實(shí)時熒光定量PCR定量檢測山核桃干腐病病菌潛伏侵染量方法的建立

朱致翔，時浩杰，雷飛斌，張傳清（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安311300）

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實(shí)時熒光定量PCR定量檢測山核桃干腐病病菌潛伏侵染量方法的建立

朱致翔，時浩杰，雷飛斌，張傳清
（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安311300）

摘要：由茶麋子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃Carya cathayensis干腐病是山核桃栽培過程中的主要病害，該病菌表現(xiàn)明顯的“潛伏侵染”特性。研究山核桃樹體中干腐病菌的定量檢測技術(shù)對山核桃干腐病的預(yù)測預(yù)報及科學(xué)防治具有重要的指導(dǎo)意義。根據(jù)茶麋子葡萄座腔菌的EF1α基因設(shè)計特異性引物，通過普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實(shí)時熒光定量PCR（real-time PCR）擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)引物EFRT-F1/R1對山核桃干腐病病菌的特異性及擴(kuò)增效率較高，可穩(wěn)定擴(kuò)增出230 bp的目標(biāo)條帶。應(yīng)用此特異性引物建立的實(shí)時熒光定量PCR干腐病病菌檢測方法能夠定量檢測出山核桃植株樣品中的病菌含量，靈敏度要比普通PCR高100倍。圖6參8

關(guān)鍵詞：森林保護(hù)學(xué)；山核桃干腐??；實(shí)時熒光定量PCR；特異性引物；基因組DNA

山核桃Carya cathayensis又名核桃楸、胡桃楸，胡桃科Juglandaceae山核桃屬Carya植物。山核桃的果實(shí)種仁極富營養(yǎng)價值和口感，深受消費(fèi)者喜愛，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。山核桃干腐病是山核桃在栽培生產(chǎn)過程中一種常見的病害，染病植株產(chǎn)量會明顯下降，嚴(yán)重時可造成植株死亡，影響農(nóng)戶收益［1］。山核桃干腐病菌Botryosphaeria dothidea屬子囊菌綱Ascomycetes葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae葡萄座腔菌屬Botryosphaeria［2］。葡萄座腔菌屬的特性多為子座散生，內(nèi)含多個子囊殼，殼壁黑褐色，子囊殼呈球形或近球形，頂端具乳頭狀突起，孔口外露；子囊黑褐色倒棒狀，內(nèi)含8個子囊孢子。子囊孢子梭形，無色透明，單胞，橢圓形，雙列，大?。?6.8～26.4）μm×（7.0～10.0）μm。山核桃干腐病的發(fā)病期為每年的3月下旬至11月下旬，以菌絲體在病組織周圍越冬，具有明顯的潛伏侵染特性［3］。干腐病菌全年存在于樹體內(nèi)，而明顯癥狀需要等到4-5月才能表現(xiàn)出來，如果等出現(xiàn)癥狀時才開始進(jìn)行防治，有可能達(dá)不到預(yù)期效果。實(shí)現(xiàn)山核桃干腐病的早期、準(zhǔn)確、快捷地定量測定對山核桃干腐病病害的預(yù)測預(yù)報和防治有極其重要的意義。利用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time flurescent quantitive PCR）技術(shù)可以對DNA目的片段進(jìn)行實(shí)時檢測，在PCR體系中添加特定的熒光結(jié)合物質(zhì)或者熒光探針，受體熒光染料發(fā)射出的熒光信號強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，通過檢測熒光信號的變化來監(jiān)測PCR反應(yīng)過程，從而達(dá)到定量目的［4-5］。通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)可在病害的潛伏期準(zhǔn)確確定病害的發(fā)生程度，以便做好防治措施，從而減輕危害，提高經(jīng)濟(jì)效益。潘娟娟等［6］運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR對小麥條銹菌Puccinia striiformis進(jìn)行了檢測，其檢測效果令人滿意。本研究擬建立的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法能夠用于監(jiān)測山核桃樹體內(nèi)潛伏侵染期內(nèi)的含菌量，對于做好早期預(yù)防，指導(dǎo)病害的適時防治具有重要意義。

1　材料與方法

1.1供試菌株

所用菌系為山核桃干腐病菌，均于2014年8月4日采集自浙江省臨安市湍口鎮(zhèn)的山核桃林，并經(jīng)過多次培養(yǎng)、純化得到。

1.2山核桃干腐病病菌DNA與無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA的提取

使用生工生物工程（上海）有限公司生產(chǎn)的真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取干腐病菌DNA（提取方法參照試劑盒使用說明書），并使用該公司生產(chǎn)的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（植物）提取無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA（提取方法參照試劑盒使用說明書）。其中提取無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA時，所有樣品均隨機(jī)取于5～10年生的山核桃植株主干未發(fā)病處樹皮，具體見1.7。所有DNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3山核桃干腐病病菌特異性引物的設(shè)計

參考葡萄座腔菌EF1α（GenBank：HM176506.1，elongation factor 1 alpha（EF））基因的序列，使用Beacon Designer7軟件各設(shè)計山核桃干腐病病菌特異性引物：EFRT-F1（5′＞TTTGCCTTATCACTCTCT＜3′）和EFRT-R1（5′＞TACTTGAAGGAACCCTTG＜3′），引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)計的引物能夠精確區(qū)分葡萄座腔菌與引起山核桃病害的其他病原物。

1.4引物特異性檢測

應(yīng)用特異性引物對山核桃干腐病菌DNA和無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，測定引物特異性。

普通PCR反應(yīng)體系為：25.0 μL，其中2×PCR緩沖液12.5 μL（生工生物），上述合成的引物各1.0 μL，滅菌蒸餾水10.0 μL，模板0.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s；30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳（140 V，14 min），經(jīng)過嗅化乙錠（EB）染色后，用天能2200凝膠成像系統(tǒng)成像。

實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系為：25.0 μL，其中，SYBR 12.5 μL（TAKARA，Premix EX TaqTMⅡ），引物各1.0 μL，模板為2.0 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃5 s，56℃30 s，72℃25 s；40個循環(huán)；65℃延伸5 s。通過溶解曲線判斷是否有唯一的產(chǎn)物峰。

1.5引物靈敏度檢測

將制備的山核桃干腐病菌DNA稀釋為100 000.0，10 000.0，1 000.0，100.0，10.0，1.0，0.1 μg·L-1等不同的質(zhì)量濃度梯度，用該引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增與實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，測定該引物的靈敏度（反應(yīng)體系和條件同1.4所述）。

1.6特異性引物的實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將山核桃干腐病菌DNA用EASY Dilution（TAKARA）定量后梯度稀釋（同1.5所述），用特異性引物使用CFX96TMreal-time PCR Detection System（Bio-Rad）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次，用Excel軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7實(shí)時熒光定量PCR定量檢測山核桃樣品中的病原菌含量

于2014年10月6日正浙江省臨安市湍口鎮(zhèn)采集山核桃樣品6份，其中發(fā)病部位樣品3份，無病健康樣品3份，提取總基因組DNA（總量為100.0 μL），進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測其中山核桃干腐病病菌的含量。DNA提取方法參照Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（植物）說明書。

2　結(jié)果與分析

2.1山核桃干腐病病菌特異性引物的測定

應(yīng)用引物EFRT-F1/R1分別以山核桃干腐病病菌DNA和無病山核桃植株及所有病原物總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明：應(yīng)用該引物能夠擴(kuò)增出以山核桃干腐病病菌DNA為模板的目標(biāo)條帶，而以山核桃健康無病植株及所有微生物總基因組DNA為模板的均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖1）。實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果同樣表明：該對引物對山核桃干腐病菌只有唯一的產(chǎn)物吸收峰（圖2）。因此該引物相對于山核桃干腐病病菌具有特異性，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1　引物EFRT-F1/R1對山核桃干腐病病菌的特異性電泳圖譜Figure 1 Specificity of the selected primer pair EFRT-F1/R1 to Botryosphaeria dothidea

圖2　應(yīng)用引物EFRT-F1/R1對山核桃干腐病病菌實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增的溶解曲線Figure 2　Melting curves of real-time PCR amplification of Botryosphaeria dothidea based on primer pair EFRT-F1/R1

2.2引物在常規(guī)PCR及實(shí)時熒光定量PCR下的靈敏度測定

利用梯度稀釋的山核桃干腐病病菌DNA對特異性引物分別做普通PCR與實(shí)時熒光定量PCR的靈敏度測定。普通PCR電泳結(jié)果顯示到第2條，所對應(yīng)的模板濃度為10 000.0 μg·L-1，表明在普通PCR條件下，應(yīng)用該引物最低可以檢測到10 000.0 μg·L-1的病原菌DNA量（圖3）。在實(shí)時熒光定量PCR條件下，應(yīng)用該引物對不同濃度梯度的模板DNA進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，發(fā)現(xiàn)第1～4條的cq值呈線性關(guān)系，所對應(yīng)的模板DNA質(zhì)量濃度分別為100 000.0，10 000.0，1 000.0，100.0 μg·L-1，自第5條起無線性關(guān)系，因此可確定在普通實(shí)時熒光定量PCR條件下，應(yīng)用該引物最低可以檢測到100.0 μg·L-1的病原菌DNA（圖4）。運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR的檢測靈敏度是普通PCR的100倍。

2.3實(shí)時熒光定量PCR定量檢測山核桃樣品中的菌量

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線將山核桃干腐病病菌DNA用EASY Dilution梯度稀釋后（同1.5所述），用引物EFRTF1/R1擴(kuò)增建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。線性方程為y=-3.262 0x+27.106（R2=0.997 0），其中y為cq值，x為山核桃干腐病菌DNA質(zhì)量濃度常用對數(shù)（lg）值。

2.3.2山核桃樣品中病原菌的實(shí)時熒光定量PCR定量測定應(yīng)用特異性引物EFRT-F1/R1以1.7的樣品DNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示：樣品1，樣品2和樣品3的山核桃干腐病病菌含量是可以檢測出的，由回歸曲線可算得，樣品1中病菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 493.5 ng·g-1，樣品2中病菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為587.2 ng·g-1，樣品1中病菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為744.1 ng·g-1。

圖3　運(yùn)用普通PCR探測引物EFRT-F1/R1的靈敏度Figure 3　Sensitivity of PCR detection using primer pairEFRT-F1/R1

圖4　運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR探測引物EFRT-F1/R1的靈敏度Figure 4 Sensitivity of real-time PCR detection using primer pair EFRT-F1/R1

圖5　質(zhì)量濃度從100.0～100 000.0 μg·L-1的10倍稀釋液的回歸曲線Figure 5　Standard curve developed by using 10-fold dilutionsof DNA of 100.0-100 000.0 μg·L-1

3　討論

圖6　運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR檢測樣品的cq值Figure 6 Detection of sample cqby using real-time PCR

INDERBITZIN等［7］對常見的葡萄座腔菌科7種病原真菌進(jìn)行了研究，比較了ITS，EF1α，GPD，His，Hsp，Tublin，Combened基因片段的可變序列。結(jié)果表明：它們的EF1α基因片段的可變序列的比例相對較高。EF1α是葡萄座腔菌屬真菌常見的保守基因，由于該基因片段在同屬真菌中可變序列比例相對較高，因此同屬不同種的真菌的EF1α基因片段差異較大，根據(jù)EF1α基因設(shè)計的引物更具特異性。本研究以此為參照，根據(jù)EF1α基因設(shè)計出特異性引物。山核桃主要病害有干腐病、枝枯病、膏藥病等，本研究所設(shè)計的引物可以擴(kuò)增出山核桃干腐病病菌的目的基因片段，以區(qū)別其他病原物。

目前，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)非常成熟，能夠有效地應(yīng)用于病原菌等微生物的檢測，并且靈敏度非常高［8］。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR對小麥條銹病病菌DNA進(jìn)行定量檢測，其靈敏度約為100.0 ng· L-1，比普通PCR高出100倍［6］。本研究對比了普通PCR和實(shí)時熒光定量PCR的擴(kuò)增結(jié)果可得后者的擴(kuò)增靈敏度比普通PCR高100倍。普通PCR在電泳過程中受外界干擾較大，進(jìn)而導(dǎo)致低的擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠成像儀中無法成像，靈敏度相對較低。

山核桃干腐病是山核桃生產(chǎn)中重要的病害，具有明顯的潛伏侵染特性。因此，山核桃干腐病的早期監(jiān)測和病菌的定量分析具有重要意義。本研究運(yùn)用上述建立的方法對多個山核桃樣品進(jìn)行檢測，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程可以準(zhǔn)確計算出這些樣品中的病原菌含量，并且，制定出了山核桃干腐病的經(jīng)濟(jì)閾值，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和化學(xué)農(nóng)藥合理使用的意義也十分重大。

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Quantifying Botryosphaeria dothidea infection causing canker disease on Carya cathayensis using real-time PCR

ZHU Zhixiang, SHI Haojie, LEI Feibin, ZHANG Chuanqing
（School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:Canker disease caused by Botryosphaeria dothidea is the most important disease that threaten the production of Chinese hickory and has the significant characteristics of“l(fā)atent infection”.Therefore, the development of a quantitative detection technique of B.dothidea in hickory plants is the prerequisite for its forecasting and scientific management.In this study, specific primers were respectively designed based on the conserved regions of EF1α gene of B.dothiaea.Results of both real-time PCR and common PCR showed that the specificity and sensitivity of EFRT-F1/R1 was good primer pair.A band of 230 bp could be stably amplified by

the primers EFRT-F1/R1.Further study displayed that this real-time PCR technique is more sensitive（more than 100 fold）than the common one.Our molecular detection technique will provide scientific basis for fore

cast, and management of hickory canker disease.［Ch, 6 fig.8 ref.］

Key words:forest protection; comker disease; real-time PCR; specific primers; genome DNA

作者簡介：朱致翔，從事植物病害治理研究。E-mail：zhuzhixiang@189.cn。通信作者：張傳清，教授，從事殺菌劑與植物病害治理研究。E-mail：cqzhang@zafu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家林業(yè)局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201304403）

收稿日期：2015-04-03；修回日期：2015-05-31

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.024

中圖分類號：S718.83

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0364-05