鹽酸多西環(huán)素臨床治療異育銀鯽嗜水氣單胞菌感染的給藥方案的制定

邴曉菲，孫朋輝，王　浩，呂利群

(國家水生動物病原庫，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點實驗室，

上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上?！?01306)

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鹽酸多西環(huán)素臨床治療異育銀鯽嗜水氣單胞菌感染的給藥方案的制定

邴曉菲，孫朋輝，王浩，呂利群

(國家水生動物病原庫，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點實驗室，

上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306)

摘要：通過高效液相色譜法(HPLC法)測定鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)血清中不同時間點的血藥濃度，并結(jié)合藥物的體外藥效學參數(shù)，確定該藥的臨床給藥方案。結(jié)果顯示，鹽酸多西環(huán)素對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，AH10)的最小抑菌濃度(MIC)為0.4 μg/mL，最小殺菌濃度(MBC)為3.2 μg/mL，防耐藥突變濃度(MPC)為4.8 μg/mL，耐藥選擇窗(MSW)為0.4～4.8 μg/mL。鹽酸多西環(huán)素的抗菌后效應(PAE)約為2 h；在異育銀鯽中能夠達到良好的抑菌殺菌效果的鹽酸多西環(huán)素口灌劑量是20 mg/kg，休藥期至少為25 d；能夠控制耐藥菌株產(chǎn)生的鹽酸多西環(huán)素口灌劑量是80 mg/kg，休藥期至少為60 d。

關鍵詞：鹽酸多西環(huán)素；異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)；嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)；藥效動力學；藥代動力學

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是中國常見經(jīng)濟型淡水魚，近年來集約化養(yǎng)殖導致細菌性疾病肆虐，其中嗜水氣單胞菌能廣泛引起淡水魚類的細菌性敗血癥，被認為是引發(fā)傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖魚類爆發(fā)性疾病的最重要病原[1]。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，AH10)是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性菌，感染魚體后先在腸道內(nèi)增殖，再經(jīng)門動脈循環(huán)進入肝臟、腎臟及其它組織，引起肝臟、腎臟等器官以及血液病變，繼而出現(xiàn)全身癥狀。AH10在魚體疾病感染中屬中等致病菌，代表性突出，研究價值高。

1材料與方法

1.1試驗魚

試驗用健康異育銀鯽購自上海金山養(yǎng)殖場，平均體重(200±50)g，試驗期間暫養(yǎng)于實驗室0.4 m×0.5 m×1 m的水族箱里，水溫控制在(20±1)℃。

1.2材料與儀器

鹽酸多西環(huán)素原料藥(純度≥98%)、鹽酸多西環(huán)素標準品(阿拉丁-D111942)、Muller-Hinton(MH)培養(yǎng)基、乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)、草酸(A.R)、十二水合磷酸氫二鈉(A.R)、檸檬酸一水物(A.R)、EDTA·2Na(A.R)均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。Agilent 1100高效液相色譜儀；漩渦振蕩器；高速離心機；恒溫水浴鍋等。

EDTA-McIlvaine 緩沖液：稱取0.60 g 十二水合磷酸氫二鈉、0.52 g 檸檬酸一水物、0.15 g EDTA·2Na溶于40 mL純凈水中。

1.3試驗菌株

嗜水氣單胞菌AH10，由上海海洋大學國家水生動物病原庫分離保存。

1.4鹽酸多西環(huán)素對AH10的體外藥效學指標測定

1.4.1最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

采用平板劃線法挑取單個菌落于MH肉湯中過夜培養(yǎng)至菌液濃度為106CFU/mL，用該菌液分別稀釋藥物濃度為128、12.8、6.4……0.025 μg/mL，于30 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，無菌落生長的藥物濃度即為MIC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后涂板，菌落數(shù)小于5的藥物濃度即為MBC。重復試驗5次，取平均值即為MIC和MBC值。

1.4.2防耐藥突變濃度(MPC)和耐藥選擇窗(MSW)

平板劃線法培養(yǎng)單個菌落，挑取單個菌落于MH肉湯中過夜培養(yǎng)，然后3 000 r/min離心后剔去肉湯，重加10倍原MH肉湯，震蕩培養(yǎng)6 h，同樣離心后剔除肉湯并將菌液稀釋到3×1010CFU/mL。采用瓊脂平板法[6]，配制藥物濃度分別為2 MIC、4 MIC、6 MIC、8 MIC、10 MIC、12 MIC、14 MIC的瓊脂平板，取0.1 mL 3×1010CFU/mL菌液分別涂布到上述各含不同藥物濃度的瓊脂平板上，使總接種量達1.2×1010CFU，于30 ℃恒溫箱中孵育72 h，沒有菌落生長的最低藥物濃度即為MPC，重復操作5次，取平均值即為MPC的值。MIC和MPC之間的濃度范圍即為MSW。

1.4.3抗菌后效應(PAE)

參考劉遠飛[7]方法，配制分別含有10 MIC、20 MIC、40 MIC藥物濃度的藥液0.2 mL和濁度為106CFU/mL菌液1.8 mL作為試驗組T1、T2、T3，同樣方法配制0.8 MIC和0 MIC作為對照組C1、C2。將兩組都置于30 ℃恒溫水浴中孵育2 h。采用400倍除藥法，分別取0.1 mL的上述試驗組和對照組的混合液加入到1.9 mL肉湯中，同樣方法再稀釋一次，然后置于30 ℃恒溫搖床中孵育，此時設為PAE的零時。分別在0～8 h的整時間點對各菌液進行系列稀釋計數(shù)，重復試驗3次，每個時間點取平均值建立細菌恢復生長曲線，根據(jù)公式PAE=T-C，得PAE值，其中T、C分別為細菌菌液濃度高于零時10倍所需時間。

1.5鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽體內(nèi)的藥動學研究

1.5.1給藥和采樣

將異育銀鯽分成五組，每組按20、30、70、80 mg/kg的藥物劑量單次口灌入異育銀鯽前腸，觀察無回吐者用于試驗。分別在給藥第0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、24、48、72、120、192、240、480 h自尾靜脈取血液、肌肉樣品，重復5次，并取空白樣品作為對照。血液樣品于4 ℃冰箱中靜置8～10 h，4 000 r/min離心得血清于離心管中，血清和肌肉同置于-20 ℃保存待處理。

1.5.2色譜條件

參考符華林等[8]HPLC色譜條件。色譜柱：RP-ODSC18分析柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液=2∶1∶7(V/V/V)；流速：0.8 mL/min；紫外檢測波長：346 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.5.3樣品預處理

參考符華林等[8]血清樣品處理方法，血清(肌肉)解凍后取500 μL(1 g)于15 mL離心管中，加入200 μL EDTA-McIlvaine 緩沖液，2.0 mL甲醇，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL離心管中，置于通風廚中50 ℃水浴蒸干，加入500 μL流動相復溶，經(jīng)0.22 μm有機相一次性針頭過濾器過濾，20 μL進樣分析。

1.5.4標準曲線的繪制

準確稱取0.01 g鹽酸多西環(huán)素標準品，溶解于10 mL流動相中，配制成濃度為1 mg/mL鹽酸多西環(huán)素溶液，并用流動相稀釋成200、100、20、10、5、1、0.25、0.025 μg/mL系列濃度的藥液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣分析，每個濃度做3個平行測定。建立標準曲線，得回歸方程及相關系數(shù)。

1.5.5回收率和精密度

配制200、20、2 μg/mL標準液，取解凍空白血清400 μL，加入100 μL標準液，按上述樣品處理方法進行處理，最終復溶后的理論藥液濃度為100、10、1 μg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后，進行HPLC測定。每個濃度做3個平行測定，根據(jù)實測濃度和理論濃度計算相對回收率。日內(nèi)做5個重復，一周內(nèi)做5個重復，計算日內(nèi)平均變異系數(shù)和日間平均變異系數(shù)。

1.5.6數(shù)據(jù)處理

經(jīng)Agilent 1100高效液相色譜儀測定得到的數(shù)據(jù)，用Excel處理數(shù)據(jù)，用Kinetic 4.4 藥代動力學軟件擬合動力學模型，得到相關動力學參數(shù)及方程式。

2結(jié)果

2.1鹽酸多西環(huán)素體外藥效學研究結(jié)果

鹽酸多西環(huán)素對嗜水氣單胞菌AH10的MIC為0.4 μg/mL，MBC為3.2 μg/mL，MPC為4.8 μg/mL，MSW 為0.4～4.8 μg/mL；嗜水氣單胞菌AH10與濃度分別為1 MIC、2 MIC、4 MIC的鹽酸多西環(huán)素藥液接觸1 h后的PAE分別為(1.25±0.11)、(1.73±0.10)、(2.62±0.15)h。由圖1可知，去除藥物后，0 MIC和0.08 MIC藥物濃度的曲線幾乎重合，說明400除藥法可以去除藥物；在1～4 MIC范圍內(nèi)，隨著鹽酸多西環(huán)素藥物濃度升高PAE逐漸延長。

圖1　鹽酸多西環(huán)素和AH10接觸1 h后，

2.2鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽體內(nèi)藥代動力學研究結(jié)果

2.2.1標準工作曲線

本研究以鹽酸多西環(huán)素濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，建立標準工作曲線(圖2)，在0.05～200 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，Y=34.54X-7.5，r=0.999，最低檢測限為0.05 μg/mL。

圖2　鹽酸多西環(huán)素標準工作曲線

2.2.2回收率和精密度

應用1.5.3的樣品處理方法得到鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽血清中的平均回收率為90.74%，日內(nèi)平均變異系數(shù)為2.38%，日間平均變異系數(shù)為3.22%。說明異育銀鯽血清的處理方法精密度高，符合要求。

2.2.3鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽血清中的代謝規(guī)律

由圖3可知，給異育銀鯽口灌不同劑量的鹽酸多西環(huán)素24 h內(nèi)血清中藥物濃度變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)出明顯的雙峰現(xiàn)象。一次性口灌劑量為20 mg/kg和30 mg/kg鹽酸多西環(huán)素藥物時分別在1 h、6 h和0.5 h、6 h出現(xiàn)峰值，且峰值分別為(2.43±0.12)μg/mL、(4.16±0.13)μg/mL和(1.9±0.7)μg/mL、(3.2±0.12)μg/mL，口灌劑量為20 mg/kg時異育銀鯽血清中鹽酸多西環(huán)素濃度維持在MIC之上的時間是23 h，外加PAE的2 h，總維持時間是25 h，口灌劑量為30 mg/kg時異育銀鯽血清中的鹽酸多西環(huán)素濃度維持在MIC之上的時間遠遠超過24 h。

異育銀鯽口灌劑量為70 mg/kg和80 mg/kg鹽酸多西環(huán)素時血清中藥物濃度分別在0.5 h、4 h和0.25 h、4 h達到峰值，且峰值分別為(7.53±0.13)μg/mL、(6.5±0.15)μg/mL和(11.41±0.12)μg/mL、(10.2±0.09)μg/mL。在70 mg/kg和80 mg/kg這兩個口灌劑量中，異育銀鯽血清中鹽酸多西環(huán)素濃度24 h內(nèi)維持在MPC之上的是80 mg/kg的口灌劑量。

圖3　口灌不同劑量鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽血清中

2.2.4鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽血清中PK參數(shù)

將不同口灌劑量下異育銀鯽血清中鹽酸多西環(huán)素隨時間變化的數(shù)據(jù)輸入Kinetic 4.4軟件進行房室模型擬合，結(jié)果顯示，均符合一級吸收二室模型。參數(shù)見表1、表2。

2.2.5PK-PD聯(lián)合參數(shù)確定給藥方案

參考PK-PD聯(lián)合參數(shù)確定給藥方案即參考AUC24/MIC和Cmax/MIC的值。結(jié)果顯示，口灌劑量分別為20、30、70、80 mg/kg時異育銀鯽血清中鹽酸多西環(huán)素濃度隨時間變化曲線下得到的AUC24/MIC為84.22、93.01、240.48、359.10，Cmax/MIC為6.08、10.40、18.83、28.53。

表1　口灌不同劑量鹽酸多西環(huán)素在

注：Ka：吸收速率常數(shù)；Kel：藥物在中央室的消除速率常數(shù)；K12：由中央室到周邊室的一級轉(zhuǎn)運速率常數(shù)；α：分布速率常數(shù)；β：消除速率常數(shù)；A：分布相零時截距；T1/2α:吸收半衰期；T1/2β：消除半衰期；B：消除相零時截距；Tmax：達峰時間；Cmax：達峰濃度；AUC：藥時曲線下總面積；AUC24：0～24 h內(nèi)藥時曲線下面積

表2　口灌不同劑量鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽血清中

按歐盟和中國規(guī)定的強力霉素在可食組織肌肉中最高殘留限量(MRL)300 μg/kg計算休藥期[2]。研究結(jié)果顯示，異育銀鯽口灌劑量20 mg/kg時肌肉中鹽酸多西環(huán)素濃度在12 h到達峰值為(1.25±0.08)μg/g，在給藥第20、25 d肌肉中鹽酸多西環(huán)素濃度分別為(0.32±0.10)、(0.25±0.05)μg/g(圖4)。異育銀鯽口灌劑量80 mg/kg時肌肉中鹽酸多西環(huán)素濃度在10 h到達峰值為(2.74±0.14)μg/g，在給藥第50、60 d肌肉中鹽酸多西環(huán)素濃度分別為(0.28±0.03)、(0.25±0.04)μg/g(圖4)。因此，為達到國家規(guī)定最大殘留限量300 μg/kg，異育銀鯽口灌劑量分別為20、80 mg/kg時的休藥期至少為25 d和60 d。

圖4　異育銀鯽口灌不同劑量鹽酸多西環(huán)素

3討論

由藥效學結(jié)果可知，鹽酸多西環(huán)素對嗜水氣單胞菌AH10具有較好的抗菌活性，但MSW的跨度較大，水產(chǎn)動物用藥后體內(nèi)藥物濃度很容易落在這個跨度內(nèi)，因此，細菌產(chǎn)生耐藥性的可能性也會加大；PAE會隨著藥物濃度的升高呈現(xiàn)出明顯的延長趨勢，在實際用藥中可適當延長用藥間隔大約2 h。由藥代動力學參數(shù)可知，鹽酸多西環(huán)素在異育銀鯽血清中吸收較快，消除緩慢，這可能與鹽酸多西環(huán)素同蛋白的結(jié)合率有關。Majewski[9]指出，鹽酸多西環(huán)素與血漿蛋白結(jié)合率為82%～95%，而四環(huán)素只有65%。

異育銀鯽口灌不同劑量鹽酸多西環(huán)素血清中藥時曲線呈現(xiàn)明顯的雙峰現(xiàn)象，這一現(xiàn)象同彭新亮等[3]的研究結(jié)果一致，丁俊仁[2]的研究結(jié)果則未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。有關雙峰現(xiàn)象曾有過不少研究報道，彭新亮等[3]認為出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象的可能原因是某部位對藥物吸收存在重吸收作用，肝腸循環(huán)是最具有可能的一種機制。周懷梧[10]的研究中也有相同的解釋。同時，是否出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象還可能與藥物的種類和動物種屬差異有密切關系，此外采樣點的設定和分析模型的選擇對于雙峰及多峰現(xiàn)象的出現(xiàn)亦有一定的影響[11]。

在傳統(tǒng)的PK-PD聯(lián)合參數(shù)的基礎上，近年來提出的MSW、MPC的理論進一步補充了抗菌藥物臨床用藥的評定標準，有利于提高抗菌藥的用藥效果，為臨床提供有價值的用藥建議[12]。XU等[13]、李夢影等[14]應用MPC、MSW理論并結(jié)合體內(nèi)藥代學參數(shù)制定不同抗生素的用藥方案。丁運敏[15]研究指出，強力霉素對嗜水氣單胞菌的藥效與藥物濃度關系密切。當Cmax/MIC>3.96和AUC24/MIC>77.28時，強力霉素能夠?qū)κ人畾鈫伟鸬匠掷m(xù)的抑制作用。本實驗結(jié)果中，同時基于異育銀鯽血清中血藥濃度24 h內(nèi)維持在MIC之上的最低給藥劑量是20 mg/kg，且濃度依賴性藥物適宜每日1次給藥[16]。石煥階[17]的研究中指出，濃度依賴型藥物AUC24/MIC>125，Cmax/MIC>8時不但起效快，且有效殺滅細菌和抑制耐藥菌株產(chǎn)生，臨床有效率可>90%，故應該大劑量每日1次給藥。研究結(jié)果顯示，異育銀鯽口灌劑量為70、80 mg/kg時能滿足以上條件，同時，基于異育銀鯽血清中血藥濃度24 h內(nèi)維持在MPC之上的最低給藥劑量是80 mg/kg。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖中，如果選用鹽酸多西環(huán)素作為治療異育銀鯽細菌性敗血癥的抗生素藥物，建議的用藥方案是首次用藥按20 mg/kg劑量，每日一次給藥，休藥期不低于25 d。由于實驗結(jié)果顯示的MSW跨度較大，再次用藥很容易產(chǎn)生耐藥菌株，因此，再次用藥建議的用藥方案是每日一次80 mg/kg劑量給藥，休藥期不低于60 d。

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(責任編輯：鄧薇)

Principles for drawing medication regimen of doxycycline hydrochloride against Aeromonas hydrophila infection in Carassius auratus gibelio

BING Xiao-fei,SUN Peng-hui,WANG Hao,LV Li-qun

(NationalPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals/KeyLaboratoryofFresheryGermplasmResources/CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：We determined the concentration-time curves of serum doxycycline hydrochloride at several different time points post drug-dosing by high performance liquid chromatography (HPLC).The results showed that the MIC of doxycycline hydrochloride on Aeromonas hydrophila,AH10 was 0.4 μg/mL,the MBC was 3.2 μg/mL,the MPC was 4.8 μg/mL,the MSW was between 0.4 μg/mL and 4.8 μg/mL,PAE was around 2 h;the recommended oral dosage of doxycycline hydrochloride was a dose of 20 mg/kg that could achieve good bactericidal effect with a withdraw time of 25 d.To prevent the induction of drug-resistant AH10,an oral dosage of 80 mg/kg was recommended for disease control,which was accompanied with a withdraw time of 60 d.

Key words：doxycycline hydrochloride;Carassius auratus gibelio;Aeromonas hydrophilo;pharmacodynamics;pharmacokinetic

中圖分類號：S943.117.42

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)02-0045-05

作者簡介：第一邴曉菲(1990-)，女，碩士研究生，水產(chǎn)動物代謝組學。E-mail：sdqdbxf@163.com通訊作者：呂利群。E-mail：lqlv@shou.edu.cn

收稿日期：2015-05-07；

修訂日期：2015-09-02

資助項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-46-12)