組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589對(duì)多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的抑制作用

張　靈　白曉敏　范　凌　張亞芳　吉慧姝

075000 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張　靈，白曉敏，范　凌，吉慧姝)；075000 河北省張家口市建國(guó)醫(yī)院(張亞芳)

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組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589對(duì)多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的抑制作用

張靈白曉敏范凌張亞芳吉慧姝

075000 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張靈，白曉敏，范凌，吉慧姝)；075000 河北省張家口市建國(guó)醫(yī)院(張亞芳)

【摘要】目的探討單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松對(duì)多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的作用。方法采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法，檢測(cè)LBH589(15、25、50) nmol/L及50 nmol/L分別聯(lián)合硼替佐米(15、25) nmol/L及地塞米松 (5、10)μmol/L對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞作用24，48 h后的細(xì)胞增殖影響；采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定LBH589對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響；用Westernblot測(cè)定LBH589(15、25、50 nmol/L)對(duì)復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞作用24 h后組蛋白H4乙?；淖兓潭?。結(jié)果單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松均能夠使復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖受到抑制，且與藥物劑量和時(shí)間變化呈正比例。藥物作用于MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞48 h后，G0/G1期細(xì)胞逐漸增加，G2/M期及S期細(xì)胞則逐漸降低，細(xì)胞在G0/G1期發(fā)生阻滯，可觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且凋亡程度與藥物劑量變化呈正比例，三藥聯(lián)合作用均較單藥作用更加顯著(P均<0.01)；Westernblot測(cè)定顯示，不同濃度LBH589對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞作用24 h后組蛋白H4乙酰化的程度上調(diào)，且與藥物劑量變化呈正比例。結(jié)論LBH589能夠使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖受到抑制，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且三藥聯(lián)合對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞有加強(qiáng)抗瘤細(xì)胞作用。

【關(guān)鍵詞】LBH589；MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞；組蛋白乙?；?/p>

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:407～410)

多發(fā)性骨髓瘤(multipie myeloma，MM)是發(fā)生在漿細(xì)胞的惡性腫瘤，骨髓瘤細(xì)胞異質(zhì)性強(qiáng)，容易發(fā)生耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致復(fù)發(fā)、難治率上升，至今尚無(wú)法完全治愈[1]。因此需要進(jìn)一步研發(fā)新的藥物來(lái)降低復(fù)發(fā)和難治率。組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以使組蛋白去乙?；傅幕钚允艿揭种?，促進(jìn)靶細(xì)胞中組蛋白恢復(fù)乙酰化，從而啟動(dòng)某些特異性基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2-5]。已有研究證實(shí)，LBH589是1類(lèi)新型的異羥肟酸類(lèi)組蛋白去乙?；敢种苿隗w外作用于MM細(xì)胞后可促進(jìn)組蛋白乙?；?，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且對(duì)地塞米松耐藥的MM1R細(xì)胞有明顯的抑制作用[6-8]，但其對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞有無(wú)影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探索LBH589對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的作用，同時(shí)也探討其與硼替佐米及地塞米松聯(lián)合在體外抗MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的加強(qiáng)作用。

1材料與方法

1.1試劑與材料

LBH589為美國(guó)Biovision公司原裝進(jìn)口試劑，硼替佐米購(gòu)于西安楊森公司，地塞米松注射液為上海通用藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，β-actin抗體、組蛋白H4(histone H4)抗體均為美國(guó)Cell Signaling公司產(chǎn)品，2PMI1640培養(yǎng)液購(gòu)于博士德公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，碘化丙啶(PI)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，人淋巴細(xì)胞分離液為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，MTT為3igma公司產(chǎn)品。

1.2標(biāo)本來(lái)源

按Durie-Solmon分期系統(tǒng)，從河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科選出12例不同類(lèi)型的MM復(fù)發(fā)、難治患者，其中男性4例，女性8例，中位年齡53.4歲；，其中ⅡA期患者3例，ⅡB期患者2例，ⅢA期患者3例，ⅢB患者4例。所有病例均符合中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2013年修訂)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3方法

1.3.1MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離和培養(yǎng)無(wú)菌條件下行骨髓穿刺術(shù)在髂后上嵴抽取骨髓液15～20 mL，肝素抗凝。加入一定量的PBS后1 500 r/min 離心約10 min，把骨髓中的脂肪組織消除，再放入等量的D-Hanks液混勻。將淋巴細(xì)胞分離液放入另一無(wú)菌離心管，再緩慢加入骨髓液，骨髓液與淋巴細(xì)胞分離液的體積比為1∶2。以2 000 r/min 離心10 min，將中間的白細(xì)胞層用毛細(xì)吸管吸取后加入另一試管中，用PBS洗滌3遍。將以上分離出的骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2～3天換液并傳代1次，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用來(lái)測(cè)定。

1.3.2藥物處理MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]中濃度和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將濃度分別為0、15、25、50 nmol/L LBH589，濃度分別為15、25 nmol/L硼替佐米，注射液濃度為5、10 μmol/L，地塞米松，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞24或48 h后收集細(xì)胞并進(jìn)行洗滌，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，將不同濃度藥物加入接種了以細(xì)胞密度1×105/ml的96孔培養(yǎng)板，用無(wú)血清的RPMI 1640補(bǔ)足未加藥物濃度組，設(shè)置每孔總體系0.2 ml，分別作用24 h、48 h，再加入MTT工作液20 μl/孔(終濃度0.5 mg/ml)，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h，1 000 r/min離心，后吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 200 μl，振蕩10 min，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A)。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A對(duì)照組-A未加藥物濃度組)×100%

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，將不同濃度的藥物加入接種于細(xì)胞密度為1×106/mL的24孔板，同時(shí)設(shè)未加藥物濃度組，48 h后收集各組細(xì)胞，離心并去掉上清液，用4 ℃預(yù)冷的PB3洗滌2次，1 000 r/min，4 ℃離心7 min，去上清液。將細(xì)胞重懸于1×緩沖液，將5 μl PI加入100 μl細(xì)胞，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，再加入300 μl×緩沖液，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5Westernblot檢測(cè)組蛋白H4乙?；潭仁占瘜?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，將不同濃度的LBH589加入接種于細(xì)胞密度為1×107/ml的24孔板，同時(shí)設(shè)未加藥物濃度組，24 h后收集各組細(xì)胞，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理(160 W，持續(xù)3 s，間隔5 s，共3次)，4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清液，Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度后-70 ℃凍存?zhèn)溆?。等量蛋白?00 g/LSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移后將PVDF膜放入密閉盒中，加入一抗，4 ℃過(guò)夜。用1×TBST洗膜3～4次，每次5 min。PVDF膜置于二抗中，雜交爐中室溫溫育1 h。用1×TBST洗膜3次，每次5 min，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，參照化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖作用的影響

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖表明，單用LBH589及三藥聯(lián)合均可以使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的增殖受到抑制，呈時(shí)間和濃度依賴性，且有明顯差異(P均<0.01)，逐漸延長(zhǎng)時(shí)間及增加濃度劑量，抑制效果更加明顯，三藥聯(lián)合抑制效果均較單藥抑制效果明顯(P<0.01)(表1)。

表1　單用LBH589或三藥聯(lián)合對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者

注：與未加藥物組比較，*為P<0.05。

2.2LBH589促進(jìn)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞組蛋白乙酰化

LBH589(0、15、25、50 nmol/L)作用于MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞24 h，隨著藥物劑量的增加，組蛋白H4乙?；潭戎饾u上調(diào)；且呈濃度依賴性(P<0.01)(表2，圖1)。

表2　LBH589作用MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞

注：與未加藥物組比較，*為P<0.05。

1為未加藥物組；2為15 nnomL/L LBH589處理組；3為25 nnomL/L LBH589處理組；4為50 nnomL/L LBH589處理組。

圖1Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞周期及凋亡的影響

不同濃度LBH589作用MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞48 h，與未加藥物組相比，隨著藥物劑量的不斷升高，G0/G1期細(xì)胞逐漸增加，而G2/M期及S期細(xì)胞則逐漸降低，細(xì)胞在G0/G1期發(fā)生阻滯。作用48 h后，未加藥物組細(xì)胞未見(jiàn)顯著凋亡，而藥物處理組的細(xì)胞凋亡率越來(lái)越高，呈濃度依賴性，三藥聯(lián)合作用處理48 h較單藥組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P值均<0.05)(表3)。

3討論

研究表明，LBH589 是1種新型的HDAC抑制劑，體外試驗(yàn)已證實(shí)它對(duì)卵巢癌、淋巴瘤等實(shí)體瘤，以及多發(fā)性骨髓瘤耐藥細(xì)胞均有抑制增殖、誘導(dǎo)再分化和促進(jìn)凋亡作用，且具有效果強(qiáng)、毒性低的特性，與一些藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠加強(qiáng)抗瘤細(xì)胞效應(yīng)[9-13]。

結(jié)果表明單用LBH589及三藥聯(lián)合均可以使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的增殖受到抑制，且逐漸延長(zhǎng)時(shí)間及增加濃度劑量，抑制效果更加明顯，三藥聯(lián)合抑制效果均較單藥抑制效果明顯，且50 nmol/L LBH589+25 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L地塞米松組抑制效果最強(qiáng)，這明顯表明LBH589與其它兩藥聯(lián)合具有共同抗瘤細(xì)胞效應(yīng)。

另外，單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松均能夠使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞在G0/G1期發(fā)生阻滯，且隨著藥物劑量的增大，該期細(xì)胞逐漸增加，S期細(xì)胞則逐漸降低，且伴隨藥物劑量的不斷增加，阻滯作用越來(lái)越強(qiáng)，呈藥物濃度依賴性變化，由此表明細(xì)胞凋亡可能發(fā)生在G1期。作用48 h后MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞發(fā)生了凋亡現(xiàn)象，且凋亡率隨著藥物劑量的增加逐漸升高，也呈藥物濃度依賴性，表明LBH589具有使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

表3　單用LBH589或三藥聯(lián)合對(duì)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期分布及凋亡率±s，%)

注：與未加藥物比較，*為P<0.05。

Western blot實(shí)驗(yàn)表明，使用不同濃度LBH589作用MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞24 h后，組蛋白H4乙?；潭入S著藥物劑量的增大越來(lái)越明顯，表明LBH589能夠促進(jìn)MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中組蛋白高度乙?；?，從而克服腫瘤，使機(jī)體恢復(fù)正常。

綜上所述，LBH589通過(guò)提高組蛋白乙酰化程度來(lái)抑制MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而克服腫瘤。LBH589有望成為治療MM的一類(lèi)開(kāi)創(chuàng)性的新型藥物，會(huì)成為一種重要的MM治療選擇。

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(編輯：吳小紅)

The Inhibitive Effect of Histone Deacetylase Inhibitors LBH589 On Bone Marrow Mononuclear Cells of Patients with Relapsed or Refractory Multiple Myeloma

ZHANGLing，BAIXiaomin，F(xiàn)ANLing，etal.

FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou,075000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of LBH589 alone or combined with bortezomib and dexamethasone on bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma.MethodsMethyl thiazolyl tetrazolium(MTT)was used to detect the effect of LBH589(15，25，50) nmol/L and 50nmol/L respectively combined with bortezomib(15，25) nmol/L and dexamethasone(5，10)mol/L on cell proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma 24 h and 48 h later；flow cytometry was used to detect the effect of LBH589 on cell cycle and apoptosis of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma；Westernblot was used to detect the effect of LBH589(15，25，50 nmol/L)on the changes of degree of histone H4 acetylation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma 24 h later.ResultsLBH589 alone or combined with bortezomib and dexamethasone were able to inhibit proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，and its relationship with drug dose and time was direct ratio.48 h after bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma treated with drugs，G0/G1 phase cells gradually increased，G2/M phase and S phase cells gradually decreased，G0/G1 phase occurred cell block，cell apoptosis was observed，and apoptosis degree was positively proportional with drug dose，combined effect of the 3 drugs was more significant than any single drug(P all<0.01)；Westernblot showed that degree of histone H4 acetylation increased 24 h after different concentrations of LBH589 on bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，and it was positively proportional with drug dose.ConclusionLBH589 can inhibit proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，arrest cell cycle，promote apoptosis，and the combination of 3 drugs can strengthen the anti-tumor effects of cells.

【Key words】LBH589；Bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma；Histone acetylation

(收稿日期2015-05-21修回日期 2015-12-01)

中圖分類(lèi)號(hào)：R739.42

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)03-0407-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.018