Id-1在結(jié)直腸腺癌、腺瘤、正常黏膜中的表達(dá)及意義

武雪亮，王立坤，薛 軍，楊東東，屈 明，郭 飛，楊瑞敏，劉 博，候占富

Id-1在結(jié)直腸腺癌、腺瘤、正常黏膜中的表達(dá)及意義

武雪亮1，王立坤2，薛 軍1，楊東東2，屈 明1，郭 飛1，楊瑞敏3，劉 博4，候占富5

目的研究 DNA結(jié)合分化抑制蛋白 1（Id-1）在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中的重要作用。方法選取手術(shù)切除腺瘤伴不典型增生 30例（中低度 16例、重度 14例）、腺癌50例、鄰近正常黏膜 50例，通過(guò)免疫組化、熒光原位雜交方法檢測(cè)其 Id-1的表達(dá)情況，并研究其與結(jié)直腸癌相關(guān)臨床病理因素之間的關(guān)系。結(jié)果Id-1蛋白在結(jié)直腸正常黏膜、中低度不典型增生腺瘤、重度不典型增生腺瘤、腺癌中的陽(yáng)性表 達(dá) 率 分 別 為 24.00%、31.25%、57.14%、72.00%；Id-1mRNA在結(jié)直腸正常黏膜、中低度不典型增生腺瘤、重度不典型增生 腺 瘤、腺 癌 中 的 陽(yáng) 性 表 達(dá) 率 分 別 為 20.00%、25.00%、57.14%、76.00%；Id-1蛋白及 Id-1mRNA在正常黏膜組織、腺瘤伴中低度不典型增生、腺瘤伴重度不典型增生、腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)逐步增強(qiáng)（P＜0.01）；Kappa一致性檢驗(yàn)顯示，在正常黏膜、腺瘤、腺癌組織中吻合系數(shù)分別為 k= 0.791、0.729、0.905；從 TNM Ⅰ ～Ⅳ期 Id-1表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Id-1表達(dá)與腫瘤漿膜浸潤(rùn)、CEA（+）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)等密切相關(guān)（P＜0.01），而與腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)。結(jié)論Id-1異常表達(dá)在腫瘤癌變過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，有望成為新的腫瘤監(jiān)測(cè)指標(biāo)，為臨床診治及預(yù)后判斷指明新的方向。

結(jié)直腸癌；Id-1；免疫組化；原位雜交；臨床意義

目前對(duì)結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)根治為主，但以早期治療效果最佳，術(shù)后積極復(fù)查預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵［1-2］。因而尋找有效、特異性高的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷及術(shù)后防治有極其重要的價(jià)值。DNA結(jié)合分化抑制蛋白 1（inhibitors of DNA binding-1，Id-1）是近年來(lái)研究 較 熱 的 一 種 致 癌 基因，能抑制細(xì)胞分化、加速有絲分裂、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)血管生成、加速腫瘤生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)移［3］，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤中均呈高表達(dá)［4-8］，但在結(jié)直腸癌方面研究較少。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì) Id-1行免疫組化染色、原位雜交分析，旨在探討 Id-1在結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中的重要作用及與相關(guān)臨床病理因素的聯(lián)系，初步探討其致癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集 2012年5月 ～2014年 5月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血管腺體外科手術(shù)切除的原發(fā)性結(jié)直腸癌組織 50例、正常組織 50例、腺瘤伴不典型增生 30例（中低度 16例、重度 14例），癌組織取自癌灶中心處，另取標(biāo)本殘端切緣經(jīng)病理證實(shí)為正常腸組織。術(shù)前未行新輔助放化療等針對(duì)性治療。

1.2 免疫組化方法及試劑兔抗人單克隆濃縮型Id-1抗體（克隆號(hào) ab50932 R2-1G6）購(gòu)于香港 Abcam公司；鏈霉素抗生物素蛋白 -過(guò)氧化酶（SP）、DAB試劑盒均購(gòu)于美國(guó) Abnova公司。10%甲醛溶液固定部分標(biāo)本，并用石蠟包埋，對(duì)其進(jìn)行免疫組化染色，同時(shí)收集全部制備好的蠟塊并切片，切片厚度為 4μm。使用蘇木精 -伊紅（hematoxylin-esin，HE）染色方法，染色切片由高年資病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下獨(dú)立觀察評(píng)估并做出病理診斷。切片置80℃烤箱烤片 30 min，乙醇脫水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復(fù)；PBS洗 3次，加一抗，4℃過(guò)夜；PBS洗 3次，加二抗。室溫下DAB顯色，根據(jù)顯色情況控制顯示時(shí)間，蘇木精輕度復(fù)染，并用 1%的鹽酸乙醇分化 5 min、流水沖 5 min、梯度乙醇脫水（80%、85%、90%、95%、100%、100%）及松節(jié)油透明 5 min，最后樹膠封片。陰性對(duì)照為 PBS代替一抗。

1.3 原位雜交方法及試劑Id-1 mRNA原位雜交試劑盒購(gòu)于香港 Abcam公司，其靶基因的 mRNA序列 為 F：5′-TCTACGACATGAACGGCTG-3′，R：5′-GGTCCCTGATGTAGTCGAT-3′。切片厚度為 4μm，脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵 15 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶，暴露 mRNA核酸片段。滴加 3%稀釋胃蛋白酶（1 ml 3%檸檬酸：2滴濃縮型胃蛋白酶），37℃消化，PBS沖洗，預(yù)雜交；滴加 15μl預(yù)雜交液，置恒溫箱 42℃過(guò)夜；SSC洗滌 5 min；滴加封閉液；37℃30 min。PBS沖洗，滴加生物素化鼠地高辛一抗-SABC-生物素化過(guò)氧化物酶：37℃ 20 min。DAB顯色，顯色 20 min，充分水洗，蘇木精輕度復(fù)染，最后樹膠封片。

1.4 陽(yáng)性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)Id-1陽(yáng)性表達(dá)的判定：細(xì)胞漿中染有棕黃色，褐色顆粒。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：≤5%為 0分，6% ～25%為 1分，26% ～50%為 2分，51% ～75%為 3分，＞75%為 4分；無(wú)著色：0分，淺黃色：1分，黃色：2分，深黃色：3分。兩者相乘，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（?），9～1 2分為（?），（+）～（?）均視為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用 χ2檢驗(yàn)和 Fisher精確概率法，設(shè)檢驗(yàn)水平 α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤、腺癌組織中Id-1蛋白表達(dá)的情況結(jié)直腸癌組織中 Id-1的陽(yáng)性表達(dá)率為 72.00%（36／50），腺瘤伴中低度不典型增生、腺瘤伴高度不典型增生組織中 Id-1的陽(yáng)性表達(dá)率分別是 31.25%（5／16）和 57.14%（8／14），而在正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為是 24.00%（12／50）。Id-1在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生組織中的陽(yáng)性率明顯低于腺瘤伴重度不典型增生組織及腺癌組織（P＜0.01）；而 Id-1在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生組織中的陽(yáng)性率則差異不大；Id-1在腺瘤伴重度不典型增生組織及腺癌組織組織中的陽(yáng)性率則亦無(wú)明顯變化。見圖1、表 1。

2.2 結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤、腺癌組織中Id-1 m RNA表達(dá)的情況50例結(jié)直腸癌組織中 Id-1 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為 76.00%（38／50），稍高于 Id-1蛋白表達(dá)；16例腺瘤伴中低度不典型增生、14例腺瘤伴高度不典型增生組織中 Id-1mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率分別是 25.00%（4／16）和 57.14%（8／14），而在 50例正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為是 20.00%（10／50），稍低于 Id-1蛋白表達(dá)；Id-1mRNA在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生組織中的陽(yáng)性率明顯低于腺瘤伴重度不典型增生組織及腺癌組織（P＜0.01）；而 Id-1mRNA在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生組織中的陽(yáng)性率則差異不大；Id-1mRNA在腺瘤伴重度不典型增生組織及腺癌組織組織中的陽(yáng)性率則亦無(wú)明顯變化，與 Id-1蛋白表達(dá)基本一致，見圖1、表 2。

表1 Id-1蛋白在結(jié)直腸正常組織、腺瘤及腺癌組織中的表達(dá)

圖1 Id-1在結(jié)直腸正常組織、腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) ×400 1：IHC；2：ISH；A：結(jié)直腸正常組織；B：腺瘤；C：結(jié)直腸癌組織

表2 Id-1mRNA在結(jié)直腸正常組織、腺瘤及腺癌組織中的表達(dá)

2.3 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)Id-1和Id-1m RNA的結(jié)果對(duì)比分析運(yùn)用 Kappa檢驗(yàn)兩種方法檢測(cè)的一致性，在正常黏膜組織中，吻合系數(shù)為 0.791，腺瘤組織中吻合系數(shù)為 0.729；腺癌組織中，吻合系數(shù)為0.905。

2.4 結(jié)直腸癌組織中Id-1和臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性Id-1蛋白的表達(dá)水平與患者腫瘤大小、分化程度等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)，而是與腫瘤漿膜浸潤(rùn)、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤 TNM分期、脈管浸潤(rùn)和CEA（+）密切相關(guān)（P＜0.01），見表 3。

3 討論

Id-1是 1995年發(fā)現(xiàn)的一種分化抑制因子，最初的小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲［9］。Id-1定位于染色體 6p21-22上，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的胚胎、生殖腺體及一些分化不成熟的組織細(xì)胞中。Id-1系螺旋 -環(huán) -螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員，是細(xì)胞分化的負(fù)性調(diào)控因子。HLH區(qū)高度保守，包含2個(gè) α螺旋，由15～20個(gè)殘基組成，這兩條α螺旋被一個(gè)多序列、多長(zhǎng)度環(huán)區(qū)分割開來(lái)，廣泛表達(dá)于各生物體［10-11］。大多數(shù) HLH結(jié)構(gòu)存在一個(gè)堿性 HLH（bHLH）因子與其緊密相鄰，二者相互結(jié)合形成異質(zhì)二聚體，其中兩個(gè)堿性區(qū)與目標(biāo) DNA結(jié)合，誘導(dǎo)啟動(dòng)子中的 E-盒樣結(jié)構(gòu)的靶基因轉(zhuǎn)錄并整合成所謂的“E-box”DNA序列，從而調(diào)控細(xì)胞增殖分化。Id-1無(wú)堿性結(jié)構(gòu)域，因而與 bHLH因子結(jié)合生成的二聚體無(wú)轉(zhuǎn)錄功能，無(wú)法與目標(biāo) DNA序列結(jié)合，從而抑制細(xì)胞分化［12］。研究［13］證實(shí)，Id-1基因在細(xì)胞增殖期表達(dá)上調(diào)，分化期表達(dá)下降。Cheung et al［14］研 究 報(bào) 道 Id-1表 達(dá) 上 調(diào) 能 激 活 Raf-1及MAPK激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制細(xì)胞凋亡，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。Lee et al［15］發(fā)現(xiàn) Id-1還可通過(guò)磷酸化抑制 Rb途徑并阻斷 p16（INK4a）表達(dá)，從而促進(jìn) G1、G2、S、M期細(xì)胞增殖增加目標(biāo) DNA合成；Id-1的高異常表達(dá)可激活 VEGF及其受體體，以釋放促血管生成的自分泌信號(hào)，誘導(dǎo)形成新生的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展。Sharma et al［16］發(fā)現(xiàn)，Id-1可直接或間接抑制血小板凝血酶敏感蛋白-1即血栓收縮蛋白-1，來(lái)調(diào)節(jié)血管的生成。

表3 Id-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

本研究表明，Id-1mRNA及蛋白在正常黏膜組織、腺瘤、腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)逐步增強(qiáng)，且在結(jié)直腸腺癌中的陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于腺瘤伴中低度不典型增生及正常黏膜組織，提示 Id-1表達(dá)的異常上調(diào)是正常黏膜-癌前病變-腺癌這一癌變過(guò)程中的早期分子學(xué)事件，即在癌變的早期階段 Id-1即被激活，這與葉英海 等［17］研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究表明 Id-1與結(jié)直腸腫瘤的漿膜浸潤(rùn)、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管浸潤(rùn)等密切相關(guān)，表明 Id-1在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)，不僅與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，而且與腫瘤的浸潤(rùn)和侵襲相關(guān)。因而 Id-1有望成為新的腫瘤監(jiān)測(cè)指標(biāo)，為臨床診治及預(yù)后判斷提供重要的參考。

［1］Siegel R，DeSantisC，Virgo K，etal.Cancer treatmentand survivorship statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62（4）：220-41.

［2］代 珍，鄭榮壽，鄒小農(nóng)，等.中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病趨勢(shì)分析和預(yù)測(cè)［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，46（7）：598-603.

［3］Jang T J，Jung K H，ChoiE A.Id-l gene downregulation by sulindac sulfide and its upregulation during tumor development in gastric cancer［J］.Int JCancer，2006，118（6）：1356-63.

［4］Ding R，Han S，Lu Y，et al.Overexpressed Id-1 is associated with patient prognosis and HBx expression in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Biol Ther，2010，10（3）：299 -307.

［5］陳晶晶，陳 柯，王曉秋，等.子宮內(nèi)膜樣腺癌中 Id-1、Smad4和p21WAFl／C1P1蛋白 及 mRNA的 表 達(dá) ［J］.安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2010，45（1）：39-43.

［6］李曉梅，龐 宇，侯 剛.食管鱗狀細(xì)胞癌患者細(xì)胞分化抑制因子-1和低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)及意義［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（3）：1035-8.

［7］李建峰，扈玉華，董雅蘭.分化抑制因子 1、3及基質(zhì)金屬蛋白酶 9在腦轉(zhuǎn)移瘤組織中的表達(dá)及意義［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（2）：300-2.

［8］Rothschild S I，Kappeler A，Ratschiller D，et al.The stem cell gene“inhibitor of differentiation 1”（IDl）is frequently expressed in non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2011，71（5）：306 -11.

［9］Forootan SS，Wong Y C，Dodson A，et al.Increased Id-1 expression is significantly associated with poor survival of patients with prostate cancer［J］.Hum Pathol，2007，38（9）：1321-9.

［10］Sun R，Chen W，Zhao X，et al.Acheron regulates vascular endothelial proliferation and angiogenesis together with Id-1 during wound healing［J］.Cell Biochem Funct，2011，29（8）：636-40.

［11］Dong Z，Liu S，Zhou C，et al.Overexpression of ld-1 is associated with tumor angiogenesis and poor clinicaloutcome in oral squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncol，2010，46（3）：154-7.

［12］Mern D S，Hasskarl J，Burwinkel B.Inhibition of Id proteins by apeptide aptamer induces cell-cycle arrestand apoptosis in ovarian cancer cells［J］.Br JCancer，2010，103（8）：1237-44.

［13］Maw M K，F(xiàn)ujimoto J，Tamaya T.Expression of the inhibitor of DNA-binding（ID）-1 protein as an angiogenic mediator in tumour advancement of uterine cervical cancers［J］.Br JCancer，2008，99（10）：1557-63.

［14］Cheung HW，Ling M T，Tsao SW，et al.Id-l-induced Raf／MEK pathway activation is essential for its protective role against taxolinduced apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Carcinogenesis，2004，25（6）：881-7.

［15］Lee T K，Man K，Ling M T，et al.Over-expression of Id-l induces cell proliferation in hepatocellular carcinoma tllmugh inactivation of pl6INK4a／RB pathway［J］.Carcinogenesis，2003，24（11）：1729 -36.

［16］Sharma P，Patel D，Chaudhary J.Id-land Id-3 expression is associated with increasing grade of prostate cancer：Id-3 preferentially regulates CDKNlB［J］.Cancer Med，2012，1（2）：187-97.

［17］葉英海，張曉勇，周曉聰，等.DNA結(jié)合分化抑制蛋白 1與 Ki-67和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在直腸癌組織中的表達(dá)［J］.中華胃腸外科雜志，2011，14（7）：552-3.

Expressions of Id-1 in colorectal adenocarcinom a tissues，adenoma tissues，and normal colorectal tissues

Wu Xueliang1，Wang Likun2，Xue Jun1，et al
（1Dept of Vascular Gland Surgery，2Dept of Ultrasound，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000）

Objective To study the expression of Id-1 in human colorectal adenocarcinoma tissues and explore its correlation with the initiation and progression of colorectal cancer.Methods The expression of Id-1 in 50 specimens of normal colorectal tissues，50 specimens of colorectal adenomacarcinoma tissues，and 30 colorectal adenoma tissues（moderate-low dysplasia of16 cases and high dysplasia of 14 cases）were detected using immunohistochemistry technique and in situ hybridization.The correlation between its expression and the elinieopathologie features was analyzed.Results The positive expression rates of Id-1 protein in colorectal normal tissues，colorectal adenoma tissueswith moderate-low dysplasia，colorectal adenoma tissueswith high dysplasia，and colorectal adenocarcinoma tissues，were 24.00%，31.25%，57.14%，and 72.00%.The positive rates of Id-1mRNA in colorectal normalti-ssues，colorectal adenocarcinoma tissues with moderate-low dysplasia，colorectal adenocarcinoma tissues with high dysplasia，and colorectal adenocarcinoma tissues，were 20.00%，25.00%，57.14%，and 76.00%.The positive expression rates of Id-1 protein and Id-1mRNA in colorectal normal tissues，colorectal adenocarcinoma tissues with moderate-low dysplasia，colorectal adenocarcinoma tissues with high dysplasia，and colorectal adenocarcinoma tissues gradually increased and the differences had obvious statistical significance（P＜0.01）.The coincidence coefficient in normal colorectal tissues，adenoma tissues，and colorectal adenocarcinoma tissues were 0.791，0.729，and 0.905 by Kappa testing.The positive expression level from TNMI to TNMIV stage in colorectal adenocarcinoma tissues increased gradually，and there was statistical significance（P＜0.01）.Expression of Id-1 was correlated with the depth of tumor invasion，CEA（+），lymph nodemetastasis，vessel invasion，and livermetastasis（P＜0.01），but notwith the patient’s tumor size，and differentiation degrees.Conclusion The abnormal expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues plays an important role in the process of cancer，and is expected to become the new tumormonitoring indicators，which indicates the new direction for clinical diagnosis and treatment and prognosis judgement.

colorectal neoplasms；Id-1；immunohistochemistry；in situ hybridizationi；clinical significance

R 735.37；R 735.35

A

1000-1492（2016）02-0297-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：27

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.068.htm l

2015-11-17接收

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（編號(hào)：20150058）；張家口市科技局指令性計(jì)劃（編號(hào)：1311055D）

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1血管腺體外科、2胃腸外

科、3超聲醫(yī)學(xué)科、4病理科、5河北省張家口市宣化中醫(yī)院普外科，張家口 075000

武雪亮，男，主治醫(yī)師，碩士；薛 軍，男，主 任 醫(yī) 師，碩 士 生 導(dǎo) 師，責(zé) 任 作 者，E-mail：yfyxuejun＠163.com