He—Ne激光輻照小麥種子提高幼苗的抗寒性

黃洪云

摘要： 分別以He-Ne激光輻照劑量為0.0（空白對照）、2.6、5.2、10.4、20.8、41.6 J/cm2，輻照時間為1、2、3 min的條件處理小麥干種子。將處理組幼苗置于4 ℃進行低溫脅迫處理，以研究小麥幼苗的相對電導率、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量等各項抗寒性指標及3種保護酶（POD、SOD、CAT）活性的變化情況。結果表明，He-Ne激光預處理小麥種子不僅可顯著提高幼苗葉片的脯氨酸含量，也可提升幼苗的抗低溫脅迫能力。與對照組相比，4 ℃低溫脅迫條件下的處理組幼苗具有較高的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性及可溶性蛋白含量，而激光處理對幼苗葉片的相對電導率、MDA含量均有所降低。小麥幼苗各抗寒性指標變化的最大幅值均出現(xiàn)在輻照劑量20.8 J/cm2、輻照時間2 min的處理條件下，可見此條件即為He-Ne激光輻照小麥種子提高幼苗抗寒性的最佳處理條件。

關鍵詞： He-Ne；激光；小麥；抗寒性指標

中圖分類號： S512.101 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0111-03

小麥是我國和世界的主要糧食作物，幾乎所有冬小麥的種植都有冷害、凍害發(fā)生，成為小麥生產(chǎn)中最大的自然災害之一。小麥的整個生長發(fā)育過程中均需要適宜的環(huán)境溫度，當外界氣溫、地溫明顯低于小麥的適宜溫度時，接近或超過其生理狀態(tài)所能承受的極限最低溫就會造成脅迫和傷害[1]。目前，對小麥抗寒性的研究已有可溶性蛋白含量、丙二醛含量、酶的活性等許多度量指標。激光作為新的誘變源，已有學者采用不同類型和波長的激光輻照作物種子，成功培育出抗逆性強、高品質(zhì)、高產(chǎn)的新作物品種，并對其誘變機理進行了相關報道[2-4]。本研究采用不同劑量和時間組合的 He-Ne 激光處理小麥干種子，測試小麥抗寒性方面的重要指標，從而得到 He-Ne 激光輻照小麥種子提高幼苗抗寒性的最佳處理條件。

1 材料與方法

1.1 種子處理

試驗用小麥品種為“京東8號”，挑選大小均勻的小麥種子并隨機分為5組，其中4組進行He-Ne激光輻照處理，1組為空白對照，每組100粒種子，設3個重復。He-Ne激光波長為6 323.8 nm，激光輻照小麥種胚，輻照距離為10 cm，激光功率密度為128 mW/cm2，輻照劑量分別為2.6、5.2、10.4、20.8、41.6 J/cm2，輻照時間分別為1、2、3 min[5]。

將處理組、對照組的種子于25 ℃下恒溫培養(yǎng)14 d，使其浸種、發(fā)芽。待小麥生長到三葉期，置于4 ℃培養(yǎng)箱中低溫脅迫處理72 h，取出處理組、對照組的小麥幼苗子葉，對其相對電導率、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、酶活性進行測定。

1.2 測試項目及方法

采用電導法測定相對電導率[6]。當植物組織受到逆境傷害時，質(zhì)膜因功能受損或結構被破壞而透性增大，細胞內(nèi)的鹽類、有機物將不同程度滲出，從而引起組織浸泡液的電導率發(fā)生變化。通過測定外滲液電導率的變化，可反映出質(zhì)膜的受損程度和所測材料抗逆性的大小，受損越重則外滲越多，電導率值也越大。采用磺基水楊酸提取比色法測定脯氨酸含量；采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[7]；采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[8]；采用NBT光化還原法測定SOD的活性[9]；采用碘量法測定過氧化氫酶（CAT）活性[9]；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[10]。以上試驗均取3次重復測量的平均值。

2 結果與分析

2.1 激光處理對葉片相對電導率的影響

在冷害脅迫條件下，不同激光處理劑量、處理時間下種子的相對電導率均呈先升高、后降低、再升高的變化曲線（圖1）。激光處理時間分別為1、2、3 min的條件下，處理劑量為2.6、5.2 J/cm2時激光處理對電導率的影響呈正效應；處理劑量為10.4、20.8、41.6 J/cm2時則呈負效應。電導率最低點均出現(xiàn)在處理劑量為20.8 J/cm2時，其中處理時間為1、2、3 min 時，電導率的最大下降幅度分別為12.3%、15.1%、137%。由此可見，在處理劑量為20.8 J/cm2、處理時間為 2 min 時，葉片相對電導率的下降幅度最大，且3個處理時間均達顯著水平。

2.2 激光處理對葉片可溶性蛋白含量的影響

不同處理劑量、處理時間下，葉片可溶性蛋白含量均呈相同變化趨勢，且曲線的走向與圖1相反（圖2）。處理時間為1、2、3 min時，可溶性蛋白含量的增加幅度均在處理劑量為20.8 J/cm2時達最大，分別為5.8%、10.5%、4.5%。由此可見，處理劑量為20.8 J/cm2、處理時間為2 min時，葉片可溶性蛋白含量的增加幅度最大，并達顯著水平，其他2個處理時間下均未達到顯著水平。

2.3 激光處理對葉片脯氨酸含量的影響

不同處理條件下，葉片的脯氨酸含量均呈先升高、后降低、再升高、再降低的振蕩型變化曲線（圖3）。在處理時間為1、2、3 min時，與對照組相比只有處理劑量為5.2 J/cm2時葉片的脯氨酸含量下降，其他處理劑量下均上升，上升幅度于處理劑量為20.8 J/cm2時達到最大，分別為17.9%、27.9%、13.9%，且均達到顯著水平。

2.4 激光處理對葉片丙二醛含量的影響

不同處理條件對葉片丙二醛含量的影響均不同（圖4）。

在各處理時間下，處理劑量為2.6、5.2 J/cm2時葉片的MDA含量高于對照組，但未達到顯著水平；處理劑量為10.4、208、41.6 J/cm2時MDA含量低于對照組，且各處理時間的最低點均出現(xiàn)在20.8 J/cm2劑量下。處理時間為1、2、3 min時最大降幅分別為10.3%、15.3%、7.8%，并于處理劑量為20.8 J/cm2，處理時間為1、2 min時與對照差異達到顯著水平。

2.5 激光處理對葉片酶活性的影響

不同處理劑量、處理時間下，激光處理對SOD、POD、CAT 3種自由基清除酶活性影響的曲線均呈先減小、后增大、再減小的變化趨勢（圖5至圖7）。不同激光輻照時間下，SOD、CAT活性的最低點均出現(xiàn)在劑量5.2 J/cm2；POD活性的最低點出現(xiàn)在劑量2.6 J/cm2。在各處理時間下，3種酶活性的最高點均出現(xiàn)在劑量20.8 J/cm2。處理時間為1、2、3 min時，SOD的增加幅度分別為39.0%、60.0%、30.0%；POD的增加幅度分別為79.5%、130.8%、53.8%；CAT的增加幅度分別為34.9%、46.8%、27.0%。處理劑量為20.8 J/cm2時，各處理時間下對3種酶活性的影響均達到顯著水平，效果最顯著的處理劑量、處理時間分別為20.8 J/cm2、2 min。

3 結論與討論

處理時間相同而處理劑量不同時，與植株抗寒性相關的各項指標的最大變化幅值均出現(xiàn)在劑量20.8 J/cm2；處理劑量相同而處理時間不同時，低處理劑量下的處理時間越長，越利于各項生理生化指標的變化，因此低劑量時3 min的輻照效果較明顯。由各組數(shù)據(jù)曲線可知，輻照時間3 min下隨著輻照劑量的增加，與植物抗冷害相關的各項指標的變化趨勢卻不利于增強植物的抗逆性，相比之下最好的處理效果出現(xiàn)于2 min的處理時間。由此可見，He-Ne激光輻照小麥種子提高植株抗寒性的最佳處理條件為：處理劑量20.8 J/cm2、處理時間2 min。

當小麥葉片受到低溫脅迫后，細胞膜結構遭到破壞且透性增大，使細胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，導致小麥組織浸泡液的電導率增大。所測得的電導率越大，植物葉片的抗寒性越弱，植物組織所受傷害越大；電導率越小，植物葉片的抗寒性越強，植物組織所受傷害越小[11]。以適宜作用劑量、作用時間的 He-Ne 激光輻照小麥干種子，可降低小麥幼苗葉片浸出液的相對電導率，因為激光作用使細胞膜功能受損或結構被破壞，導致細胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲增強，從而使浸出液電導率增大；而劑量為20.8 J/cm2的激光輻照使浸出液電導率降低，是由于激光對細胞膜系統(tǒng)的修復作用[12]?？扇苄缘鞍缀颗c植物的抗寒能力關系密切，低溫脅迫條件會使植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，而一定劑量的He-Ne激光輻照可有效提高葉片的可溶性蛋白含量，從而提高有機體的抗寒能力。

植物處于冷害脅迫條件時，其體內(nèi)的游離脯氨酸起著維持細胞結構、調(diào)節(jié)滲透壓等保護作用，使植株表現(xiàn)出抗冷害性。適宜作用劑量、作用時間的激光處理可使植株葉片積累更多的脯氨酸，使水勢大幅降低，從而增強植物細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，使植株的抗冷害能力更強。MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，MDA含量是衡量質(zhì)膜受損傷程度的標準。He-Ne激光可影響葉片細胞膜系統(tǒng)結構和功能的完整性，從而大幅降低葉片的MDA含量，并降低膜脂過氧化作用，以維護質(zhì)膜的完整性，減輕低溫條件對質(zhì)膜的傷害，使植株具有更強的抗冷害能力。SOD、POD、CAT是植物細胞防御系統(tǒng)中重要的保護酶類，可清除超氧物陰離子自由基，在冷害脅迫條件下，3種酶的活性增加越多，植株的防凍害能力越強[11]。He-Ne激光輻照一方面可直接影響植物蛋白、酶作用物復合體及其生物分子結構，從而促進酶的合成，以使酶活發(fā)生改變；另一方面可通過酶直接作用于細胞DNA，使DNA發(fā)生改變轉錄將信息傳給RNA，增強轉錄活動，從而產(chǎn)生新的酶或其他蛋白質(zhì)分子，以增強酶的活性和蛋白含量，提高植物的抗冷害性[13]。條件適宜的激光處理可使植株葉片3種保護酶的活性大幅提高，在處理劑量20.8 J/cm2、處理時間2 min時，SOD、POD、CAT酶活性的最大增幅分別為60.0%、130.8%、46.8%。低溫脅迫條件下，植物細胞的代謝失調(diào)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，而激光輻照作用使3種酶的活性大幅增強，從而提高植物體清除自由基的能力。因此，最佳處理條件的激光輻照能有效提高植株的抗寒性。

參考文獻：

[1]孫寶啟，郭天財，曹廣才. 中國北方專用小麥[M]. 北京：氣象出版社，2004：196-197.

[2]許梅芬. 激光對小麥的生物學效應的研究[J]. 應用激光，1995，15（3）：131-134.

[3]黃光明，劉承宜，劉頌豪. 激光劑量與其生物效應之間的關系[J]. 激光生物學報，1998，7（2）：11-13.

[4]吳俊林. 弱激光輻照油松種子生物效應與生物細胞膜的滲透性[J]. 應用激光，2001，21（3）：191-192，150.

[5]張 賓，段智英，楊 苗. He-Ne激光輻照對小麥陳種子萌發(fā)影響的研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學，2011，17（2）：110-112.

[6]郝再彬，蒼 晶，徐 仲. 植物生理學實驗[M]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學出版社，2004：101-104.

[7]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein synthesis in tortulia turalis[J]. Plant Physical，1991，95：648.

[8]Health R L，Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. Ⅰ. Kinetics and stioichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Arch Biochem Biophys，1968，125：189-198.

[9]田廷亮，扶惠華. 植物生長物質(zhì)及其應用[M]. 北京：科學技術文獻出版社，1995：291-296.

[10]朱廣廉，鐘誨文，張愛琴. 植物生理學實驗[M]. 北京：北京大學出版社，1990：175-178.

[11]張亞琳，衣 瑩，林 鳳，等. 低溫脅迫對小麥族物種抗寒生理的影響[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2012，43（4）：406-410.

[12]武秀榮，安 毅. 激光對玉米陳種子萌發(fā)的生物效應[J]. 激光生物學報，2002，11（4）：251-253.

[13]向 洋. 激光誘變及生物學作用機制研究[J]. 光電子·激光，1994，5（2）：87-89，80.