會(huì)按壓網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片，手指必定會(huì)與網(wǎng)線接頭發(fā)生一定摩擦，因此在網(wǎng)線接頭上留下的上皮脫落細(xì)胞中有一部分是新生的有核細(xì)胞，從這些新生的有核細(xì)胞中就能夠提取到未降解的細(xì)胞核DNA，再運(yùn)用STR分型檢測(cè)就能為案件的偵破提供關(guān)鍵線索。但如何把網(wǎng)線接頭上的DNA盡可能地轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)是提高STR檢出率的關(guān)鍵所在。

接觸性DNA檢材所含有的DNA樣本屬于低拷貝模板，需要獲得足夠多的DNA樣本才能進(jìn)行有效的STR分型[6]。因此，在提取和轉(zhuǎn)移接觸性DNA檢材的過程中應(yīng)盡量多采集載體表面的脫落細(xì)胞，以求獲取到足夠多的DNA樣本進(jìn)行STR分型檢測(cè)。一般情況下，當(dāng)DNA STR分型檢出的位點(diǎn)大于或等于12個(gè)基因座時(shí)代表檢測(cè)效果較好，可以進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

橫向分析上表中的結(jié)果顯示，并不是所有的樣本都能得到明確的STR分型。樣本能否得到明確分型關(guān)鍵取決于以下兩方面：一方面是犯罪嫌疑人在作案過程中是否戴手套；另一方面是犯罪嫌疑人接觸網(wǎng)線接頭時(shí)間的長(zhǎng)短。同時(shí)，犯罪嫌疑人在盜竊過程中的主要接觸部位水晶頭彈片面積小，網(wǎng)線接頭上留有的脫落上皮細(xì)胞含量非常低，屬于極微量檢材，并且不同的犯罪嫌疑人的生理特征及在作案過程中的行為習(xí)慣是不同的，這就導(dǎo)致他們遺留在網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞在數(shù)量和成分上會(huì)有所不同，而同一犯罪嫌疑人在不同的生理狀態(tài)和外部環(huán)境下，體表脫落細(xì)胞的構(gòu)成也是不同的，這就導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)中有些樣本不能得到明確的STR分型。

縱向分析上表中的結(jié)果顯示，剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型檢出12個(gè)以上基因座例數(shù)高于擦拭法，其中單一個(gè)體例數(shù)前者也遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于后者。這是由于網(wǎng)線接頭的表面積較小，特別是水晶頭彈片，限制了反復(fù)擦拭的幅度，并且擦拭載體轉(zhuǎn)移也會(huì)損失部分脫落細(xì)胞，增加了上皮脫落細(xì)胞獲取的難度，因此，利用擦拭法擦拭網(wǎng)線接頭的表面不能有效地獲取到足夠多的上皮脫落細(xì)胞用于STR分型[7-9]，這樣就降低了DNA STR檢測(cè)的檢出率。而通過觀察網(wǎng)線接頭的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，犯罪嫌疑人在盜竊電腦過程中用手拔出網(wǎng)線接頭時(shí)手指必定會(huì)按壓到網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片，因而本實(shí)驗(yàn)室人員采用的剪取法是將網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片剪下放入試管底部用于二次裂解，這是區(qū)別于擦拭法的關(guān)鍵步驟，這一步驟能將水晶頭彈片上的脫落細(xì)胞完全轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，避免了擦拭法不能完全獲取到水晶頭彈片上脫落細(xì)胞的弊端，大大增加了可用于STR分型的脫落細(xì)胞數(shù)量，而之后再反復(fù)擦拭網(wǎng)線接頭表面的其余部分，降低了上皮脫落細(xì)胞獲取的難度，能從網(wǎng)線接頭上獲取到盡可能多的上皮脫落細(xì)胞，并且水晶頭彈片大多為塑料材質(zhì)，屬于非滲透性檢材，二次裂解的效果好，有效地提高了DNA STR檢測(cè)的檢出率。

總之，用針對(duì)性的方法獲取網(wǎng)線接頭上的脫落上皮細(xì)胞及在嚴(yán)格控制污染的條件下，網(wǎng)線接頭上附著的脫落細(xì)胞可作為一種法醫(yī)生物學(xué)檢材，其DNA STR分型結(jié)果能為案件偵破提供指導(dǎo)作用，而采用剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細(xì)胞進(jìn)行STR分型效果更優(yōu)。參考文獻(xiàn)：

[1]張?zhí)煜?劉海東,邢立學(xué),等.接觸性DNA及其現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)[J].法制與社會(huì),2009(26):352.

[2]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京:中國(guó)人民公安大學(xué)出版社,2003:332-334.

[3]張曉紅,吳微微.3種常見體表痕跡接觸性DNA的檢驗(yàn)[J].刑事技術(shù),2012(6):52-54.

[4]袁麗,魯滌,劉耀.低拷貝DNA模板檢驗(yàn)方法探討[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2009(6):383-385.

[5]Fregeau CJ,Germain O,Fourney RM.Fingerprint enhancementrevieitedandtheeffectsofbloodenhancement chemicals on subsequent Profiler Plus fluorescent short tandenm repeat DNA analysis of fresh and aged bloody fingerprints[J].JForensicSci,2000,45(2):345-380.

[6]Gill P.Application of law copy number DNA Profiling[J].Croatian MedicalJournal,2001,42(3):229-232.

[7]姚建,賈東濤,張玉紅,等.檢材量對(duì)硅珠法提取脫落細(xì)胞DNA的影響[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2009(5): 333-334.

[8]王林生,蘇勇,顧林崗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2000,15(1):36-37.

[9]楊帆,梅善宗,李永宏,等.簽字筆上附著的脫落上皮細(xì)胞STR分型[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2008(1):34-37.

DF795.2

A

2095-7939(2016)01-0071-03

2014-11-25

吳淵虬（1988-），男，江蘇常熟人，江蘇省常熟市公安局刑警大隊(duì)DNA實(shí)驗(yàn)室助理工程師，蘇州大學(xué)碩士研究生，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究。

孟凡騫）