高效液相色譜法在獼猴桃中維生素C含量分析的應用

郭文川 ，楊 杰 ，侯茹平 ，雷凱鵬 ，杜歡歡 ，孟怡璠 ，江 海 ，2，3

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723000；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西漢中 723000）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.），也稱奇異果、狐貍桃、藤梨、陽桃、木子、毛木果、麻藤果、楊湯梨等，果形一般為橢圓狀，果實內(nèi)是呈亮綠色的果肉和一排黑色或者紅色的種子，因獼猴喜食，故名獼猴桃，亦有說法是因為果皮覆毛，貌似獼猴而得名，是一種品質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，風味鮮美的水果。獼猴桃的質(zhì)地柔軟，口感酸甜。尤其是維生素C的含量極高，因而在世界上有“水果之王”的美譽[1-2]。

維生素C（Vitamin C）又叫 L-抗壞血酸，是一種水溶性維生素，廣泛存在于新鮮水果中。維生素C具有保持肌膚潤滑、防止衰老、抗壞血酸等作用，是人體必需的主要維生素之一，廣泛參與機體氧化、還原等復雜代謝過程，還能促進體內(nèi)膠原蛋白和粘多糖的合成，增強機體抵抗力[3-5]。

獼猴桃中維生素C的含量是獼猴桃品質(zhì)分析評價的一個重要指標，也是獼猴桃主要營養(yǎng)成分之一。準確測定獼猴桃中維生素C的含量可指導獼猴桃品質(zhì)分析、種植、生產(chǎn)、育種和精深加工。

維生素C的測定方法一般有化學法、比色法、紫外分光光度法、熒光法等，這些方法都存在所需試劑較多、操作繁瑣等不足[6-9]。高效液相色譜法是目前發(fā)展較為迅速的一種方法，具有選擇性好、靈敏度高的特點。本次試驗采用高效液相色譜建立了一種測定獼猴桃中維生素C含量的方法，為獼猴桃的品質(zhì)分析、生產(chǎn)、加工提供實驗分析手段。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

市售獼猴桃；維生素C，純度為99.8%（購自天津一方科技有限公司）；分析純乙醇、甲醇、磷酸（天津市登峰化學試劑廠），色譜純甲醇（Burdick&Jackson）；實驗室自制超純水。

1.2 主要儀器設備

榨汁機 BM252C（美的家電有限公司）；萬分之一電子天平SHI-MADZU AUY220；超聲波清洗機KQ100-DA（昆山市超聲儀器有限公司）；低速臺式離心機TD24（長沙湘儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱101-3A（滬南電爐烘箱廠）；高效液相色譜儀LC2000（上海天美儀器有限公司）；Milli-Q Academic超純水機（美國密理博）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil（鉆石）C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長 245 nm；以甲醇∶0.5%磷酸=5∶95（V/V）為流動相，等梯度洗脫；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；進樣量10 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取11.80 mg維生素C標準品，用純水溶解，定容至25 mL棕色容量瓶中，制得472 μg/mL維生素C的標準對照母液。

1.3.3 供試樣品溶液制備 取新鮮市售獼猴桃剝皮于勻漿機中勻漿，取3.0 g勻漿樣品，加超純水25 mL，超聲震蕩20 min后定容于50 mL棕色容量瓶中，離心后取上清液過0.25 μm微孔濾膜，得待測供試樣品溶液。

同時取勻漿獼猴桃樣品10.0 g于烘箱中烘干至恒重，計算獼猴桃含水率，折算獼猴桃干物質(zhì)中維生素C的含量。

1.3.4 標準曲線繪制 分別取維生素C的標準對照母液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL，用純水定溶于 10 mL容量瓶中，得到標準系列溶液 4.72，9.44，18.88，28.32，37.76 μg/mL。在液相色譜設定條件下分別進樣10 μL，以標準溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。

1.3.5 供試樣品的測定 按照供試樣品處理方法平行制備樣品5份，在色譜條件下，測定供試樣品獼猴桃中維生素C的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性范圍考察 按照試驗方法中的色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：y=2780.1799x+146.4，r=0.999856，結(jié)果表明，進樣量在 47.2～377.6 ng范圍內(nèi)峰面積與進樣量線性關(guān)系良好，標準品色譜圖見圖1。

2.1.2 精密度實驗 精密吸取供試樣品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次，測定維生素C峰面積，結(jié)果分別為55426、54280、52359、52153、54361，RSD 為 2.62%（n=5）。相對標準偏差小于3%，表明精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實驗 將制備的樣品用棕色容量瓶保存于 4 ℃冰箱中，分別在 1，2，4，8，12 h精密吸取溶液10 μL進樣，測定峰面積，測得結(jié)果分別為54653、54106、53829、53687、52989，RSD 為1.13%（n=5）。供試溶液中的維生素C峰面積隨時間延長有下降趨勢，這與維生素C在空氣中易分解氧化有關(guān)，但在12 h內(nèi)穩(wěn)定性相對標準偏差小于3%。

2.1.4 重復性實驗 取同一材料，按制備方法平行制備5份供試溶液，依液相色譜設定條件測定維生素C的峰面積，測得結(jié)果分別為53270、54241、52796、53984、55203，計算得 RSD 值為1.72%（n=5）。相對標準偏差小于3%，表明重復性良好。

2.1.5 回收率實驗 采用加樣回收實驗。按維生素C分析供試樣品溶液制備方法，取同一已測定的維生素C獼猴桃樣品，加入維生素C標準品240.00 μg，測定其加標回收率，結(jié)果見表1。

表1 獼猴桃中維生素C回收率測定結(jié)果

2.2 維生素C測定結(jié)果

按照實驗條件，上機檢測其中維生素C含量，平行測定5次，最后測得新鮮市售獼猴桃勻漿汁液100 g含維生素C 97.35±3.35 mg，獼猴桃樣品色譜圖見圖2。

稱取10.1570 g獼猴桃勻漿，60℃烘干至恒重，質(zhì)量為1.6590 g，獼猴桃含水量為83.7%。由此計算出獼猴桃干物質(zhì)中100 g維生素C含量為597.23±20.55 mg。

3 結(jié)論與討論

維生素C具有多種生理功能，是維持機體正常生理功能的重要維生素之一，廣泛參與機體氧化、還原等復雜代謝過程，促進機體內(nèi)膠原蛋白和粘多糖的合成，增強機體抵抗力[10]，如保持含硫基的物質(zhì)的還原型，參與造血、促進膠原蛋白的合成，解毒作用，參與體內(nèi)兒茶酚胺生成，幫助膽固醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)激素的作用等等[5，11]。維生素C廣泛存在于植物組織中，不同植物中維生素C含量各不相同，但獼猴桃是所有蔬菜水果中維生素C含量最高的水果。

本次實驗所用的獼猴桃為非當季的市售獼猴桃，測得的鮮果汁中100 g維生素C含量為97.35±3.35 mg，較趙昕梅等[8]、董珊等[9]報道的獼猴桃中維生素C總體含量略低，但在正常范圍之內(nèi)。主要原因可能是實驗的時間是5、6月份，不是獼猴桃成熟季節(jié)，獼猴桃中的維生素C會隨儲藏時間延長逐漸降低。另外，通過實驗計算獼猴桃干物質(zhì)中維生素C含量，表明獼猴桃干品中維生素C含量會更高，后續(xù)可以考慮以獼猴桃為原料，生產(chǎn)獼猴桃果干，使其成為一種補充維生素C的有益水果加工品。

維生素C見光易分解，在穩(wěn)定性實驗中其峰面積也有隨時間延長逐漸減小的趨勢。因此，在實驗過程中應盡量避光，采用棕色玻璃儀器可有效避免見光分解。同時，分析實驗需在短時間內(nèi)完成（12 h內(nèi)）。維生素C同樣具有熱不穩(wěn)定性，因此，實驗標準品和樣品最好存放在4℃冰箱中，以保證實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)一性。

參考文獻：

［1］百度百科.獼猴桃［EB/OL］.http：//baike.baidu.com/item/獼猴桃/282710，HTM，2016-06-20.

［2］魏明英.紅陽獼猴桃中VC含量測定方法研究［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（23）：115-117.

［3］閻樹剛，韓 濤.果蔬及其制品中維生素C測定方法的評價［J］.中國農(nóng)學通報，2002，18（4）：110-112.

［4］吳春艷.水果中維生素C含量的測定及比較［J］.武漢理工大學學報，2007，29（3）：90-91.

［5］丁 焱.維生素C的功能和應用［J］.宿州師專學報，2002（9）：61-62.

［6］江 海，吳今人，李新生，等.陜西柑橘主產(chǎn)區(qū)13種推廣品種維生素C含量分析［J］.氨基酸和生物資源，2014，36（2）：59-63.

［7］李會靜，張建利，王 亮.高效液相色譜法測定獼猴桃中維生素 C 含量［J］.煤炭與化工，2013（8）：140-141.

［8］趙昕梅，遠凌威，陳世鋒，等.高效液相色譜法測定果蔬中維生素C含量［J］.信陽師范學院學報（自然科學版），2013（1）：49-53.

［9］董 珊，姜 波，劉長建.獼猴桃中維生素C的高效液相色譜分析［J］.中央民族大學學報（自然科學版），2010，19（3）：21-23.

［10］孫 義.水果和蔬菜中維生素C含量的測定方法綜述［J］.天津化工，2008，22（3）：58-59.

［11］張 昉，高 蓉.維生素C檢測方法研究進展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（2）：457-461.