紅掌佛焰苞數(shù)字基因表達(dá)譜及關(guān)鍵基因表達(dá)水平分析

彭佳佳+劉克林+劉麗婭+呂學(xué)華+楊哲+李佩愉+劉春+明軍+袁素霞+平吉成+張黎

摘要： 以紅掌佛焰苞S5（盛花期：紅色）、S8（衰老期：綠色）時期為試驗材料進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜（digital gene expression profiling，DGE）測序，分別得到12 766 374條（1.28 G）、18 583 390條（1.86 G）可分析序列（clean reads），被成功注釋有差異表達(dá)的基因序列2 316條。為探究紅掌佛焰苞顏色變化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，將差異基因定位在花青素生物合成途徑11條表達(dá)量變化的序列上，并通過實時熒光定量PCR對其中的4條序列進(jìn)行檢驗，驗證了DGE測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時研究這4個序列在紅掌佛焰苞生長過程中的表達(dá)水平，結(jié)果表明：在佛焰苞發(fā)育初期，3條序列相對表達(dá)量逐漸增高，1條在S2時期降低，但均在S3時期達(dá)到最高或較高值；在S4、S5、S6、S7、S8時期，隨著佛焰苞的成熟，4條序列表達(dá)量大體上均逐漸下降，在S8衰老期表達(dá)量最低。研究結(jié)果證明了這4條基因序列是紅掌佛焰苞花色形成中的關(guān)鍵基因，S3時期是花青素生物合成的高峰期。

關(guān)鍵詞： 數(shù)字基因表達(dá)譜；紅掌佛焰苞；花青素；基因表達(dá)水平；基因序列；關(guān)鍵基因；花色變化；關(guān)鍵酶

中圖分類號： S682.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0048-05

紅掌（Anthurium andraeanum）為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物，原產(chǎn)于中美洲、南美洲熱帶地區(qū)[1]，以其花色豐富艷麗的心形佛焰苞片和持久的花期廣受消費者喜愛?；ㄉ腔ɑ苤匾挠^賞性狀，花色的形成主要是由不同類型花色素在花瓣中的積累決定的[2]。Iwata等研究表明，紅掌花青素主要有花色苷、花葵苷2種，并且花色與這2種色素苷的比例有關(guān)[3]?；ㄇ嗨卦诨ò甑纳L發(fā)育過程中會發(fā)生一系列變化，其合成也受相關(guān)合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平所控制[4-6]。

數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）是利用新一代高通量測序技術(shù)對某物種的特定組織在特定狀態(tài)下基因的表達(dá)量變化情況進(jìn)行檢測的結(jié)果，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等領(lǐng)。通過DGE可以篩選出有差異表達(dá)的基因序列信息，研究基因表達(dá)量的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動過程的核心機(jī)制[7]。

紅掌佛焰苞在生長發(fā)育過程中會由紅色逐漸變?yōu)榫G色，這與其花青素生物代謝合成過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)量存在一定的關(guān)系。本試驗通過對紅掌佛焰苞S5、S8時期進(jìn)行DGE測序，得到在紅掌顏色變化過程中存在差異表達(dá)的基因序列，并選擇有關(guān)基因探究其在紅掌佛焰苞生長發(fā)育過程中的表達(dá)水平，為紅掌花色基因全長克隆、分子標(biāo)記，及改良育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自北京大興苗圃2年生火焰（Dakota）2個生長期：S5（盛花期），佛焰苞全部展開，肉穗上部黃色，下部白色（此時為商品最佳觀賞期）；S8（衰老期），佛焰苞全部轉(zhuǎn)為綠色，肉穗變?yōu)樯罹G色（圖1）。采取健康佛焰苞于-80°C貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

總RNA提取采用植物RNA提取試劑盒Esayspin，購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR，購自invetrogen公司；熒光定量試劑盒：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX），購自Roche公司；Taq DNA聚合酶，由天根生化科技（北京）有限公司提供。試驗用到的主要儀器有PCR儀、ABI7900HT熒光定量PCR儀、臺式離心機(jī)、超低溫高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、制冰機(jī)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及超凈工作臺等。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。試驗對紅掌的S5（盛花期：紅色）、S8（衰老期：綠色）進(jìn)行的DGE測序，由北京諾禾致源科技有限公司完成。

1.3 植物總RNA提取

植物總RNA提取方法按照Esayspin試劑盒說明書進(jìn)行，提取結(jié)果用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。條帶28 S ∶ 18 S亮度比約為2 ∶ 1，說明RNA無降解；用Biodrop超微量蛋白核酸分析儀測得D260 nm/280 nm在1.8～2.2之間，則說明RNA質(zhì)量合格，可進(jìn)行后續(xù)測序試驗。

1.4 紅掌佛焰苞DGE測序

樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成1鏈 cDNA；然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I合成2鏈cDNA；隨后用AMPure XP beads試劑盒純化雙鏈cDNA。將純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫。測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Illunima HiSeqTM2000/MiseqTM平臺完成。

1.5 DGE測序結(jié)果分析

測序得到原始測序序列（raw reads），為保證信息分析質(zhì)量，必須對原始測序序列過濾去除里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads（質(zhì)量值sQ≤5的堿基數(shù)占整個reads 50%以上的reads），得到clean reads（指過濾去除里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads后，可以進(jìn)行后續(xù)分析的可用序列），后續(xù)分析基于clean reads進(jìn)行。以紅掌轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為參考序列，基因表達(dá)水平以RPKM（reads per kilo bases per million mapped reads）[8]為評估方法。以Audic等方法[9]對2個時期的樣本進(jìn)行差異基因篩選，后續(xù)對樣本間差異基因功能上的基因本體論（gene ontology，GO）富集分析[10]和這些基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析[11]都基于差異基因。篩選出與紅掌佛焰苞顏色變化有關(guān)的差異基因，驗證DGE測序結(jié)果并探究這些差異基因在紅掌佛焰苞整個發(fā)育過程中的表達(dá)水平。

1.6 實時熒光定量PCR 驗證

根據(jù)測序結(jié)果得到紅掌佛焰苞顏色變化的關(guān)鍵差異基因序列，用Primer 5.0設(shè)計特異引物。分別提取紅掌佛焰苞S1至S8整個發(fā)育時期（圖1）的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA進(jìn)行熒光定量試驗，PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，55°C 60 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。用RQ manager 軟件進(jìn)行CT值分析，用2-ΔΔCT法計算基因的表達(dá)水平。以S5（盛花期：紅色）作為對照時期、紅掌CYP（登陸號：JN602201，CYP-F：5′-TTCGACATGRMRRTCGGCGGC-3′；CYP-R：5′-CGACRTGCTTSCCRTCRAGCC-3′）作為內(nèi)參基因[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGE測序結(jié)果分析

通過DGE測序，樣本S5、S8分別得到12 766 374條（128 G）、18 583 390條（1.86 G）clean reads，分別占原始數(shù)據(jù)的98.2%、98.1%，堿基錯誤率均為0.04%，GC含量分別為50.1%、52.1%。在S5、S8時期被成功注釋有差異表達(dá)的基因序列2 316條，其中在S8時期中表達(dá)量下調(diào)的基因序列有925條（39.9%），上調(diào)的有1 392條（60.1%）。

2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析

差異基因GO富集分析中共有1 656條差異基因，以生物學(xué)過程（biological process，BP；圖2）、細(xì)胞組分（cellular component，CC；圖3）及分子功能（molecular function，MF；圖4）三大類的60個亞類（各20個亞類）進(jìn)行功能注釋，共得到2 626個GO注釋結(jié)果，以富集程度最高的60個GO注釋作圖。其中生物學(xué)過程中，代謝過程（metabolic process GO：0008152）被注釋到的差異基因序列最多，達(dá)1 082條（67.87%）；其次是單細(xì)胞代謝過程（single-organism metabolic process GO：0044710），有501條（32.72%）有表達(dá)量變化。在細(xì)胞組分功能分類中的差異基因數(shù)量相對較少，質(zhì)體（plastid GO：0009536）、葉綠體（chloroplast GO：0009507）、類囊體（thylakoid GO：0042651）及光合作用膜上（photosynthetic membrane GO：0034357）的差異基因數(shù)量在該功能分類中相對較多。在分子功能的分類中，催化活性（catalytic activity GO：0003824）和氧化還原酶活力（oxidoreductase activity GO：0016491）注釋到的差異基因數(shù)量最多，分別為927條（56.9%）、252條（15.2%）。

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，得到差異基因所參與的主要代謝途徑有170條，主要富集在次生代謝產(chǎn)物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、不同環(huán)境微生物代謝（microbial metabolism in diverse environments）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）等途徑（表1），本研究主要研究在紅掌佛焰苞顏色變化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，注釋得到在類黃酮生物合成途徑（flavonoid biosynthesis）中差異表達(dá)的基因數(shù)量有11條，通過代謝路徑分析，該11條基因序列參與花青素生物合成途徑，與S5時期（盛花期）相比，S8時期（衰老期）均表現(xiàn)為表達(dá)量下調(diào)。預(yù)測該11條基因序列為控制紅掌佛焰苞顏色變化的關(guān)鍵基因，通過NCBI序列比對，被注釋為8種基因，分別為C4H（肉桂酸-4-羥化酶）、CHS、CHI、DFR、F3′H、F3H、ANS、LAR。選其中感興趣的4個基因序列，同時設(shè)計其特異擴(kuò)增引物進(jìn)行后續(xù)分析（表2）。

2.4 實時定量PCR驗證結(jié)果

對篩選出的4個關(guān)鍵基因，在紅掌佛焰苞的S5、S8時期進(jìn)行實時定量PCR驗證其基因表達(dá)水平。圖5結(jié)果表明，comp52649_c2（C4H）、comp46425_c0（CHI）、comp53291_c0（DFR）、comp41735_c0（F3H）這4條基因在S8時期中表達(dá)量均有不同程度下調(diào)，每條序列表達(dá)量下調(diào)倍數(shù)都高于DGE測序結(jié)果，其中comp41735_c0下調(diào)倍數(shù)較多。分析原因可能是因為熒光定量擴(kuò)增的是特異片段且具有較高的靈敏性，同時也與材料的選擇時期偏差有關(guān)。熒光定量結(jié)果與DGE測序結(jié)果趨勢基本一致，說明測序結(jié)果有較好的準(zhǔn)確性。

2.5 花青素代謝途徑中關(guān)鍵基因在紅掌佛焰苞各時期表達(dá)水平分析

通過實時熒光定量PCR檢測4個關(guān)鍵基因在紅掌佛焰苞發(fā)育時期的表達(dá)水平。圖6結(jié)果表明：CHI在佛焰苞發(fā)育初期表達(dá)量規(guī)律不穩(wěn)定，在S3時期中表達(dá)量最高，其次是S1時期，在S2時期中表達(dá)量下降明顯，在S5、S6、S7、S8時期中，隨著佛焰苞的衰老，其表達(dá)量逐漸降低；C4H、F3H、DFR基因在佛焰苞初期相對表達(dá)量隨著佛焰苞的生長逐漸增高，其中C4H、F3H在S3時期達(dá)到最高，DFR在S4時期中表達(dá)量最高；S4時期之后，4個基因均隨著佛焰苞的成熟，表達(dá)量逐漸下降；在S8衰老期，相對表達(dá)量均達(dá)到最低水平。由結(jié)果可知，S3時期是紅掌花青素合成的高峰期，隨著佛焰苞生長，花青素含量下降是導(dǎo)致佛焰苞顏色變綠的原因。

3 討論與結(jié)論

類黃酮類物質(zhì)具有生物功能多樣性，包括抗植物病原體、參與植物激素調(diào)節(jié)反應(yīng)等[13-14]；同時使植物花瓣呈現(xiàn)出紅色、藍(lán)色、紫色和橙色，這種進(jìn)化可以吸引傳粉者并利于種子的傳播，也可以對自身進(jìn)行保護(hù)[15]。黃酮類物質(zhì)中的花青素是紅掌佛焰苞呈色的主要物質(zhì)。目前，花青素生物合成途徑在其他花卉中研究的較為清楚，經(jīng)過該途徑合成的天竺葵色素苷、矢車菊色素苷和飛燕草色素苷是形成有色花的主要色素物質(zhì)[16]。

本研究中得到在紅掌佛焰苞花青素生物合成途徑中表達(dá)量變化的11條基因序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對注釋為8種基因，分別為C4H、CHS、CHI、DFR、F3H、F3′H、ANS和LAR，總結(jié)出這8種基因是控制該途徑的關(guān)鍵基因。選出重要的4條基因序列comp52649_c2（C4H）、comp46425_c0（CHI）、comp41735_c0（F3H）和comp53291_c0（DFR），探究其在紅掌佛焰苞發(fā)育過程中基因表達(dá)水平。其中C4H是催化花青素生物合成途徑第1階段第2步反應(yīng)的關(guān)鍵酶[17-18]；Millar等研究表明，C4H的表達(dá)豐度對黃酮類化合物的生物合成量有一定影響[19]。本研究表明，隨著紅掌佛焰苞的生長，C4H先升高再降低，表明紅掌黃酮類物質(zhì)在此過程中的含量變化是導(dǎo)致紅掌顏色變化的主要原因之一。CHI是查爾酮生成4′，5，7-三羥基黃烷酮過程的催化酶，可將該反應(yīng)效率提高 7～10倍[20]，CHI與黃酮類物質(zhì)合成密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)CHI表達(dá)量可進(jìn)行花色改良，如利用RNA干擾技術(shù)抑制煙草的CHI合成，得到黃色花瓣；在康乃馨中的CHI、DFR插入轉(zhuǎn)座子得到黃色品種。在本研究中紅掌佛焰苞由紅色變?yōu)榫G色過程中，CHI表達(dá)量下降明顯，表明該基因的表達(dá)豐度下降與佛焰苞顏色變化有關(guān)，而在佛焰苞前期發(fā)育時期表達(dá)量變化不穩(wěn)定，具體原因有待進(jìn)一步驗證。F3H屬氧化戊二酸依賴型加氧酶，具有底物特異性，反應(yīng)需依賴Fe2+、O2-、2-酮戊二酸等作為輔助因子，在植物類黃酮生物合成調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用[21]。在本試驗中，F(xiàn)3H在佛焰苞S3時期高表達(dá)，說明S3時期是紅掌花青素合成的旺盛時期；DFR是ADPH依賴性短鏈還原酶家族成員[22]，Collette等對紅掌的研究中發(fā)現(xiàn)，DFR的轉(zhuǎn)錄水平在不同的發(fā)育階段有顯著差異，在佛焰苞發(fā)育過程中DFR是一個關(guān)鍵基因[23]。在本試驗中，DFR基因表達(dá)量在紅掌佛焰苞發(fā)育初期逐漸升高，在S3時期達(dá)到最高值，隨著佛焰苞的成熟和衰老，表達(dá)量逐漸降低，S8時期達(dá)到最低值，這與Collette等研究結(jié)果[23]一致，說明DFR是紅掌佛焰苞發(fā)育過程中花色變化的關(guān)鍵酶。

本研究利用DGE測序技術(shù)得到紅掌在S5、S8時期的差異基因信息，為后續(xù)研究紅掌佛焰苞花色基因功能等奠定基礎(chǔ)；測序結(jié)果結(jié)合實時熒光定量PCR試驗，得到控制紅掌佛焰苞花青素生物合成途徑中的11條關(guān)鍵基因序列，并對其中的4條基因進(jìn)行表達(dá)量分析，得到C4H、CHI、DFR、F3H是控制紅掌佛焰苞顏色變化的關(guān)鍵基因，S3時期是紅掌花青素合成的高峰期，為紅掌佛焰苞花色基因定位、全長克隆及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子的研究打下基礎(chǔ)。

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