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    鋱離子增敏熒光光度法測(cè)定魚(yú)肉組織中的恩諾沙星殘留

    2016-05-03 16:13任乃林李紅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:新方法藥片

    任乃林+李紅

    摘要: 為了研究建立分析測(cè)定恩諾沙星的新方法,以鋱-恩諾沙星配合物的熒光特性為基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)在pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖溶液中,鋱與恩諾沙星的配合物在545 nm(λex=328 nm)處產(chǎn)生了Tb3+的特征熒光峰,可用于恩諾沙星的分析測(cè)定,從而建立了簡(jiǎn)單、快速、靈敏測(cè)定恩諾沙星的熒光方法,并優(yōu)選了反應(yīng)的最佳條件。在最佳試驗(yàn)條件下,恩諾沙星濃度在1.0×10-8~1.0×10-6 g/mL范圍內(nèi)與其545 nm的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系(r2=0.992 3),檢出限為1.3×10-9 g/mL;對(duì)藥片中恩諾沙星的測(cè)定回收率為97.7%,變異系數(shù)為1.4%;對(duì)于魚(yú)肉組織中恩諾沙星測(cè)定回收率為79.0%~94.5%,變異系數(shù)為2.0%~7.8%。

    關(guān)鍵詞: 增敏熒光分光光度法;恩諾沙星;鋱(Ⅲ);藥片;魚(yú)肉殘留檢測(cè);新方法

    中圖分類號(hào): S912 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2016)03-0294-03

    恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)別稱乙基環(huán)丙沙星,是第3代氟喹諾酮類抗菌藥,為動(dòng)物專用抗菌素,因具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、生物利用度高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)而受到國(guó)內(nèi)外臨床獸醫(yī)的關(guān)注,在臨床上已被廣泛應(yīng)用。恩諾沙星為廣譜抗菌藥,對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏桿菌、嗜血桿菌、巴氏桿菌等革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抗菌作用[1];此外,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌亦表現(xiàn)出良好的抗菌作用。恩諾沙星主要用于治療豬、雞、鵝、牛等的細(xì)菌性感染,同時(shí)用于治療繼發(fā)性感染和豬、雞的霉形體病。但是長(zhǎng)期用藥所產(chǎn)生的不良反應(yīng)、在畜禽產(chǎn)品中的殘留、耐藥性的增加以及在環(huán)境中的生態(tài)效應(yīng)等已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注,農(nóng)業(yè)部也制定了相關(guān)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

    國(guó)內(nèi)外關(guān)于恩諾沙星的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2-6]、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9-10]、化學(xué)發(fā)光分析法[11-12]和熒光光譜法[13]等。

    從化學(xué)結(jié)構(gòu)看,恩諾沙星藥物與其同類藥物類似,其核心部分為喹啉,具有較大的共軛結(jié)構(gòu)和剛性平面結(jié)構(gòu),因此可產(chǎn)生較顯著的熒光,適合采用熒光光度法測(cè)定。

    稀土離子Tb3+是靈敏的熒光探針,被廣泛用于藥物、蛋白質(zhì)、核酸等測(cè)定和研究,利用稀土Tb3+作為熒光探針測(cè)定喹諾酮類藥物已見(jiàn)報(bào)道[14-16],如周靜等研究了鋱-培氟沙星的熒光特性[16]。本研究主要探討了ENR與Tb3+離子配合物體系的熒光特性,發(fā)現(xiàn)ENR與Tb3+離子能形成穩(wěn)定的配合物,能夠發(fā)射鋱離子的特征譜線[16],由此建立1種簡(jiǎn)單、快速、可靠的檢測(cè)藥物中恩諾沙星含量的方法,并用于實(shí)際樣品魚(yú)肉組織中恩諾沙星殘留的檢測(cè)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    RF-5301型熒光分光光度計(jì)(日本島津分析儀器公司);pHS-3D型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

    主要試劑有:恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL):準(zhǔn)確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品,用適量蒸餾水溶解,配成濃度為 1.0 mg/mL 貯備液;2 mol/L HAc溶液;HAc-NaAc緩沖溶液:取50 mL 2 mol/LHAc溶液用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至所需pH值,定容至100 mL;Tb3+標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 mmol/L):準(zhǔn)確稱取Tb4O7粉末0.373 8 g于燒杯中,逐漸加入適量的濃鹽酸,用電熱套加熱,保持微沸使其溶解,溶解后繼續(xù)加熱至蒸發(fā)結(jié)晶,再用0.1mol/L稀鹽酸溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容,用時(shí)稀釋到所需濃度。

    熒光測(cè)定均在室溫進(jìn)行,所有化學(xué)試劑除特別注明外均為分析純?cè)噭?,試?yàn)用水為2次蒸餾水。

    1.2 試驗(yàn)方法

    在10 mL的比色管中,分別加入適量的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再依次加入一定量的20 mmol/L Tb3+溶液、1.0 mL HAc-NaAc 緩沖溶液,用蒸餾水稀釋至10 mL,振蕩均勻后放置20 min。

    熒光光度法的測(cè)定:在室溫條件下,用1 cm石英比色皿裝入測(cè)量溶液,置于RF-5301型熒光分光光度計(jì)中,分別進(jìn)行熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描 (激發(fā)狹縫為10 nm,發(fā)射狹縫為5 nm,發(fā)射光譜掃描范圍為350~700 nm),確定測(cè)定體系的最大熒光激發(fā)波長(zhǎng)、最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)。試驗(yàn)中采用固定激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)的方法測(cè)定相應(yīng)條件下測(cè)試溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

    片劑中恩諾沙星的測(cè)定:取2片恩諾沙星片劑樣品(規(guī)格為0.1 g ∶ 5 mg),精確稱量后研細(xì),準(zhǔn)確稱取1片量的藥粉,用蒸餾水溶解,待藥物完全溶解后過(guò)濾不溶物,將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容。取適量在最佳試驗(yàn)條件下測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度,計(jì)算恩諾沙星含量。

    魚(yú)肉樣品中恩諾沙星的測(cè)定:隨機(jī)于市場(chǎng)購(gòu)置多寶魚(yú)、鯽魚(yú)、羅非魚(yú)樣品,去鱗、內(nèi)臟組織,取其食用部分絞碎混勻。準(zhǔn)確稱取5.00 g混勻魚(yú)肌肉組織樣,加入5.0 g無(wú)水硫酸鈉研磨均勻后置于10 mL離心管中,加入提取溶劑 (4 mL乙腈、0.04 mL 冰乙酸 ),高速勻漿2 min,于3 000 r/min離心6 min,移取上層清液;將殘?jiān)貜?fù)提取1次,合并上層清液,用氮?dú)獯蹈?,再?.0 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖液溶解殘?jiān)?,并稀釋?5.00 mL,取6份2.0 mL該樣品液,加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)ENR溶液,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定其中的ENR含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

    準(zhǔn)確量取10 μL濃度為1 mg/mL的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL比色管中,加入1 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖溶液,用蒸餾水稀釋至刻度,進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果見(jiàn)圖1。可以看出:恩諾沙星的最大激發(fā)波長(zhǎng)為328 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm。

    在上述體系中加入Tb3+,恩諾沙星的激發(fā)光譜明顯下降(圖1中B線);同時(shí)由于配合物的形成,發(fā)生分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移,435 nm處恩諾沙星本身的熒光發(fā)射峰降低,同時(shí)在489、545、582、620 nm出現(xiàn)Tb3+的特征發(fā)射峰(圖1中B1線)。為了后續(xù)的研究,本試驗(yàn)中如果選擇激發(fā)波長(zhǎng)為275 nm時(shí),在發(fā)射光譜550 nm附近會(huì)出現(xiàn)倍頻峰,將對(duì)Tb3+在545 nm附近的特征峰形成干擾,因此最后選擇激發(fā)波長(zhǎng)為328 nm。

    2.2 酸度對(duì)ENR-Tb(Ⅲ)熒光強(qiáng)度的影響

    在pH值為3.5~13.0的HAc-NaAc緩沖溶液中,觀察ENR-Tb3+配合物的熒光光譜變化。結(jié)果表明,在強(qiáng)堿性環(huán)境下(pH值>10)及強(qiáng)酸性環(huán)境下(pH值<3.5),ENR與Tb3+配合物不穩(wěn)定,沒(méi)有Tb3+的熒光發(fā)射;pH值為3.5~9.0范圍內(nèi),均可觀察到Tb3+的熒光發(fā)射,545 nm的熒光強(qiáng)度隨pH值的變化情況見(jiàn)圖2;當(dāng)pH值=6.0時(shí),能得到最為明顯的鋱離子的特征峰,545nm的熒光強(qiáng)度最大,試驗(yàn)選用的 HAc-NaAc緩沖溶液pH值=6.0作為配合物形成最佳酸堿度。

    2.3 Tb3+濃度對(duì)鋱離子的特征熒光強(qiáng)度的影響

    本試驗(yàn)固定ENR的濃度為1.0 μg/mL,HAc-NaAc緩沖溶液的pH值=6.0,通過(guò)改變鋱離子的濃度,觀察其熒光光譜的變化。從結(jié)果看出,隨著鋱離子濃度增加,在545 nm處鋱離子的特征熒光強(qiáng)度逐漸增大(圖3);當(dāng)Tb3+濃度為 125 mg/L 時(shí),545 nm鋱離子的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值,說(shuō)明在此條件下,能量轉(zhuǎn)移最好,因此后續(xù)試驗(yàn)中固定Tb3+濃度為 125 mg/L。

    2.4 線性范圍和檢出限

    在最佳試驗(yàn)條件下,配制ENR的系列溶液,按相應(yīng)試驗(yàn)方法分別測(cè)定在545 nm處的熒光強(qiáng)度。ENR濃度在1.0×10-8~1.0×10-6 g/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為F=264.29C+27.586,r2=0.992 3[F為熒光強(qiáng)度;C為ENR濃度,mg/L]。在最佳條件下平行測(cè)定11次空白溶液,按國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)(3σ)規(guī)定的方法計(jì)算檢出限為1.3×10-9g/mL。對(duì)于5.0×10-8 g/mL的ENR溶液進(jìn)行10次平行測(cè)定,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%。

    2.5 樣品測(cè)定

    2.5.1 片劑中恩諾沙星的測(cè)定 取適量該樣品液并用“1.2”節(jié)方法平行測(cè)定5次,代入線性方程,計(jì)算得每片恩諾沙星平均含量為4.9 mg,結(jié)果與標(biāo)示量基本相符(表1)。

    2.5.2 恩諾沙星的回收率 在3支盛有樣品液的10 mL比色管中分別加入1.0 mg/mL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液,然后再加入1 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖液,再加入1.25 mL 1.0 mg/mL Tb3+溶液,按試驗(yàn)方法分別測(cè)定在545 nm處的熒光強(qiáng)度,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,平均回收率為97.7%。

    2.5.3 魚(yú)肉樣品的分析 按“1.2”節(jié)方法對(duì)魚(yú)肉樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,本次抽取的魚(yú)肉樣品均未檢出ENR殘留。試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定加標(biāo)回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。方法的平均回收率在79.0%~94.5%之間,變異系數(shù)在10%以內(nèi),達(dá)到了國(guó)際殘留法規(guī)委員會(huì)的要求。

    3 結(jié)論

    恩諾沙星與Tb3+能形成配合物發(fā)射鋱離子的特征熒光,由此建立了1個(gè)測(cè)定ENR的新方法,本方法用于實(shí)際樣品(恩諾沙星片劑和魚(yú)肉組織)中ENR的測(cè)定,方法快速,操作簡(jiǎn)便,樣品回收率均在70%以上,變異系數(shù)在10%以內(nèi),達(dá)到了國(guó)際殘留法規(guī)委員會(huì)的要求,可作為檢測(cè)ENR殘留的快速篩選方法。

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