Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中microRNA表達(dá)譜的初步研究

張新橋，王　紅

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·實驗論著·

Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中microRNA表達(dá)譜的初步研究

張新橋，王紅

Preliminary research on plasma microRNA profiling in patients with Vogt-Koyanagi-Harada syndrome

Xin-Qiao Zhang, Hong Wang

Foundation item:Natural Science Foundation of Bejing (No.7122042)

Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Lab，Beijing Tongren Eye Center，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China

Correspondence to:Hong Wang. Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Lab，Beijing Tongren Eye Center，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China. wanghongyk@sina.com

Received：2016-01-12Accepted：2016-03-15

Abstract

?AIM:To explore the differences of expression pattern of microRNA(miRNA) in plasma from Vogt-Koyanagi-Harada(VKH) syndrome patients and normal controls, searching for diseases-relating biomarkers.

?METHODS:Blood samples from 10 cases of VKH patients and 10 cases of normal control were collected to extracted total RNA in plasma. The cDNA was synthesized by reverse transcription, and then underwent real time PCR in a 96 well plate from miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR panels .Original Ct value was obtained. The Exiqon GenEx qPCR analysis software was used to analyse the original data and the differential miRNAs was obtained and analyzed by bioinformatics.

?RESULTS:The panels contained 179 miRNAs classes from human individuals. In comparison with the healthy controls，there were 20 differential miRNAs, in which 12 miRNAs were up regulated and 8 miRNA were down regulated(allP<0.05). These microRNAs participated in the regulation of various signaling pathways.

?CONCLUSION:The VKH patients and healthy controls have significantly different expression profiles of microRNA．The differential expression of microRNA may be involved in the pathogenesis of VKH.

KEYWORDS:?Vogt-Koyanagi-Harada sydrome;microRNA;plasma;profiling

Citation:Zhang XQ, Wang H.Preliminary research on plasma microRNA profiling in patients with Vogt-Koyanagi-Harada syndrome.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):625-629

摘要

關(guān)鍵詞：Vogt-小柳原田綜合征；microRNA；血漿；表達(dá)差異

引用：張新橋，王紅.Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中microRNA表達(dá)譜的初步研究.國際眼科雜志2016;16(4):625-629

0引言

Vogt-小柳原田綜合征(Vogt-Koyanagi-Harada，VKH)是一種累積全身多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，主要以雙側(cè)肉芽腫性全葡萄膜炎為特征，常伴有聽力障礙、腦膜刺激征、毛發(fā)變白或脫落、白癜風(fēng)[1]，是國內(nèi)最常見的葡萄膜炎類型之一，其發(fā)病快、進(jìn)展快、反復(fù)發(fā)作、致盲率高[2]。截至目前，有關(guān)VKH的病因與發(fā)病機制尚不完全清楚[3]。microRNA(簡稱miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)、短序列、非編碼的小分子RNA，參與基因組轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過與mRNA不完全結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，從而在真核生物基因調(diào)控過程中起到重要的作用[4]，截至目前有超過1 000個人類微小RNA調(diào)控人類約1/3的基因表達(dá)。miRNA參與固有和適應(yīng)免疫應(yīng)答，有越來越多的證據(jù)提示miRNA能夠成為VKH患者新的生物標(biāo)記物以及治療的靶點，但miRNAs在VKH發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用迄今尚不明確。因此本文應(yīng)用miRNAs PCR芯片技術(shù)檢測VKH患者與正常人群的miRNAs差異表達(dá)譜，從而探討miRNAs在VKH發(fā)病中的意義。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與設(shè)備miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR芯片及配套試劑，丹麥Exiqon公司；miRNA抽提試劑The miRCURYTMRNA Isolation Kit提取總RNA，丹麥Exiqon公司。美國Bio-Rad iQ5 實時定量PCR儀。

1.1.2實驗對象選取10例發(fā)病期Vogt-小柳原田綜合征患者，排除其他免疫性疾病及全身其他系統(tǒng)疾病，VKH診斷標(biāo)準(zhǔn)采取國際公認(rèn)診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組選取體檢中心體檢正常人群10例。所有人員均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血漿標(biāo)本收集與miRNA提取應(yīng)用EDTA-K2抗凝管采集靜脈血8mL，3000r/min離心10min，將上層血漿分裝至離心管中。 應(yīng)用The miRCURYTMRNA Isolation Kit血漿miRNA抽提試劑，抽提總miRNA。

1.2.2 RNA質(zhì)量檢測為了確認(rèn)RNA提取效果，RNA提取時加入MS2 RNA(Roche，10165948001，937.5ng)，通過OD值測定計算回收率，根據(jù)檢測結(jié)果選取回收率>50%樣本。另外在RNA提取時加入RNA Spike-in kit(Exiqon，E23203)中的control RNA UniSp2、UniSp4、UniSp5 spike-in Template，在 microRNA QC PCR Panel(Exiqon，E203887)中檢測提取質(zhì)量。

1.2.3 PCR芯片檢測與分析根據(jù)Exiqon公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行cDNA合成和實時定量PCR，利用配套軟件Exiqon GenEx qPCR analysis software對VKH組與健康對照組miRNA進(jìn)行差異分析，采用t檢驗取P<0.05及差異倍數(shù)>2或<0.5為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.4生物信息學(xué)分析通過搜索TargetScan，Miranda數(shù)據(jù)庫得到差異miRNA調(diào)控的所有靶基因；隨后通過對差異miRNA對應(yīng)靶基因進(jìn)行GO顯著性功能分析，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的GO功能集以及對應(yīng)的靶基因；同樣為了進(jìn)一步闡明異常表達(dá)的miRNA參與的信號通路，我們對差異miRNA對應(yīng)的靶基因進(jìn)行KEGG Pathway顯著性分析，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的KEGG Pathway以及對應(yīng)的靶基因；隨后通過對靶基因的顯著性GO功能集分析和顯著性Pathway分析，將GO和Pathway所包含的靶基因取交集；最后根據(jù)以上步驟得到的靶基因構(gòu)建差異miRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得到網(wǎng)絡(luò)中起核心調(diào)控作用的miRNA和被miRNA調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。

2結(jié)果

2.1分光光度計檢測結(jié)果分光光度計檢測樣品液量為50μL，檢測樣品濃度11.8～18.5ng/μL不等，RNA總量為590～925ng不等，回收率59%～92.5%不等，均>50%，可取。

2.2 microRNA QC PCR Panel檢測結(jié)果QC PCR Panel中包括多數(shù)組織中穩(wěn)定表達(dá)的hsa-miR-103、hsa-miR-191、hsa-miR-23a；在紅細(xì)胞中特異的hsa-miR-451(用于判定血漿樣品的溶血情況)；以及在RNA提取時添加的合成RNAUniSp2、UniSp4、UniSp5(用于判定RNA提取效率)。經(jīng)檢測所有樣本hsa-miR-103、hsa-miR-191、hsa-miR-23a均穩(wěn)定表達(dá)；各樣品ΔCq(miR-23a～miR-451a)差異在7以內(nèi)，符合樣品無溶血的判定標(biāo)準(zhǔn)；各樣品間UniSp2、UniSp4、UniSp5差異均在3以內(nèi)，符合樣品判定標(biāo)準(zhǔn)。

表1VKH患者血漿中差異表達(dá)的miRNA

miRNAP倍數(shù)上調(diào)miRNA Hsa-miR-424-5p0.0025.4 Hsa-miR-106b-3p0.0024.2 Hsa-miR-629-5p0.00034.5 Hsa-miR-133a-3p0.00045.2 Hsa-miR-130b-3p0.00045.2 Hsa-miR-200c-3p0.0016.2 Hsa-miR-376a-3p0.0054.9 Hsa-miR-376c-3p0.0078.1 Hsa-miR-374a-5p0.019.9 Hsa-miR-126-5p0.026.6 Hsa-miR-33a-5p0.033.4 Hsa-miR-10b-5p0.045.2下調(diào)miRNA Hsa-miR-324-3p0.0020.32 Hsa-miR-365a-3p0.0010.20 Hsa-miR-423-5p0.010.41 Hsa-miR-382-5p0.00050.34 Hsa-miR-584-5p0.0020.22 Hsa-miR-877-5p0.0070.19 Hsa-miR-93-5p0.020.49 Hsa-miR-146a-5p0.030.24

表220個異常表達(dá)的microRNA預(yù)測的靶基因數(shù)量

MicroRNA預(yù)測靶基因數(shù)模型hsa-miR-106b-3p174uphsa-miR-10b-5p261uphsa-miR-126-5p25uphsa-miR-130b-3p617uphsa-miR-133a-3p620uphsa-miR-200c-3p466uphsa-miR-33a-5p387uphsa-miR-374a-5p648uphsa-miR-376c-3p238uphsa-miR-424-5p1212uphsa-miR-629-5p184uphsa-miR-146a-5p213downhsa-miR-324-3p326downhsa-miR-365a-3p119downhsa-miR-382-5p206downhsa-miR-423-5p174downhsa-miR-584-5p142downhsa-miR-877-5p115downhsa-miR-93-5p1174down

2.3 VKH患者血漿差異表達(dá)的miRNA經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)VKH患者與正常對照相比有12個miRNA表達(dá)上調(diào)，有8個miRNA表達(dá)下調(diào)(表1)。

圖1上調(diào)microRNA靶基因顯著性的GO分析結(jié)果。

圖2下調(diào)microRNA靶基因顯著性的GO分析結(jié)果。

2.4差異表達(dá)的miRNA潛在靶基因生物信息學(xué)分析20個異常表達(dá)的microRNA在TargetScan，Miranda數(shù)據(jù)庫中共同的預(yù)測靶基因共得到7 415個，其中表達(dá)上調(diào)microRNA中靶基因最多的為sa-miR-424-5p靶基因數(shù)量最多，靶基因預(yù)測數(shù)量最少的為hsa-miR-126-5p；表達(dá)下調(diào)的microRNA中靶基因預(yù)測數(shù)量最多的為hsa-miR-93-5p，最少的為hsa-miR-877-5p(表2)。

2.5差異表達(dá)的microRNA的GO及KEGG分析結(jié)果基于Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)microRNA進(jìn)行GO顯著性分析，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的GO功能集以及對應(yīng)的靶基因；基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行KEGG Pathway顯著性分析，篩選GO、KEGG顯著性的標(biāo)準(zhǔn)是P<0.001，而假陽性率<0.05。

Vogt-小柳原田綜合征是一種自身免疫性疾病，那么我們根據(jù)圖1～2排除不相關(guān)的基因功能如神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的miRNA的顯著功能分析結(jié)果主要包括細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、信號傳導(dǎo)等。根據(jù)圖3得出上調(diào)miRNA具有顯著性的信號傳導(dǎo)通路包括TGF-β通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路、T細(xì)胞信號通路、P53信號通路等；如圖4得出下調(diào)miRNA具有顯著性的信號傳導(dǎo)通路主要包括MAPK信號通路、TGF-β通路、mTOR信號通路、Wnt信號通路、TNF信號通路等。通過圖5差異表達(dá)miRNA與靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，可以得出處于核心位置的miRNA與靶基因，其中miR-106b、miR-130b等處于較為核心位置。

圖3上調(diào)microRNA調(diào)控的顯著性信號通路分析。

圖4下調(diào)microRNA調(diào)控的顯著性信號通路分析。

3討論

圖5上調(diào)和下調(diào)microRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

microRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的、約22個核苷酸長度的單鏈RNA，在動植物轉(zhuǎn)錄后水平參與基因表達(dá)調(diào)控，miRNA通過與靶分子mRNA堿基配對降解mRNA或阻礙其翻譯[4]。有研究表明miRNA在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并影響免疫反應(yīng)的各個階段；miRNA在免疫系統(tǒng)性疾病發(fā)病中起重要作用[5]。一系列研究表明，miRNA在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，能調(diào)控多種免疫過程，包括粒細(xì)胞發(fā)育、T和B細(xì)胞的成熟與分化、抗原遞呈過程、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)的信號級聯(lián)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和T細(xì)胞受體信號等[6]。循環(huán)miRNA可豐富而穩(wěn)定地存在于體液中，因此在疾病狀態(tài)下，循環(huán)miRNA的表達(dá)譜有特征性的改變，因此循環(huán)中miRNA可作為一種無創(chuàng)傷性生物標(biāo)志物，有助于疾病的預(yù)測、診斷和預(yù)后。研究表面特異表達(dá)的miRNA可能與自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病有關(guān)。Guo[7]應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)實驗性自身免疫性葡萄膜炎小鼠與正常小鼠相比PBMCs有36個miRNAs上調(diào)、31個miRNAs下調(diào)，且應(yīng)用生物信息分析發(fā)現(xiàn)這些miRNAs可能通過T細(xì)胞受體信號通路、B細(xì)胞信號通路、Toll受體信號通路等免疫信號通路參與發(fā)病。Qi[8]發(fā)現(xiàn)活動期Behcet病患者CD4+T細(xì)胞中miR-23b顯著低表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-23b的CD4+T中Notch受體胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)被抑制以及炎癥因子IL-17、IFN-γ呈顯著低表達(dá)，則Behcet病患者低表達(dá)的miR-23b能夠激活Notch信號途徑并進(jìn)而促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。

本研究應(yīng)用PCR芯片技術(shù)檢測VKH患者血漿中miRNA表達(dá)譜，與正常對照相比有12個miRNAs上調(diào)，有8個miRNAs下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，miR-424-5p參與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移與發(fā)展。Jingushi[10]研究發(fā)現(xiàn)mi-629通過TGF-β信號通路加速腎細(xì)胞癌的發(fā)展，而本實驗中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的miRNA均部分通過TGF-β信號通路影響VKH的發(fā)病。有研究表明[11]，miR-106b通過影響上皮細(xì)胞自噬功能參與炎癥性腸道疾病的發(fā)病。De Santis[12]發(fā)現(xiàn)miR-106b通過調(diào)控TGF-β信號通路參與多發(fā)性硬化的發(fā)病，而提示本研究中異常表達(dá)的miR-106b抑或通過某種途徑調(diào)控TGF-β信號通路而影響VKH的發(fā)病。Wang[13]應(yīng)用微陣列芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的miR-130b-3p與早期狼瘡性腎炎的蛋白尿量與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，提示miR-130b-3p參與早期狼瘡性腎炎患者的發(fā)病與發(fā)展，提示我們異常表達(dá)miR-130b-3p亦或通過某種途徑參與VKH發(fā)病。miR-126通過核轉(zhuǎn)錄KappaB信號通路參與炎癥性腸道疾病的發(fā)病[11]，又有文章提示miR-126參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病[14]，這亦提示我們miR-126參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病，也就證實本文中VKH患者血漿中異常表達(dá)的miR-126通過某種途徑參與其發(fā)病。miR-93通過抑制Th17細(xì)胞的分化參與多種自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展，而Th17細(xì)胞已被證實參與小柳原田綜合癥的發(fā)病[15]。Watanabe[16]研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎小鼠模型的視網(wǎng)膜中阻止miR-146a表達(dá)水平升高，且與疾病的臨床表現(xiàn)程度評分以及IL-1/MCP-1比例呈正相關(guān)，而本文miR-146a在VKH患者血漿中表達(dá)水平降低可能與miRNA的組織特異性以及發(fā)病機制不同有關(guān)；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[17]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[18]患者miR-146a均有不同程度的表達(dá)水平降低，通過某種機制參與其發(fā)病。

Vogt-小柳原田綜合征的具體發(fā)病機制尚不明確，miRNA與VKH發(fā)病的關(guān)系亦不清楚，miRNA已被證實參與多種疾病如癌癥、自身免疫疾病的發(fā)病，本文應(yīng)用Exiqon公司的PCR芯片篩選出VKH患者與健康人差異的miRNA表達(dá)譜，通過生物信息分析得出差異表達(dá)miRNAs可能通過TGF-β等通路參與發(fā)病。本研究為進(jìn)一步研究VKH的發(fā)病提供了依據(jù)， 但差異表達(dá) miRNA 的調(diào)控機制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.09

收稿日期：2016-01-12 修回日期： 2016-03-15

通訊作者：王紅，畢業(yè)于中山大學(xué)眼科中心，博士，主任醫(yī)師，研究方向：葡萄膜炎學(xué).wanghongyk@sina.com

作者簡介：張新橋，在讀碩士研究生，研究方向：眼科學(xué)。

基金項目：北京市自然科學(xué)基金(No.7122042)
作者單位：(100730)中國北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京同仁眼科中心 北京市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室

目的：檢測Vogt-小柳原田綜合征(VKH)患者和正常對照人群血漿中miRNAs差異表達(dá)譜，探討miRNAs在VKH發(fā)病中的作用，尋找疾病相關(guān)的血漿生物標(biāo)記物。

方法：采集10例VKH患者和10例正常對照組的血液樣本，提取血漿中的總RNA，先進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后在96孔板中利用miRNA實時定量PCR芯片進(jìn)行Real-time PCR擴增和溶解曲線分析。獲得原始的Ct值，應(yīng)用Exiqon GenEx qPCR analysis software分析原始數(shù)據(jù)獲得差異表達(dá)miRNA，并對差異表達(dá)miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

結(jié)果：miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR芯片一共有179個人類來源的miRNAs，共篩選出20個差異表達(dá)的miRNAs，其中在VKH組中高表達(dá)者有12個，低表達(dá)者有8個。差異表達(dá)miRNAs參與多種信號通路。

結(jié)論：Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中存在多個microRNA異常表達(dá)，異常表達(dá)的miRNAs可能通過某種信號通路參與VKH的發(fā)病。