藍(lán)水生物技術(shù)——聚羥基脂肪酸酯的產(chǎn)業(yè)發(fā)展

尹進(jìn) 陳國強(qiáng)

聚羥基脂肪酸酯是一類生物基塑料，可通過生物轉(zhuǎn)化過程生產(chǎn)。然而生物轉(zhuǎn)化過程存在滅菌過程耗能、發(fā)酵過程消耗淡水資源、底物成本較高等缺點(diǎn)致使其產(chǎn)品的成本居高不下，難以與化工產(chǎn)品相競爭。嗜鹽微生物由于可在含有高濃度鹽的環(huán)境（如海水）中生長，可應(yīng)用于無滅菌的開放式連續(xù)發(fā)酵過程。結(jié)合分子和遺傳等合成生物學(xué)手段對嗜鹽微生物進(jìn)行改造，這種新概念的生物技術(shù)——藍(lán)水生物技術(shù)，有望大大降低生物轉(zhuǎn)化過程的成本。

一、生物基塑料聚羥基脂肪酸酯（PHA）

1.聚羥基脂肪酸酯簡介

聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）是一類高分子聚酯的統(tǒng)稱，在現(xiàn)有的生物基塑料當(dāng)中是唯一一種完全由微生物合成的生物材料[1]。PHA作為微生物在碳源過剩而其他營養(yǎng)物質(zhì)限制條件下用于貯藏碳源和能源的物質(zhì)，廣泛存在于多種微生物的細(xì)胞當(dāng)中，一般為胞內(nèi)顆粒物[2]。

PHA的單體一般為3-羥基脂肪酸，單體的多樣性造成了PHA種類的多樣性[2]。PHA有多種分類方式，根據(jù)單體碳鏈長度可分為短鏈PHA、中長鏈PHA以及短鏈和中長鏈的共聚PHA；根據(jù)聚合方式可分為均聚物、隨機(jī)共聚物和嵌段共聚物[3]。

PHA結(jié)構(gòu)的多樣化帶來多種多樣的性能，從堅(jiān)硬質(zhì)脆的硬塑料到柔軟的彈性塑料、纖維等，再加上其生物可降解性、生物相容性和可再生資源合成的特點(diǎn)，在化工產(chǎn)品、醫(yī)用植入材料、藥物緩釋載體、燃料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。

2.聚羥基脂肪酸酯的產(chǎn)業(yè)化情況

PHA的產(chǎn)業(yè)化嘗試在20世紀(jì)70年代就已經(jīng)開展。目前實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的PHA主要為聚3-羥基丁酸酯（PHB）、3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物（PHBV）、3-羥基丁酸酯和3-羥基己酸酯的共聚物（PHBHHx）、聚3-羥基丁酸酯和4-羥基丁酸酯的共聚物（P3HB4HB）。然而PHA的生產(chǎn)成本過高，難以與石油基塑料競爭，因而也大大限制了PHA的大規(guī)模商業(yè)化。

包括PHA生產(chǎn)在內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程的生產(chǎn)成本過高主要由以下幾點(diǎn)造成：第一，底物（原材料）價格偏高，例如葡萄糖來源于淀粉水解，其價格增長迅速，且淀粉來源于糧食作物，大量使用于工業(yè)生產(chǎn)會造成“與人爭糧”的問題；第二，生物轉(zhuǎn)化過程通常需要消耗大量的淡水，這又會加重水資源問題，PHA的生產(chǎn)成本當(dāng)中底物和淡水的成本就占了將近一半；第三，為了避免雜菌污染，整個生物反應(yīng)體系包括發(fā)酵罐、管道以及底物培養(yǎng)基都需要進(jìn)行高溫高壓蒸汽的滅菌處理，這一過程會消耗很多能量；第四，同樣是為了避免雜菌污染，生物轉(zhuǎn)化（發(fā)酵）過程是按批次不連續(xù)的，這雖然可以降低雜菌污染的幾率但也降低了生產(chǎn)效率，而且每一批次的發(fā)酵過程都需要進(jìn)行滅菌處理，這又增加了滅菌的次數(shù)及其所帶來的能量消耗，這一能耗成本可占總成本的1/4左右；第五，為了耐受滅菌過程的高溫高壓蒸汽，發(fā)酵設(shè)備需要不銹鋼等堅(jiān)實(shí)材料制造，其價格不菲；最后，每一批次的發(fā)酵過程為了避免雜菌污染，操作復(fù)雜、耗時耗力，在一定程度上增加了人力成本[4，5]。

解決PHA產(chǎn)業(yè)化的問題有2種思路：一是改善和提高PHA的材料性能，賦予其優(yōu)于石油基塑料的高附加值，尋找對應(yīng)的應(yīng)用領(lǐng)域；二是通過合適的手段大幅降低PHA的生產(chǎn)成本，使之接近甚至低于石油基塑料。

二、藍(lán)水生物技術(shù)：基于嗜鹽微生物的低成本生產(chǎn)技術(shù)

從上文所述的生物轉(zhuǎn)化過程的成本因素可知，底物成本和滅菌能耗是造成高成本的主要因素。如能使用價格低廉的底物，減少淡水資源的使用，同時降低甚至取消滅菌過程帶來的能耗，則有可能實(shí)現(xiàn)低成本的生產(chǎn)技術(shù)。而嗜鹽微生物恰好能夠滿足低成本生產(chǎn)技術(shù)的這幾點(diǎn)要求。

1.嗜鹽微生物簡介

嗜鹽微生物（halophiles或halophilic microorganisms）是一類需要環(huán)境中存在較高濃度的氯化鈉（NaCl）才能生長的微生物，廣泛存在于古菌界、細(xì)菌界和真核生物界[6]。根據(jù)最適生長條件下的鹽濃度，嗜鹽微生物大致分類為中度嗜鹽微生物和極端嗜鹽微生物，前者的適宜生長的鹽濃度范圍為3%～15%，后者的最適生長鹽濃度則在15%以上。

嗜鹽微生物中存在2種機(jī)制防止過多的鹽擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而能夠在高鹽環(huán)境中生存。第1種存在于好氧的極端嗜鹽古菌和一些厭氧的嗜鹽細(xì)菌，是在胞內(nèi)積累一些礦物鹽離子來平衡胞外的滲透壓[7]。第2種存在于多數(shù)嗜鹽細(xì)菌和嗜鹽真核生物，在胞內(nèi)積累小分子的水溶性有機(jī)化合物來維持胞內(nèi)低的鹽濃度的同時平衡胞外滲透壓，這些有機(jī)化合物被稱為親和性溶質(zhì)，四氫嘧啶是嗜鹽微生物主要的親和性溶質(zhì)[6]。親和性溶質(zhì)是一種穩(wěn)定劑，除了使細(xì)胞耐受高鹽濃度，還可以耐受高溫、干燥、寒冷甚至冰凍環(huán)境，因此可用于蛋白質(zhì)、DNA和哺乳動物細(xì)胞的保護(hù)劑[8]。

一些嗜鹽微生物的生存環(huán)境為生物量極少的鹽堿環(huán)境，當(dāng)有生物質(zhì)（如腐爛植物或動物尸體）進(jìn)入到該環(huán)境時，嗜鹽微生物就要充分利用這些生物質(zhì)，因此這些嗜鹽微生物能夠分泌各種水解酶，包括淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等[8]。由于這些水解酶能夠在高鹽濃度的條件下發(fā)揮作用，因而被稱為嗜鹽水解酶。一些嗜鹽水解酶還具有熱穩(wěn)定性和廣范圍的pH適應(yīng)性，這些獨(dú)特的性質(zhì)使得嗜鹽水解酶具有其特殊的應(yīng)用價值。

2.基于嗜鹽微生物的低成本生產(chǎn)技術(shù)

嗜鹽微生物的生長環(huán)境為高鹽濃度，且有些嗜鹽微生物同時還喜歡在堿性條件下生長，在這種高鹽高堿條件下普通的微生物難以生存，因此用于培養(yǎng)嗜鹽微生物的培養(yǎng)基即便在沒有滅菌的情況下也很難染雜菌。

以嗜鹽微生物作為工業(yè)生產(chǎn)菌株，就能夠?qū)崿F(xiàn)無滅菌開放式發(fā)酵（見表1），從而減少滅菌過程的能耗及其所帶來的復(fù)雜操作和人力成本[6]；同時無滅菌發(fā)酵可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)式發(fā)酵，一方面減少了批次發(fā)酵過程中每一批次的滅菌和清洗等操作，另一方面連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)效率高于批次發(fā)酵；無需滅菌還意味著生物反應(yīng)器無需使用不銹鋼材料來耐受高溫高壓蒸汽，使用塑料或陶瓷等材料可降低設(shè)備成本。培養(yǎng)嗜鹽微生物需要含高濃度鹽的底物培養(yǎng)基，這意味著可以使用海水來替代淡水資源，從而避免水資源問題[9，10]。如上文所述，一些嗜鹽微生物能夠分泌各種水解酶，則有可能使用廉價的混合底物，如含有淀粉、纖維素，甚至是富營養(yǎng)廢水、餐廚垃圾、地溝油等。

綜合以上幾點(diǎn)，嗜鹽微生物利用海水和廉價底物進(jìn)行無滅菌開放連續(xù)式發(fā)酵，可大大降低發(fā)酵過程的生產(chǎn)成本。另外，一些嗜鹽微生物受到低滲處理后細(xì)胞壁會出現(xiàn)破裂，對于PHA等胞內(nèi)產(chǎn)物，可簡化破裂細(xì)胞提取產(chǎn)物的復(fù)雜度和成本[6]。這種利用嗜鹽微生物以海水為介質(zhì)的低成本生產(chǎn)技術(shù)被稱之為藍(lán)水生物技術(shù)（圖1）。

目前應(yīng)用嗜鹽微生物最成功的例子是利用嗜鹽微藻杜氏鹽藻Dunaliella合成-胡蘿卜素和甘油，已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)；在嗜鹽古菌Halobacterium菌屬種有一種獨(dú)特的光驅(qū)動質(zhì)子泵蛋白菌視紫紅質(zhì)，也實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)[11]。

3.嗜鹽微生物生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯

自從1972年第1次報道在嗜鹽微生物中發(fā)現(xiàn)PHA以來，越來越多的嗜鹽微生物被發(fā)現(xiàn)可以合成PHA。嗜鹽古菌Haloferaxmediterranei能夠積累占細(xì)胞干重46%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的PHA，以葡萄糖或淀粉為碳源時合成的PHA種類為共聚物PHBV[12]。據(jù)報道利用Haloferaxmediterranei生產(chǎn)PHBV的成本比利用重組型大腸桿菌要低30%[13]。

合成PHA的嗜鹽微生物的另一代表性菌株是玻利維亞鹽單胞菌Halomonasboliviensis。該菌能夠耐受的鹽濃度范圍為0～25%，可在0～45℃，pH6～11的環(huán)境中生長。該菌能夠利用多種底物，包括葡萄糖、木糖、蔗糖等來生產(chǎn)PHB。在優(yōu)化條件時，其合成的PHB的分子量能夠達(dá)到

百萬道爾頓[6]。

在一些情況下嗜鹽微生物在合成PHA的同時還會合成親和性溶質(zhì)。Methylarcula marina和Methylarculaterricola兩株嗜鹽菌在6%～10%鹽濃度的環(huán)境中合成四氫嘧啶和谷氨酸等親和性溶質(zhì)以及18%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的PHB；鹽單胞菌屬Halomonascampaniensis在5.8%鹽濃度下可以同時積累PHB和四氫嘧啶；還有報道利用鹽單胞屬的幾種菌株實(shí)現(xiàn)40%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的PHB和10%的四氫嘧啶的共產(chǎn)。研究證明PHB合成途徑和四氫嘧啶合成途徑均以乙酰輔酶A為前體，但是2條途徑分別由營養(yǎng)限制和鹽濃度壓力2種不同的因素來啟動。用兩步法培養(yǎng)玻利維亞鹽單胞菌，第1步在最適生長條件下培養(yǎng)細(xì)胞，第2步提高鹽濃度來促進(jìn)四氫嘧啶的合成，同時限制營養(yǎng)促使細(xì)胞積累PHB，最終得到占細(xì)胞干重13.2%的四氫嘧啶和68.5 %（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的PHB[14]。

筆者實(shí)驗(yàn)室從新疆鹽湖土壤樣品中分離篩選得到的2株嗜鹽微生物，分別命名為鹽單胞菌HalomonasTD01和鹽單胞菌HalomonascampaniensisLS21，應(yīng)用于無滅菌的開放式連續(xù)發(fā)酵，均表現(xiàn)出了優(yōu)異的PHA合成能力。

鹽單胞菌TD01為革蘭氏陰性的中度嗜鹽菌，耐受的鹽濃度為10～250g/L，最適為60g/L；pH耐受范圍為5～11，最適為9；可耐受0～45℃的溫度，最適為37℃。野生型的鹽單胞菌TD01能夠以葡萄糖為唯一碳源合成80%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）以上的PHB。用2個發(fā)酵罐體系進(jìn)行鹽單胞菌TD01的無滅菌連續(xù)發(fā)酵，第1個發(fā)酵罐用于培養(yǎng)細(xì)菌，并將其中的細(xì)菌和培養(yǎng)基連續(xù)地泵入第2個發(fā)酵罐；第2個發(fā)酵罐的培養(yǎng)基含有葡萄糖且限制氮源以促使細(xì)菌進(jìn)行PHB積累。最終在第1個發(fā)酵罐中細(xì)胞干重達(dá)到40g/L，PHB含量為60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），葡萄糖到PHB的碳源轉(zhuǎn)化率在20%～30%之間；而在第2個發(fā)酵罐中細(xì)胞干重較低，在20g/L左右，但PHB含量保持在70%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）以上，碳源轉(zhuǎn)化率超過了50%。整個發(fā)酵過程持續(xù)了14天，沒有發(fā)生雜菌污染[9]。利用該菌在山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司進(jìn)行無滅菌發(fā)酵生產(chǎn)的中試，經(jīng)粗略核算PHA的生產(chǎn)成本能夠降低近一半[15]。

鹽單胞菌LS21同樣為一株中度嗜鹽菌，生長最適鹽濃度為40～60 g/L，pH耐受范圍為8～11，最適為10，生長溫度范圍為25～55℃，最適為37～42℃，可在人工海水或天然海水為介質(zhì)的培養(yǎng)基中生長。利用該菌及其重組菌進(jìn)行的無滅菌連續(xù)發(fā)酵，其過程持續(xù)了65天，且無雜菌污染，細(xì)胞干重最高達(dá)到70g/L，PHB最高含量達(dá)到74%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）[10]。

這些結(jié)果均說明嗜鹽微生物在利用低成本生產(chǎn)工藝的藍(lán)水生物技術(shù)來生產(chǎn)PHA方面具有良好的應(yīng)用前景。

三、應(yīng)用合成生物學(xué)手段改良嗜鹽微生物

嗜鹽微生物作為一類具有工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景的菌株，應(yīng)當(dāng)滿足對其進(jìn)行分子和遺傳改造來改良特性，優(yōu)化產(chǎn)量的需求。經(jīng)過20多年的開發(fā)和發(fā)展，已經(jīng)有多種適用于嗜鹽微生物的分子生物學(xué)工具，如表達(dá)載體、啟動子、基因突變、基因敲除技術(shù)等[16]。合成生物學(xué)的不斷發(fā)展可以使研究者對野生菌株進(jìn)行系統(tǒng)水平上的改造，構(gòu)建性能優(yōu)良的底盤微生物。

組學(xué)技術(shù)為揭示并系統(tǒng)解析細(xì)胞內(nèi)的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其變化機(jī)制提供了手段，使合成生物學(xué)改造底盤微生物更具有靶向性。近年來越來越多的嗜鹽微生物有全基因組測序和分析信息，包括鹽單胞菌TD01、LS21以及嗜鹽古菌Haloferaxmediterranei、H. volcanii等，為定向改造這些嗜鹽微生物提供了依據(jù)[5]。

例如，細(xì)菌只有一微米的維度，密度小，很難從高密度的發(fā)酵液中分離出來，高速離心等操作所帶來的能耗也額外增加了成本。通過形態(tài)學(xué)工程改造細(xì)菌，可以使細(xì)菌體積增大，使之有利于分離。Tan等（2015）報道了在鹽單胞菌TD01中過表達(dá)細(xì)胞分裂抑制蛋白MinCD，促使細(xì)胞纖長化達(dá)到近百微米，菌體之間相互纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以加快菌體自沉，簡化下游處理步驟。同時細(xì)菌的纖長化還增加了胞內(nèi)PHA的容納空間，PHA的含量從野生型對照的69%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）提高到了82%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）[17]。

嗜鹽微生物以葡萄糖、淀粉等廉價底物為單一碳源時通常只會生產(chǎn)單一種類的PHA，另外細(xì)菌生長過程中還會產(chǎn)生各種次級代謝產(chǎn)物從而影響碳源到目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。通過遺傳改造和代謝工程手段可以使嗜鹽微生物生產(chǎn)其他種類的PHA，通過基因敲除可以阻止碳源被代謝為其他產(chǎn)物。例如，野生型鹽單胞菌TD01以葡萄糖為單一碳源時生產(chǎn)的PHA種類為PHB，在其基因組上表達(dá)異源基因構(gòu)建新的代謝通路可以使重組菌以葡萄糖為單一碳源生產(chǎn)PHBV[18]。在嗜鹽古菌Haloferax中，在敲除pyrF基因（乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶）的基礎(chǔ)上，以5-氟乳清酸和尿嘧啶作為選擇壓力，可大大提高雙交換的效率，多次應(yīng)用到了其他基因的敲除中，可用于次級代謝產(chǎn)物通路的敲除[19]。

嗜鹽微生物多為好氧型，發(fā)酵過程需要壓縮空氣并鼓入發(fā)酵體系當(dāng)中，而這一部分的能耗占發(fā)酵過程中所有能耗的近一半。因此若能夠提高嗜鹽微生物在微氧條件下的氧氣利用率和PHA合成效率，則有可能降低壓縮和鼓入空氣的能耗和相應(yīng)成本。Wu等（2014）在大腸桿菌中利用串聯(lián)重復(fù)的微氧啟動子來表達(dá)PHB合成通路的基因，提高了菌株微氧合成PHB的能力，在微氧條件下積累量最高可以達(dá)到90%[20]。若能將該技術(shù)應(yīng)用到嗜鹽微生物當(dāng)中，有可能提高嗜鹽微生物在發(fā)酵過程中氧氣不足條件下的PHA合成能力。

四、結(jié)語

成本問題是造成聚羥基脂肪酸酯在內(nèi)的生物基材料難以與石油基材料相競爭的主要原因。底物成本、滅菌能耗、下游處理等多個因素造成了生物基材料的成本過高。以嗜鹽微生物為生產(chǎn)菌株的藍(lán)水生物技術(shù)能夠解決生物轉(zhuǎn)化過程中的大部分問題：以海水代替淡水，使用廉價底物、無滅菌的連續(xù)開放式發(fā)酵降低了發(fā)酵過程的能耗和成本。利用這種低成本的生產(chǎn)工藝，結(jié)合合成生物學(xué)的改造手段，有望將生物基材料的高成本因素逐一克服，藍(lán)水生物技術(shù)可能帶來發(fā)酵工業(yè)的革命。

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