黑玫瑰石竹組培快繁中不同影響因子的優(yōu)化

周四敏，王樹彥，徐 軍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生態(tài)環(huán)境學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

黑玫瑰石竹（Dianthus Linn）是石竹科石竹屬多年生草本植物，花朵繁密，黑紫色，花徑4～6 cm，質(zhì)如絲絨聚傘花絮，株高30～50 cm。怕炎熱，耐干旱，要求排水良好的肥沃土壤，家庭院落四季可播，各地可種植，可用作盆栽、切花等，觀賞價值極高。石竹科植物是重要的觀賞園藝植物，全世界共75個屬，約2000種，我國有30屬388種，分布于全國各地。目前，一些學者對香石竹和中國石竹的研究較多，包括鮮花切花保鮮[1]，基因轉(zhuǎn)化[2-5]、組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)[6]等方面，而對黑玫瑰石竹的研究較少。

黑玫瑰石竹作為石竹科的一種，同香石竹[8]一樣，不易用種子繁殖，易產(chǎn)生品種混雜，不能保持原品種的優(yōu)良品質(zhì)，傳統(tǒng)生產(chǎn)主要采取扦插來擴大繁殖，但是長期的營養(yǎng)繁殖使得病毒危害嚴重，切花質(zhì)量變劣，栽培質(zhì)量下降，并且用普通的扦插繁殖難以達到快速繁殖的目的[7]。為了解決這一問題，則有必要采用組織培養(yǎng)的方法，建立一套完整的石竹誘導、增殖、分化等一整套快繁體系。如此不僅可以滿足石竹的工廠化生產(chǎn)，適應日益繁盛的花卉市場，而且還對石竹新品種的選育及推廣、野生植物資源的保護具有重要的意義。在石竹的離體組織培養(yǎng)中，激素、糖分、營養(yǎng)物等對其生長起著至關(guān)重要的作用，本試驗通過觀察不同激素濃度配比、不同碳源、不同大量元素及不同有機添加物對石竹離體組織莖段分化的影響，確定最優(yōu)組合建立的快繁體系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為經(jīng)過實驗室3～4代繼代培養(yǎng)的黑玫瑰石竹試管苗，基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2 試驗儀器與用具

高溫滅菌鍋、無菌操作臺、培養(yǎng)室、電子天平、電爐、鍋、燒杯、量筒、試管、移液管、容量瓶、玻璃棒、研缽、濾紙、標簽紙、研缽、鑷子、剪刀、酒精燈等。

1.3 試驗內(nèi)容與方法

1.3.1 不同NAA/6-BA和NAA/KT濃度比例對黑玫瑰石竹試管苗芽增殖的研究 以瓊脂做培養(yǎng)基支撐物，采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基中的NAA/6-BA濃度比設(shè)置為6個處理，分別為0.1 mg/L/0.5 mg/L（0.20）；0.1 mg/L/1.0 mg/L（0.10）；0.1 mg/L/1.5 mg/L（0.067）；0.2 mg/L/0.5 mg/L（0.40）；0.2 mg/L/1.0 mg/L（0.20）；0.2 mg/L/1.5 mg/L（0.13）。NAA/KT的濃度設(shè)置同NAA/6-BA一樣，每個處理4瓶，共12個處理，48瓶，每瓶接4個莖段，接種莖段為1節(jié)，共接種192個莖段。

1.3.2 不同碳源對黑玫瑰石竹試管苗生長的研究以瓊脂做培養(yǎng)基支撐物，采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的碳源為蔗糖、白砂糖和麥芽糖，每一種碳源作2個處理：15 g/L和30 g/L，每個處理4瓶，共6個處理，24瓶，每瓶接4個莖段，接種莖段為1節(jié)，共接種96個莖段。

1.3.3 不同大量元素濃度對黑玫瑰石竹試管苗生長的研究 以瓊脂做培養(yǎng)基支撐物，對大量元素作處理，采用 MS、1/2MS、1/4MS 和 2MS 的培養(yǎng)基，每一處理4瓶，共4個處理，16瓶，每瓶接4個莖段，接種莖段為1節(jié)，共接種64個莖段。

1.3.4 幾種添加物對黑玫瑰石竹試管苗生長的研究以瓊脂做培養(yǎng)基支撐物，采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加水解乳蛋白（100 mg/L）、谷氨酰胺（100 mg/L）、椰汁（100 ml/L）和活性炭（2 g/L）。共4個處理，每一個處理4瓶，共16瓶，每瓶接4個莖段，接種莖段為1節(jié)，共接種64個莖段。

上述4個試驗各處理接種后的培養(yǎng)瓶均放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：23～27℃、光照強度2000～3000 Lx、光照時間為14 h/d。接種后7 d內(nèi)觀察其污染情況，及時清除被污染的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)期間定期觀察不同階段培養(yǎng)苗的生長狀況，在40 d后，調(diào)查記錄試管苗的株高、芽增殖數(shù)、生根情況等指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NAA、6-BA和KT配比對黑玫瑰石竹試管苗芽增殖的影響

在培養(yǎng)基中添加植物生長素和細胞分裂素能促進芽或根的分化，經(jīng)試驗觀察，不同的NAA/6-BA濃度比對黑玫瑰石竹的芽增殖及株高影響不同，具體影響結(jié)果見表1。

由表1可見，當NAA濃度為0.1 mg/L和0.2 mg/L時，隨6-BA濃度的增大，莖長和增殖系數(shù)都有升高的趨勢。當NAA為0.1 mg/L，6-BA為1.5 mg/L（D1處理）時，芽的增殖系數(shù)比其他各個處理高，芽分化數(shù)多，并且株高最高，但此時由于6-BA濃度過高，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，因此，盡管D1處理芽增殖系數(shù)顯著高于D3，但不適宜黑玫瑰石竹的生長。D4處理對D6差異顯著，而試管苗卻矮小叢生。當NAA/6-BA比例都為0.2（D3，D5）時，增殖系數(shù)幾乎相等，但后者處理的試管苗莖細弱，不易移栽成活。因此，綜合增殖系數(shù)以及植株的生長情況，采用NAA/6-BA為0.1 mg/L/1.0 mg/L的比例即D2處理時，黑玫瑰石竹的芽分化最佳。

表1 不同NAA/6-BA濃度比例對黑玫瑰石竹試管苗芽增殖的影響

以上處理采用NAA和6-BA時，各植株均無生根現(xiàn)象出現(xiàn)。不同的NAA/KT濃度比對黑玫瑰石竹試管苗芽增殖的影響見表2。

表2 不同NAA/KT濃度比例對黑玫瑰石竹試管苗芽增殖的影響

由表2可見，NAA與KT組合對黑玫瑰石竹試管苗芽的增殖影響差異不顯著，而對其生根有促進作用，且對生根的影響差異表現(xiàn)為顯著，隨著NAA/KT比例的增加，生根數(shù)逐漸增多。觀察整個經(jīng)NAA與KT處理過的試管苗，在株高、莖粗等方面均比NAA與6-BA處理過的較好，但就單方面促進芽分化效果不及6-BA處理。由此可見，若要使黑玫瑰石竹組培快繁中獲得大量的試管苗，采用6-BA優(yōu)于KT。

2.2 不同碳源對黑玫瑰石竹試管苗生長分化的影響

不同碳源對黑玫瑰石竹試管苗生長分化的影響見表3。

由表3可見，蔗糖為碳源比白砂糖、麥芽糖的增殖系數(shù)都高，由試驗觀察，經(jīng)15 g/L的白砂糖處理的試管苗細弱；經(jīng)麥芽糖處理的試管苗葉色淺綠，并且30 g/L麥芽糖處理的試管苗莖最下端有干枯現(xiàn)象，不利于黑玫瑰石竹的組織快繁。以上各處理的植株均無生根現(xiàn)象出現(xiàn)。

表3 不同碳源對黑玫瑰石竹試管苗生長的影響

因此，在黑玫瑰石竹組培快繁中要獲得生長健壯、芽分化率較高的試管苗，并且在節(jié)省成本的前提下，宜采用15 g/L的蔗糖，也可用30 g/L的白砂糖代替，以降低成本。

2.3 大量元素濃度對黑玫瑰石竹試管苗生長分化的影響

對黑玫瑰石竹組培快繁培養(yǎng)基中大量元素進行減量或加倍，其影響結(jié)果見表4。

表4 不同大量元素濃度對黑玫瑰石竹試管苗生長的影響

從表4可以看出，MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑玫瑰石竹試管苗增殖系數(shù)最高，并且生長狀況均優(yōu)于其他培養(yǎng)基，各處理的試管苗均無生根現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，MS培養(yǎng)基為比較適宜的基本培養(yǎng)基。

2.4 幾種添加物對黑玫瑰石竹試管苗生長分化的影響

為了研究在黑玫瑰石竹組培快繁中添加物對試管苗生長的影響，本試驗添加了水解乳蛋白（LH）、谷氨酰胺（Gln）、椰汁和活性炭4種物質(zhì)，其具體影響情況見表5。

從表5，可以看出4種添加物對黑玫瑰石竹試管苗的生長有促進作用，谷氨酰胺對試管苗芽增殖的影響最顯著；4種添加物均都屬叢生分化，對株高的影響不顯著，而活性炭卻顯著提高其莖長。以上經(jīng)各添加物處理的試管苗只在芽分化上有差異，均無生根現(xiàn)象出現(xiàn)。接種40 d后的生長勢可參見圖1。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 外源激素對黑玫瑰石竹試管苗莖芽增殖和生根的影響 本試驗中，NAA存在時，培養(yǎng)基中加入6-BA能顯著促進黑玫瑰石竹試管苗的芽增殖，加入KT后其芽增殖效果沒有6-BA明顯，卻能顯著促使試管苗生長及根的發(fā)生。

一般6-BA適宜的質(zhì)量濃度范圍在0.5～2.0 mg/L之間[9]。本試驗采用 0.5、1.0、1.5 mg/L 的 6-BA，與NAA配合使用后發(fā)現(xiàn)隨6-BA濃度的增加，芽的增殖系數(shù)也明顯增加，但是當NAA為0.1 mg/L，6-BA為1.5 mg/L時，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不利于幼苗的生長，這是因為6-BA濃度過高，促使細胞分裂速度過快，新的細胞沒有充足的時間合成細胞內(nèi)各種物質(zhì)便進入下一次細胞分裂，結(jié)果細胞壁變薄，葉綠體形成少，植株則表現(xiàn)出失綠、半透明、液泡化的玻璃化現(xiàn)象，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)葉祖云[10]等已有研究。當NAA為0.2 mg/L時，6-BA隨濃度的增加其芽的增殖系數(shù)沒有NAA為0.1 mg/L時顯著。

在培養(yǎng)基中加入NAA和KT后，莖段的芽增殖系數(shù)較使用6-BA的低，劉開輝[11]等在對香石竹研究時也發(fā)現(xiàn)芽增殖與BA的濃度及BA和NAA的濃度比有關(guān)，但是在誘導黑玫瑰石竹根的發(fā)生方面可以配合使用NAA和KT，隨著NAA/KT濃度比的升高，生根條數(shù)逐漸增多，芽增殖系數(shù)卻下降，但并無顯著差異。

通過本試驗研究得出黑玫瑰石竹最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，這也與海石竹的增殖培養(yǎng)[12]有相似之處。

3.1.2 不同碳源對黑玫瑰石竹試管苗生長的影響在黑玫瑰石竹的組培快繁中，蔗糖、白砂糖、麥芽糖等多種碳水化合物均可作為碳源，我國關(guān)于不同碳源對石竹組織培養(yǎng)影響的研究較少，但在草莓[13-14]等其他木本植物的方面都有研究，出于節(jié)約成本考慮，均可用白砂糖代替蔗糖。在本試驗中，通過對蔗糖、白砂糖、麥芽糖三者的比較，以蔗糖作為碳源時莖段芽的增殖系數(shù)高，在實驗室中可用15 g/L的蔗糖；麥芽糖作碳源時增殖系數(shù)最低，并且長勢不好，因此，在黑玫瑰石竹的組培快繁中，如果需工廠化生產(chǎn)，并節(jié)約成本，可用30g/L的白砂糖代替蔗糖。

3.1.3 大量元素濃度變化對黑玫瑰石竹試管苗生長的影響 目前在關(guān)于石竹的組培研究中，普遍認為最適合芽增殖，愈傷組織誘導，初、繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基適于生根培養(yǎng)[15]。在本試驗中，1/2MS培養(yǎng)基無生根現(xiàn)象出現(xiàn)，可能是與本組試驗所加激素有關(guān)，NAA與6-BA配合使用顯著促進了黑玫瑰石竹芽的分化。由于其他培養(yǎng)基中大量元素濃度過低或過高，培養(yǎng)基中總鹽分、滲透壓過低或過高，使1/4MS和2MS的培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑玫瑰石竹試管苗都生長不良。

3.1.4 有機添加物和活性炭對黑玫瑰石竹試管苗生長的影響 在植物的組培快繁中，影響其繁殖系數(shù)的因素很多，除激素的種類配比和濃度，碳源種類和濃度，培養(yǎng)基的種類外，有機物的種類和濃度對其也有一定的作用。在重瓣絲石竹[16]的組織培養(yǎng)中，添加多效唑顯著地促進了組織培養(yǎng)苗生根，并且較高濃度的多效唑?qū)ηo尖外植體不定芽分化有明顯的增殖作用，同時抑制了試管苗玻璃化。在其他植物的組織培養(yǎng)中，添加香蕉泥、土豆泥、甘氨酸、肌醇、鹽酸、水解乳蛋白等[17-19]都對其組織培養(yǎng)的繁殖系數(shù)產(chǎn)生一定的影響。

通過本試驗，觀察到添加谷氨酰胺、水解乳蛋白和椰汁后，相對無添加物的對照而言，黑玫瑰石竹試管苗芽的增殖系數(shù)有顯著的提高，且谷氨酰胺影響最為顯著。谷氨酰胺作為培養(yǎng)基中重要的有機氮源，對植物組織培養(yǎng)物的生長有良好的促進效果；水解乳蛋白是多種氨基酸的混合物，對胚狀體或不定芽的分化有良好的促進作用；椰乳等天然的有機物能提供一些必要的微量營養(yǎng)成分，生理活性物質(zhì)和生長激素等[20]。添加活性炭提高了黑玫瑰石竹試管苗的莖長，沈?qū)帠|[21]等人的研究也得出類似的結(jié)論。因此，在條件許可的條件下，添加適量的添加物會對植物的離體培養(yǎng)產(chǎn)生一定的促進作用。

3.2 結(jié)論

在黑玫瑰石竹的組培快繁中，采用NAA/6-BA為0.1 mg/L/1.0 mg/L的濃度比對莖芽增殖的促進效果明顯，添加KT能顯著促進試管苗莖長和根的發(fā)生，若三者配合使用，可能效果更佳。

在實驗室中宜用15 g/L的蔗糖，其碳源適宜黑玫瑰石竹的組培快繁，若要工廠化生產(chǎn)，在節(jié)約成本的前提下，可用30 g/L的白砂糖代替蔗糖。

以MS為基本培養(yǎng)基最適宜黑玫瑰石竹的組培快繁，此時能提供植物所必需的營養(yǎng)并能維持一個適當?shù)臐B透勢。

初中學生心臟的容積雖有增大，但血液循環(huán)的路線隨著人體的成長延長了，因而使心臟的負擔加重。運動時間過長，運動量過大，都會引起頭暈、乏力等現(xiàn)象。因此，在體育教學中，教師要注意節(jié)制學生的運動量，以免過于疲勞。為了保持學生心臟健康，對于部分較胖的學生來說，不一定要跑步鍛煉，尤其是劇烈的長跑運動，長距離步行（快走）也能夠使他們結(jié)實、健康。

在黑玫瑰石竹的組培快繁中，添加谷氨酰胺和水解乳蛋白都對試管苗的莖芽增殖產(chǎn)生促進作用，使增殖系數(shù)顯著提高，椰汁能使莖變的粗壯，活性炭的添加提高了試管苗的莖長。

通過本試驗可預測適合黑玫瑰石竹組培快繁的培養(yǎng)基是 MS+NAA（0.1 mg/L）+6-BA（1.0 mg/L）+蔗糖（15 g/L）+Gln（100 mg/L）。

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