興安杜鵑菌根真菌分離與鑒定

楊秀麗，閆 偉

（1.呼和浩特職業(yè)學院生物化學工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010051；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

興安杜鵑（Rhododendron dauricum），杜鵑花科（Ericaceae），杜鵑花屬半常綠灌木，又名滿山紅、達子香、金達來等。在大興安嶺地區(qū)常與興安落葉松、樟子松等喬木形成穩(wěn)定的群落，并對此群落生態(tài)穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用[1-2]。

杜鵑花科幾個屬的植物根系常與一些土壤真菌形成一種特殊類型的內(nèi)生菌根共生體，即歐石南類菌根（Ericoid mycorrhiza，ERM）（Read，1996），也稱為杜鵑花類菌根。目前已知形成杜鵑花類菌根的真菌主要是子囊菌，包括石楠柔膜菌Hymenoscyphus ericae及樹粉孢屬真菌Oidiodendron sp.和磚隔腔菌Capronia sp.等一些真菌類型[3]。

賈銳、楊秀麗等[4]曾對大興安嶺地區(qū)興安杜鵑菌根形態(tài)特征和土壤理化性質(zhì)的關系進行了初步研究。為了進一步探究興安杜鵑菌根真菌的多樣性，我們對大興安嶺北部地區(qū)的興安杜鵑根內(nèi)生真菌進行分離和培養(yǎng)，獲得了大量的真菌菌株，并采用形態(tài)學和rDNA ITS序列分析相結合的方法，對分離菌株進行鑒定，使得大部分菌株鑒定到了相應的屬，獲得了與興安杜鵑根共生的真菌多樣性信息。

1 材料和方法

1.1 根樣采集

興安杜鵑根樣采集地位于內(nèi)蒙古大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站附近區(qū)域。地理坐標為北緯 50°49'～50°51'，東經(jīng) 121°30'～121°31'。海拔高度為784～1199 m，屬低山區(qū)，氣候?qū)俸疁貛駶櫦撅L氣候區(qū)，年平均氣溫-5.0℃，極限最高溫度為32℃[5]。大興安嶺森林生態(tài)站所在地根河是興安杜鵑在大興安嶺地區(qū)的集中分布地之一。

興安杜鵑根樣采集：在以大興安嶺森林生態(tài)站為中心的原始林區(qū)選取興安杜鵑集中生長且長勢較好的區(qū)域作為采樣點，設置5個采樣點，每個樣點內(nèi)進行隨機采樣5～10份。于春季夏季（7月末）分別對5個樣點進行了樣品采集工作。將采集到的根樣連同泥土保濕放入4℃冰箱保存，在7 d內(nèi)完成對根樣的菌根真菌分離工作。

1.2 菌株分離

分離方法采用根段直接培養(yǎng)方法[6]。分離培養(yǎng)基為馬丁氏－孟加拉紅培養(yǎng)基（MA）和馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

將冷藏于4℃冰箱中的根樣取出，用水將附著在根上的泥土沖洗掉，挑選健康的生活細根剪下并繼續(xù)清洗后消毒。將消毒好的根樣剪切成0.3 cm左右的根段，每5個根段均勻放置在一個提前準備好裝有PDA培養(yǎng)基或MA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個根樣共培養(yǎng)30個根段，然后置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng) 14～28 d。

1.3 菌株形態(tài)觀察

將分離出的菌落轉接至PDA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，對菌落形態(tài)的一致性和均勻性進行密切觀察，對菌落形態(tài)有差異者，進行再次純化。對形態(tài)特征穩(wěn)定的菌落，培養(yǎng)21 d左右進行觀察并記錄特征。對菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)于光學顯微鏡40倍和100倍下分別觀察并記錄其特征。菌落形態(tài)特征的描述依據(jù)Mclean 的方法[7]。

1.4 菌根合成

菌根合成菌劑：將從根樣中分離純化后的菌株用PDA固體培養(yǎng)基進行擴繁，25℃黑暗培養(yǎng)至菌落和菌絲處于繁盛時，將菌絲體收集起來并打碎后作為菌根合成菌劑。

菌根合成基質(zhì)為：采集根樣時一同采集根周圍的土樣，土樣過1 mm篩和河沙按體積比1∶1混合，120℃，1×105Pa滅菌1 h，無菌分裝于滅菌花盆內(nèi)。

興安杜鵑種子表面滅菌選用10%的H2O2浸泡10 min，之后播種于滅菌的花盆內(nèi)，于光照培養(yǎng)室25℃，培養(yǎng)60 d，接種菌劑。每個菌株對應一個處理，每個處理接種30株，并設置不接種對照。繼續(xù)于光照室培養(yǎng)90 d后，檢測根是否合成菌根。采用翠盼藍染色并借助于解剖鏡觀察根的侵染情況。對于能夠侵染興安杜鵑根部的菌株將其確定為興安杜鵑菌根真菌，并進行rDNA ITS序列測定。

1.5 菌株rDNA ITS序列分析

最后確定12個類型能夠合成菌根，從12個菌株類型中每個類型選其中的一株共12株真菌，于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14 d后，于無菌操作臺收集菌絲體用于提取菌株總DNA，采用OMEGA公司的Fungal DNA Kit（200）試劑盒進行菌株總DNA的提取。rDNA ITS的擴增引物為ITS1F和ITS4，由上海生工生物工程公司提供。PCR反應條件：94℃預變性2 min，然后94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸45 s，72℃補平10 min，共進行35個循環(huán)。

由上海生工生物工程公司完成測序工作（PCR產(chǎn)物純化后直接測序）。將分離菌株的ITS序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中，并進行分析。

1.6 菌株所屬物種的分析與判斷

在GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫中，運用BLAST工具軟件對分離的12株真菌的ITS區(qū)段DNA序列進行分析，搜索同源DNA序列并進行比較。根據(jù)BLAST搜索和比較的結果，并結合菌株形態(tài)特征判斷分離菌株所屬物種或與其近緣的物種。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征和合成菌根形態(tài)特征

從3批（春季、夏季和秋季各一批）40份興安杜鵑根樣中共分離得到菌株146株，根據(jù)菌落和菌絲體的形態(tài)特征合并為21個菌株類型，通過菌根合成試驗再次將這21個類型的菌株進行了篩選，最后確定12個類型能夠合成菌根。這12個類型的菌落形態(tài)特征見表1。

12個類型的菌株與興安杜鵑合成的菌根形態(tài)多樣，一部分形成典型的杜鵑花科菌根的菌絲圈特征、另一部分形成的是不典型的特征，如胞間菌絲、胞內(nèi)菌絲和根上菌絲。只有J1、J3、J14、J15和X5這5個類型的菌株能夠合成典型的ERM，其他類型的菌株能夠侵染興安杜鵑的根，但形成的菌根不是典型ERM特征，將其也作為與興安杜鵑根共生的真菌。

表1 分離菌株菌落形態(tài)特征和合成菌根形態(tài)特征①

2.2 分離菌株真菌基因組rDNA ITS區(qū)段測序的結果與分析

12株分離菌株的rDNA ITS區(qū)段測序結果較為理想，將序列上傳在GenBank數(shù)據(jù)庫中，菌株的序列登錄號見表2。運用GenBank的BLAST功能搜索與每個菌株DNA序列相似的序列（在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 4個DNA序列數(shù)據(jù)庫中進行搜索），并進行分析比較。序列相似率97%以上者可以判定為相同屬。結果表明分離菌株大部分屬于子囊菌亞門（Ascomycotina），占91.3%，極少數(shù)屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina），只有2.50%，另一部分未能鑒定，占6.20%。

3 結論與討論

從興安杜鵑根系中分離出大量的真菌菌株，通過回接試驗，確定12個類型的菌株能夠與興安杜鵑形成菌根。根據(jù)菌落和菌絲體形態(tài)特征以及rDNA ITS序列分析，分離得到的菌株類型中一類未能鑒定，一類只能鑒定到子囊菌（ascomycete），一類只能鑒定到柔膜菌目（Helotiales），其余類型菌株鑒定至屬或種，分屬于7個屬，分別是Phialocephala、粒毛盤菌屬（Lachnum）、膜盤菌屬（Hymenoscyphus）、Meliniomyces、絲核菌屬（Rhizoctonia）、被孢霉屬（Mortierella）和軟盤菌屬（Mollisia）。 其 中Phialocephala、粒毛盤菌屬（Lachnum）和膜盤菌屬（Hymenoscyphus）為興安杜鵑菌根真菌優(yōu)勢類群，為興安杜鵑菌根真菌優(yōu)勢類群，在分離的菌株中所占比率超過了20%。

很多研究都證明膜盤菌屬（Hymenoscyphus）是杜鵑花科植物根系中的一種廣譜型共生真菌[8-10]，在本研究中膜盤菌屬（Hymenoscyphus）與興安杜鵑形成了比較典型的歐石南類菌根（ERM），是其菌根真菌優(yōu)勢類群之一。

表2 分離菌株rDNA ITS序列在GenBank的登錄號、所屬類別判定和所占比率

與興安杜鵑根共生的優(yōu)勢菌Phialocephala比較特殊，因其與興安杜鵑根形成的不是典型ERM特征，菌根被翠盼藍染色后，菌絲不像其他菌絲一樣呈現(xiàn)藍色，而是棕色，與其他菌絲比較粗，約為膜盤菌屬（Hymenoscyphus）菌絲直徑的2倍左右，具隔，侵染多發(fā)生在興安杜鵑根細胞間，細胞內(nèi)偶爾發(fā)現(xiàn)菌核，有些學者也有類似研究[11-13]。對于膜盤菌屬（Hymenoscyphus）是否屬于ERM真菌還不確定，一些學者將其稱之為暗色有隔內(nèi)生真菌（DSE）[14-15]。但是Phialocephala被另一些研究證明為能與多種植物根共生的有益內(nèi)生真菌[11-12]。由此推測這類真菌可能是興安杜鵑根的有益共生真菌；本研究還發(fā)現(xiàn)粒毛盤菌屬（Lachnum）類真菌也是興安杜鵑菌根菌優(yōu)勢類群之一，這在以前學者的研究中未見報道，但有報道發(fā)現(xiàn)此類真菌為外生菌根菌[16-17]。

從興安杜鵑根中還分離到了Meliniomyces的真菌，劉振華等（2012）[18]也從樹楓杜鵑菌根中分離到10株Meliniomyces variabilis或其近源種，并證實Meliniomyces variabilis與Hymenoscyphus ericae親緣關系十分相近。

本研究中發(fā)現(xiàn)擔子菌鬼傘屬（Coprinopsis）也是興安杜鵑的菌根真菌類型之一。在以前學者的研究也表明擔子菌也能形成ERM[19]，但是很少能夠人工分離培養(yǎng)[20-21]。

從興安杜鵑根樣還分離到了絲核菌屬（Rhizoctonia）、被孢霉屬（Mortierella）和軟盤菌屬（Mollisia），但是分離到的菌株很少。其中絲核菌屬（Rhizoctonia），多數(shù)研究認為其為植物病原菌，但在GenBank數(shù)據(jù)庫的搜索中發(fā)現(xiàn)它與Uncultured ectomycorrhizal fungus（emb|FN860028.1|）相似率達到了99%，這也說明它有可能是菌根菌中的一員；軟盤菌屬（Mollisia）有研究認為其為云杉樹葉面內(nèi)生真菌[22]；被孢霉屬（Mortierella），多數(shù)研究認為其為不能培養(yǎng)的一種土壤真菌。關于這幾類真菌與興安杜鵑是否為共生關系，是否為ERM真菌，以及對興安杜鵑的影響還有待于我們進一步的研究加以確認。

研究數(shù)據(jù)表明，與興安杜鵑根共生的真菌類群較豐富，且是一個異源的群體。但其對興安杜鵑的生理生態(tài)功能尚需要更廣泛和深入的研究。

參考文獻：

［1］丁柄錄，康 健.大興安嶺資源植物［M］.北京：氣象出版社，1994：156.

［2］劉慎諤.東北木本植物圖志［M］.北京：科學出版社，1955：121-122.

［3］陳 真，楊 兵，張春英，等.錦繡杜鵑菌根真菌rDNA ITS序列分析及接種效應研究［J］.菌物學報，2011，30（5）：729-737

［4］賈 銳，楊秀麗，閆 偉.興安杜鵑菌根形態(tài)特征和土壤理化性質(zhì)的關系研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2011，32（3）：63-66.

［5］徐化成.中國大興安嶺森林［M］.北京：科學出版社，1998：231.

［6］劉潤進，陳應龍.菌根學［M］.北京：科學出版社，2007：161-162.

［7］Mclean C B，Cunnington J H，Laerie A C.Molecular divers ity within and between ericoid endophytes from the Ericac eae and Epacridaceae ［J］.New Phytologist，1999，144：351-358.

［8］Bonfante P.Occurrence of a basidiomycetes in living cells ofmycorrhizal hair roots of Calluna vulgaris ［J］.Transactions of the British Mycological Society，1980，75：320-325.

［9］Egger K N，Sigler L.Relatedness of the ericoid endophyte Scytalidium vaccinii and Hymenoscyphus ericae inferred from analysis of ribosomal DNA［J］.Mycologia，1993，85：219-230.

［10］Gao Q，Yang Z L.Open access this content is freely available online to anyone，anywhere atany time.Ectomycorrhizal fungi associated with two species of Kobresia in an alpine meadow in the eastern Himalaya［J］.Mycorrhiza，2010，20（4）：281-287.

［11］Kazuhiko N，Sarah H，Randolph S.Currah.Heteroconium chaetospira，a dark septate root endophyte allied to the Herpotrichiellaceae（Chaetothyriales）obtained from some forest soil samples in Canada using bait plants ［J］.Mycoscience，2007，48（5）：274-281.

［12］Bruzone M C，F(xiàn)ontenla S B，Vohník M.Is the prominent ericoid mycorrhizal fungus Rhizoscyphus ericae absent in the Southern Hemisphere′s Ericaceae A case study on the diversity ofrootmycobionts in Gaultheria spp.from northwestPatagonia，Argentina ［J］.Mycorrhiza，2014，24（9）：339-345.

［13］Tejesvi M V，Ruotsalainen A L，Markkola A M.Root endo phytes along a primary succession gradient in northern Finland［J］.Fungal Diversity，2010，41（1）：125-134.

［14］Jumpponen Ari.Dark septate endophytes-are they mycorrh izal［J］.Mycorrhiza，2001，11（4）：207-211.

［15］Saravesi K，Ruotsalainen A L，Cahill J F.May Contrasting impacts of defoliation on root colonization by arbuscular mycorrhizal and dark septate endophytic fungi of Medicago sativa［J］.Mycorrhiza，2014，24（4）：239-245.

［16］Gao Q，Yang Z L.Open access this content is freely available online to anyone，anywhere at any time.Ectomy corrhizal fungi associated with two species of Kobresia in an alpine meadow in the eastern Himalaya［J］.Mycorrhiza，2010，20（4）：281-287.

［17］Khastini R O，Ogawara T，Sato Y.Control of Fusarium wilt in melon by the fungal endophyte，Cadophora sp.European Journal of Plant Pathology［J］.European Journal of Plant Pathology，2014，39（2）：339-348.

［18］劉振華，姚 娜，楊 凱，等.樹楓杜鵑菌根真菌分離與鑒定［J］.林業(yè)科學研究，2012，25（6）：795-797.

［19］楊秀麗，閆 偉.篤斯越橘菌根真菌多樣性［J］.微生物學報，2015，55（2）：214-219

［20］Berch S M，Allen T R，Berbee M L.Molecular detection，com munity structure and phylogeny of ericoid mycorrhizal fungi［J］.Plant and Soil，2002，244：55-66.

［21］Berger R，Perotto S，Girlanda M.Ericoidmycorrhizal fungi are common root associates of a Mediterranean ectomycor rhizal plant（Quercus ilex）［J］.Molecular Ecology，2000（9）：1639-1650.

［22］Koukol O，Kolarik M，Kolarova Z，et al.Diversity of foliar endophyte in wind-fallen Picea abies trees［J］.Fungal Divers，2012，54：69-77.