• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    B7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義

    2016-04-21 08:10:50尹鳳玲卓世超
    實(shí)用癌癥雜志 2016年3期
    關(guān)鍵詞:卵巢癌

    徐 梅 張 夢(mèng) 劉 洋 張 蓓 尹鳳玲 劉 霞 卓世超

    221009 江蘇省徐州市中心醫(yī)院

    ?

    B7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義

    徐梅張夢(mèng)劉洋張蓓尹鳳玲劉霞卓世超

    221009 江蘇省徐州市中心醫(yī)院

    【摘要】目的探討B(tài)7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義。方法將收治的112例上皮性卵巢癌及10例良性卵巢囊腫的組織蠟塊制作成組織芯片,免疫組化檢測(cè)芯片協(xié)同刺激分子B7-H1的表達(dá)情況,χ2檢驗(yàn)B7-H1表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)及多因素 COX回歸。結(jié)果B7-H1在良性卵巢囊腫中均為低表達(dá),在卵巢癌組織中高表達(dá)率為55.4%(62/112);其表達(dá)水平與患者年齡、組織類型、細(xì)胞分化、腫瘤大小及是否合并CA125升高無(wú)關(guān)(P>0.05),而與患者FIGO分期及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05);B7-H1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)和總生存期(overall survival,OS)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為24.9和17.51,P值均<0.001)。COX回歸分析表明,B7-H1表達(dá)水平和FIGO分期是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論卵巢癌組織中B7-H1的表達(dá)水平與預(yù)后差和生存期短相關(guān),可為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

    【關(guān)鍵詞】卵巢癌;協(xié)同刺激分子;B7-H1

    (ThePracticalJournalofCancer,2016,31:380~383)

    隨著腫瘤免疫學(xué)及現(xiàn)代生物科技的發(fā)展,腫瘤免疫治療已經(jīng)取得突破性的進(jìn)展。B7家族是T細(xì)胞活化的重要協(xié)同刺激分子,B7-H1也稱PD-L1(programmed death-1-ligand 1),是該家族的第三個(gè)成員,該分子在誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫逃逸過(guò)程中具有重要作用[1]。而B7-H1在卵巢癌中的作用目前研究尚少,值得探討。我們收集與卵巢癌相關(guān)的臨床資料,擬合多因素COX模型分析B7-H1分子表達(dá)對(duì)卵巢癌患者復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)的影響,從而探討B(tài)7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義,為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

    1材料與方法

    1.1試劑

    B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體,USCNLIFE,USA,鼠/兔通用型二抗,購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

    1.2病例資料

    112例石蠟包埋組織標(biāo)本取自2005年2月至2009年12月間在我院住院手術(shù)治療的卵巢癌患者。年齡21~78歲,平均(55.1±12.5)歲;其中漿液性囊腺癌93例、粘液性囊腺癌12例、子宮內(nèi)膜樣腺癌3例、透明細(xì)胞癌4例;腫瘤大小1~4 000 cm3,平均(171.9±423.2)cm3;FIGO分期Ⅰ期26例、Ⅱ期7例、Ⅲ期72例、Ⅳ期7例;細(xì)胞分化Ⅰ級(jí)9例、Ⅱ級(jí)20例、Ⅲ級(jí)78例、交界性腫瘤5例;腫瘤位于雙側(cè)者65例,右側(cè)24例、左側(cè)23例;82例患者血CA125水平升高;腫瘤轉(zhuǎn)移85例。所有患者術(shù)前未接受化療或放療。手術(shù)標(biāo)本取材時(shí),癌組織均取自腫瘤原發(fā)灶。另取同期10例因良性卵巢囊腫手術(shù)切除的標(biāo)本做正常對(duì)照。

    所有患者均同時(shí)滿足下列條件:術(shù)后生存期≥3個(gè)月,死亡原因是卵巢癌而非其他疾病。通過(guò)查閱住院病例、電話或登門隨訪等方式對(duì)所有患者追蹤隨訪至2014年12月。

    1.3免疫組織化學(xué)染色

    由上海芯超公司將采集的所有蠟塊制作成組織芯片,然后進(jìn)行Elivision TM 免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后,將切片浸在檸檬酸鹽緩沖液中水浴加熱至100 ℃,持續(xù)30 min,進(jìn)行抗原修復(fù)。然后將切片冷卻浸在3%H2O2中30 min。然后用PBS浸洗3次。再加一抗B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體,1∶400稀釋,4 ℃過(guò)夜,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。將切片在PBS中浸洗3次,然后加二抗,室溫放置30 min,用PBS洗去二抗,經(jīng)DAB顯色,蘇木精復(fù)染,0.1%鹽酸酒精分化。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥后用中性樹脂封片。

    1.4免疫組化結(jié)果判讀

    應(yīng)用Immunohistochemical Scores(IHS)法對(duì)免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行評(píng)估。在200倍高倍鏡下,隨機(jī)選擇5個(gè)腫瘤區(qū)域,計(jì)數(shù)胞質(zhì)/胞膜內(nèi)有陽(yáng)性染色的腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù),根據(jù)其所占比例計(jì)分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分,陽(yáng)性細(xì)胞占1%~10%為1分,11%~50%為2分,51%~80%為分,81%~100%為4分;同時(shí)評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞染色的強(qiáng)弱:陰性計(jì)0分,弱陽(yáng)性計(jì)1分,中度陽(yáng)性計(jì)2分,強(qiáng)陽(yáng)性計(jì)3分。兩項(xiàng)得分的乘積即為該例病變的免疫組化評(píng)分:0為-,1~4分為+,5~8分為++,9~12分為+++。評(píng)分<4分為低表達(dá),≥4分為高表達(dá)。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,B7-H1高表達(dá)組及低表達(dá)組間比較采用χ2檢驗(yàn),生存分析采用Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)及Kaplan-Meier生存曲線法,對(duì)B7-H1表達(dá)、細(xì)胞分化程度、轉(zhuǎn)移與否及FIGO分期及年齡多因素分析采用COX模型分析。

    2結(jié)果

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:B7-H1分子在10例正常卵巢囊腫中均呈低表達(dá),在112例卵巢癌組織中高表達(dá)率為55.4%(62/112)。 且表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中,呈棕黃色至棕褐色顆粒或團(tuán)塊。

    B7-H1表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)類型、組織分化程度、FIGO臨床分期、腫瘤大小、CA125水平及轉(zhuǎn)移與否的關(guān)系見表1。

    表1 卵巢癌組織中B7-H1表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

    Kaplan-Meier 法檢測(cè)B7-H1表達(dá)水平不同患者的PFS及OS曲線見圖1和圖2?;颊逷FS的計(jì)算起點(diǎn)為手術(shù)當(dāng)日,終點(diǎn)為患者確診為腫瘤復(fù)發(fā)或病情惡化時(shí)。OS的計(jì)算起點(diǎn)為手術(shù)當(dāng)日,終點(diǎn)為患者死亡日期或截止日期。隨訪截止日期為2014年12月31日。112例卵巢癌患者隨訪5年中,B7-H1低表達(dá)者復(fù)發(fā)率為46.0%(23/50)、死亡率為34.0%(17/50);而高表達(dá)者復(fù)發(fā)率為82.3%(51/62)、死亡率為66.1%(41/62);B7-H1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者PFS[(1059.1±151.8)天 vs(2358.8±180.2)天]和OS[(1675.8±169.2)天vs(2654.1±149.4)天]比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為24.9和17.51,P值均<0.001)。

    COX回歸多因素分析結(jié)果: B7-H1表達(dá)情況(B=0.98,RR=2.66,P=0.002)和FIGO分期(B=0.78,RR=2.17,P=0.03)是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。

    圖1 B7-H1不同表達(dá)水平患者的PFS曲線圖

    圖2 B7-H1不同表達(dá)水平患者的OS曲線圖

    3討論

    B7-H1也稱pD-L1(programmed death ligand-1),是1999年發(fā)現(xiàn)的B7家族成員,B7-H1基因定位于人9p24.2[2],編碼產(chǎn)物為一個(gè)含290個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白,B7-H1的受體為PD-1(CD279),PD-1最初是通過(guò)削減雜交技術(shù),從小鼠凋亡期的雜交瘤及造血祖細(xì)胞系克隆得到的。由于其和細(xì)胞凋亡相關(guān)故被命名為程序性死亡-1(programmed death-1,PD-1)。人類PD-1基因編碼含288個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白,其細(xì)胞外區(qū)為免疫球蛋白樣IgV區(qū),細(xì)胞質(zhì)區(qū)含有2個(gè)酪氨酸基序,N端有1個(gè)免疫受體酪氨酸依賴抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM),C端有1個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine switch motif,ITSM),這兩個(gè)酪氨酸殘基磷酸化后可分別與酪氨酸磷酸酶 SHP-1 和 SHP-2結(jié)合,下調(diào) TCR 和 BCR 下游激活信號(hào)的磷酸化,轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號(hào),發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的作用[2-4]。這種表達(dá)特點(diǎn)可能與保護(hù)組織免受不必要的炎性反應(yīng)或免疫反應(yīng)有關(guān)。近些年的研究發(fā)現(xiàn),在許多人類腫瘤組織(如胃癌[5-6]、食管癌[7]、胰腺癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]、膀胱癌[11]、腎細(xì)胞癌[12]、淋巴瘤[13]、乳腺癌[14]和白血病[15]等)中均可檢測(cè)到 B7-H1 蛋白的異常表達(dá)。

    B7-H1在腫瘤組織中的表達(dá)水平和患者的臨床病理因素及預(yù)后存在顯著相關(guān)性。Ohigashi等[7]對(duì)食管癌患者腫瘤細(xì)胞B7-H1的表達(dá)水平與愈后相關(guān)性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)術(shù)前癌細(xì)胞B7-H1陽(yáng)性患者明顯比B7-H1陰性患者愈后差,1年生存率明顯降低,且癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。Wu等[5]對(duì)102例胃癌組織中B7-H1的表達(dá)情況和臨床病理學(xué)及預(yù)后相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),B7-H1在正常胃組織中沒(méi)有表達(dá),在胃腺瘤中微弱表達(dá),但在42.2%胃癌組織中強(qiáng)表達(dá)。而且,其表達(dá)程度和腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的生存期相關(guān)。多因素分析顯示,B7-H1表達(dá)情況是評(píng)價(jià)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。本研究檢測(cè)B7-H1在112例卵巢癌組織中的表達(dá)情況,并對(duì)患者進(jìn)行5到10年的隨訪,結(jié)果顯示B7-H1陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿或(和)胞膜,在10例良性卵巢囊腫中B7-H1均為低表達(dá),在卵巢癌中的B7-H1高表達(dá)率為55.4%,略高于于曉偉等[16]的研究結(jié)果。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn),B7-H1的表達(dá)水平和細(xì)胞分化、腫瘤大小、是否合并CA125升高及患者年齡無(wú)明顯相關(guān)性,而和患者FIGO分期及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?;颊吲R床分期越晚或是并發(fā)轉(zhuǎn)移者,其B7-H1表達(dá)水平越高。這和Wang等[11]采用mate分析研究B7-H1在膀胱癌中表達(dá)水平得出的結(jié)論類似。Hamanishi等[10]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中B7-H1的表達(dá)水平和腫瘤組織中CD8+T的數(shù)量負(fù)相關(guān),且多因素分析顯示,它們是患者的獨(dú)立預(yù)后因素。我們的研究顯示,B7-H1低表達(dá)者比高表達(dá)者有更長(zhǎng)的PFS和OS,高表達(dá)相對(duì)低表達(dá)有更高的復(fù)發(fā)率(82% vs 46%)和死亡率(66.1% vs 34%)。說(shuō)明卵巢癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1與預(yù)后差和生存短有關(guān)。而COX回歸分析亦顯示,B7-H1表達(dá)水平和FIGO分期是EOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

    Sun等[6]成功構(gòu)建兩種鼠抗人PD-L1單克隆抗體10E10 和2H11,它們可以抑制腫瘤相關(guān)PD-L1誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡,通過(guò)共刺激分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和免疫干預(yù)途徑進(jìn)行腫瘤免疫治療具有重要價(jià)值。DC表達(dá)B7-H1本身即可限制DC處于未成熟狀態(tài),與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及腫瘤進(jìn)展相關(guān)[9],通過(guò)沉默DC細(xì)胞B7-H1的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤免疫的實(shí)驗(yàn)研究也獲得了肯定的結(jié)果[17],這充分說(shuō)明B7-H1可作為激活機(jī)體抗腫瘤免疫治療的很好靶點(diǎn)。目前,該療法已被應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)治療并取得一定的成效[18]。因此,通過(guò)分子生物學(xué)手段檢測(cè)和控制卵巢癌細(xì)胞表面B7-H1分子的表達(dá),對(duì)于卵巢癌的治療和預(yù)防具有重要意義。

    參考文獻(xiàn)

    [1]Topalian SL,Drake CG,Pardoll DM.Targeting the PD-1/B7-H1(PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity〔J〕.Curr Opin Immunol,2012,24(2):207-212.

    [2]Dong H,Zhu G,Tamada K,et al.B7-H1,a third member of the B7 family,co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion〔J〕.Nat Med,1999,5(12):1365-1369.

    [3]Okazaki T,Maeda A,Nishimura H,et al.PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(24):13866-13871.

    [4]Dong H,Chen X.Immunoregulatory role of B7-H1 in chronicity of inflammatory responses〔J〕.Cell Mol Immunol,2006,3(3):179-187.

    [5]Wu C,Zhu Y,Jiang J,et al.Immunohistochemical localization of programmed death-1 ligand-1(PD-L1) in gastric carcinoma and its clinical significance〔J〕.Acta Histochem,2006,108(1):19-24.

    [6]Sun J,Xu K,Wu C,et al.PD-L1 expression analysis in gastric carcinoma tissue and blocking of tumor-associated PD-L1 signaling by two functional monoclonal antibodies〔J〕.Tissue Antigens,2007,69(1):19-27.

    [7]Ohigashi Y,Sho M,Yamada Y,et al.Clinical significance of programmed death-1 ligand-1 and programmed death-1 ligand-2 expression in human esophageal cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2005,11(8):2947-2953.

    [8]Song X,Liu J,Lu Y,et al.Overexpression of B7-H1 correlates with malignant cell proliferation in pancreatic cancer〔J〕.Oncol Rep,2014,31(3):1191-1198.

    [9]Mu CY,Huang JA,Chen Y,et al.High expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis and tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic cells maturation〔J〕.Med Oncol,2011,28(3):682-688.

    [10]Hamanishi J,Mandai M,Iwasaki M,et al.Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(9):3360-3365.

    [11]Wang YU,Liu AN,Zhao SH.Association between B7-H1 expression and bladder cancer: a meta-analysis〔J〕.Genet Mol Res,2015,14(1):1277-1286.

    [12]Thompson RH,Kuntz SM,Leibovich BC,et al.Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up〔J〕.Cancer Res,2006,66(7):3381-3385.

    [13]Li Y,Wang J,Li C,et al.Contribution of PD-L1 to oncogenesis of lymphoma and its RNAi-based targeting therapy〔J〕.Leuk Lymphoma,2012,53(10):2015-2023.

    [14]Ghebeh H,Mohammed S,Al-Omair A,et al.The B7-H1(P

    D-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma: correlation with important high-risk prognostic factors〔J〕.Neoplasia,2006,8(3):190-198.

    [15]Li X,Sun WJ,Xu Y,et al.Expression of b7-h1 gene in leukemia cells and its clinical significance〔J〕.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2012,20(3):541-544.

    [16]于曉偉,李春紅,張松靈.卵巢癌患者PD-L1的表達(dá)研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(11):1854-1856.

    [17]Wang S,Wang Y,Liu J,et al.Silencing B7-H1 enhances the anti-tumor effect of bladder cancer antigen-loaded dendritic cell vaccine in vitro〔J〕.Onco Targets Ther,2014,7:1389-1396.

    [18]Gettinger S,Herbst RS.B7-H1/PD-1 blockade therapy in non-small cell lung cancer: current status and future direction〔J〕.Cancer J,2014,20(4):281-289.

    (編輯:吳小紅)

    Expression and Clinical Significance of B7-H1 in Ovarian Cancer

    XUMei,ZHANGMeng,LIUYang,etal.

    CentralHospitalofXuzhou,Xuzhou,221009

    【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of B7-H1 in ovarian cancer.Methods112 biopsies from patients with epithelial ovarian cancer(EOC) and 10 specimens from ovarian benign neoplasm were processed into tissue chips.The expression of B7-H1 were detected by immunohistochemical method and its relationship with patients' clinical parameter were tested by Pearson Chi-Square.Survival curves were constructed using the Kaplan-Meier method and the log-rank test.The independent prognostic factors were evaluated by using the Cox regression model.ResultsThe B7-H1 high expression rates were 0 in benign ovarian neoplasm tissues and 55.4%(62/112) in EOC tissues.The level of B7-H1 expression was positively correlated with clinical stage and distant metastases(P<0.05).No relationship was observed between the expression of B7-H1 and age,primary tumor size,primary tumor classification,histological grade and the level of blood CA125(P>0.05).The progression-free survival(PFS) and the overall survival(OS) were significantly lower in patients with B7-H1 high expression than in those with B7-H1 low expression.Multi-variable analysis revealed that the expression of B7-H1 and the clinical stage could be regarded as the independent factor in evaluating the prognosis of EOC patients.ConclusionThe level of B7-H1 expression in EOC tissues is significantly correlated with the poor prognosis and relapse rate.B7-H1 might be a beneficial target for immunotherapy in EOC patients.

    【Key words】Ovarian neoplasrn;Co-stimulator;B7-H1

    (收稿日期2015-04-30修回日期 2015-10-28)

    中圖分類號(hào):R737.31

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1001-5930(2016)03-0380-04

    DOI:10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.010

    通訊作者:徐梅

    基金項(xiàng)目:徐州市醫(yī)學(xué)科研資助項(xiàng)目(編號(hào):XWJ2011038),徐州市中心醫(yī)院博士創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)科研資助(編號(hào):XZB201205)

    猜你喜歡
    卵巢癌
    miR-181a在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)順鉑的耐藥作用
    卵巢癌:被遺忘的女性“沉默殺手”
    女性謹(jǐn)防“沉默殺手”——卵巢癌的偷襲
    Wnt3 a和TCF4在人卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義
    Ikaros的3種亞型對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響
    楊梅素對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用
    CXXC指蛋白5在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義
    卵巢癌脾轉(zhuǎn)移的臨床研究進(jìn)展
    卵巢癌、輸卵管癌和腹膜癌FIGO2013分期和臨床意義的解讀
    microRNA與卵巢癌轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展
    又黄又爽又免费观看的视频| 久久九九热精品免费| 午夜福利欧美成人| 日韩精品中文字幕看吧| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 嫩草影院新地址| 国产精品免费一区二区三区在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久伊人香网站| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 中文资源天堂在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 免费观看的影片在线观看| 国产av不卡久久| ponron亚洲| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产美女午夜福利| 性色av乱码一区二区三区2| 一进一出好大好爽视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 免费看光身美女| av在线老鸭窝| 中出人妻视频一区二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产av不卡久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 1000部很黄的大片| 国产探花极品一区二区| av在线老鸭窝| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精华国产精华精| 欧美精品国产亚洲| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲在线自拍视频| 中国美女看黄片| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产成人a区在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 最后的刺客免费高清国语| 日日干狠狠操夜夜爽| 88av欧美| 最新中文字幕久久久久| 午夜免费成人在线视频| 99视频精品全部免费 在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产精品三级大全| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99久久久亚洲精品蜜臀av| av天堂中文字幕网| 成年女人毛片免费观看观看9| 十八禁人妻一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩国内少妇激情av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产日本99.免费观看| 99riav亚洲国产免费| 成人特级av手机在线观看| 草草在线视频免费看| 我的老师免费观看完整版| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 麻豆av噜噜一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 深夜精品福利| 波多野结衣高清无吗| 欧美区成人在线视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 男人的好看免费观看在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲综合色惰| 免费搜索国产男女视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 一级av片app| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜精品在线福利| 精品久久久久久久末码| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲无线在线观看| 精品一区二区免费观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产美女午夜福利| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费观看人在逋| 丰满乱子伦码专区| 俄罗斯特黄特色一大片| 嫩草影院新地址| 夜夜爽天天搞| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美成人性av电影在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| av在线蜜桃| 欧美区成人在线视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成年女人看的毛片在线观看| 免费av不卡在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产探花极品一区二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲中文字幕日韩| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲电影在线观看av| 精品人妻偷拍中文字幕| 不卡一级毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲经典国产精华液单 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久精品91蜜桃| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲色图av天堂| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲色图av天堂| 久久国产精品影院| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 观看免费一级毛片| 人妻久久中文字幕网| 麻豆av噜噜一区二区三区| 1024手机看黄色片| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精华国产精华精| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美成人a在线观看| 97热精品久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 90打野战视频偷拍视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 黄片小视频在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 国产免费av片在线观看野外av| 草草在线视频免费看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品人妻1区二区| 久久国产乱子免费精品| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久这里只有精品中国| 日本精品一区二区三区蜜桃| 色综合站精品国产| 免费观看人在逋| 日韩av在线大香蕉| 在线观看午夜福利视频| 亚洲av免费高清在线观看| 51国产日韩欧美| 欧美黄色淫秽网站| 精品久久久久久成人av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 一本综合久久免费| 精品人妻1区二区| 精品国产亚洲在线| 亚洲电影在线观看av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩欧美精品v在线| 亚洲美女视频黄频| 亚洲av.av天堂| 亚洲,欧美精品.| 午夜精品在线福利| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产精品女同一区二区软件 | 久久久久久久久大av| 久久99热这里只有精品18| 精品午夜福利在线看| 变态另类丝袜制服| 亚洲av电影在线进入| 嫩草影院精品99| 亚洲av一区综合| 观看美女的网站| 丰满的人妻完整版| www日本黄色视频网| 国产午夜福利久久久久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一二三四社区在线视频社区8| 一二三四社区在线视频社区8| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久精品影院6| 亚洲无线在线观看| 欧美激情在线99| 老鸭窝网址在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 99热6这里只有精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 可以在线观看毛片的网站| 国产午夜精品论理片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 全区人妻精品视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜福利在线在线| 色在线成人网| 热99在线观看视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品久久久久久久久av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日韩av在线大香蕉| 国产成人影院久久av| 国产美女午夜福利| 欧美黄色淫秽网站| 91麻豆av在线| 亚洲成av人片免费观看| 欧美精品国产亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 露出奶头的视频| 亚洲av电影在线进入| 观看美女的网站| 一区二区三区四区激情视频 | 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品影院久久| 精品久久久久久,| 日本 av在线| 久久中文看片网| 久久人人爽人人爽人人片va | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 在线观看午夜福利视频| 午夜激情福利司机影院| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲久久久久久中文字幕| 99热这里只有是精品50| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av五月六月丁香网| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲综合色惰| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 最近中文字幕高清免费大全6 | 神马国产精品三级电影在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲av.av天堂| 90打野战视频偷拍视频| 日本 欧美在线| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲av不卡在线观看| 色5月婷婷丁香| 欧美一区二区精品小视频在线| 波多野结衣高清作品| 91在线精品国自产拍蜜月| 99在线视频只有这里精品首页| 精品日产1卡2卡| 国产精品电影一区二区三区| 婷婷亚洲欧美| 成人av一区二区三区在线看| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 听说在线观看完整版免费高清| 十八禁人妻一区二区| 国产精品伦人一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av五月六月丁香网| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 美女免费视频网站| 国产精品一及| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美日韩福利视频一区二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产av在哪里看| 十八禁网站免费在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 最新在线观看一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99久久九九国产精品国产免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美激情在线99| 亚洲人成伊人成综合网2020| 中文在线观看免费www的网站| 看黄色毛片网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产三级在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 免费无遮挡裸体视频| 免费av毛片视频| 在线观看午夜福利视频| 久久伊人香网站| 国产毛片a区久久久久| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美性感艳星| 国产亚洲欧美98| 精品久久久久久久久久久久久| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久久久久大精品| 成人无遮挡网站| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲av美国av| 嫩草影院新地址| bbb黄色大片| 黄色丝袜av网址大全| 91狼人影院| 在线观看av片永久免费下载| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 极品教师在线免费播放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲无线观看免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲欧美日韩卡通动漫| aaaaa片日本免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 小说图片视频综合网站| 亚洲自拍偷在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 十八禁人妻一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲av成人精品一区久久| 婷婷亚洲欧美| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费搜索国产男女视频| 桃色一区二区三区在线观看| 99热这里只有是精品50| 精品福利观看| 午夜福利18| 露出奶头的视频| 成年人黄色毛片网站| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品乱码一区二三区的特点| 我的老师免费观看完整版| 亚洲,欧美精品.| 国产高清有码在线观看视频| 热99re8久久精品国产| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美最新免费一区二区三区 | 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲熟妇熟女久久| 国产亚洲精品久久久com| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产熟女xx| 日韩精品青青久久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 最近在线观看免费完整版| 国产av一区在线观看免费| 婷婷亚洲欧美| 美女免费视频网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 黄色一级大片看看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 日本 欧美在线| 精品日产1卡2卡| 亚洲欧美日韩东京热| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产av不卡久久| 国产美女午夜福利| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲黑人精品在线| 老司机福利观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人午夜高清在线视频| 久久99热6这里只有精品| 亚洲,欧美,日韩| 成人三级黄色视频| 国产精品女同一区二区软件 | 男女视频在线观看网站免费| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 无遮挡黄片免费观看| 我要看日韩黄色一级片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜免费成人在线视频| 国产精品女同一区二区软件 | 在现免费观看毛片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| av在线蜜桃| 久久精品综合一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 91九色精品人成在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 51午夜福利影视在线观看| 中出人妻视频一区二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产一区二区在线观看日韩| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲第一电影网av| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品影院6| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲自拍偷在线| 免费观看人在逋| 在线播放国产精品三级| 一区二区三区激情视频| 精品午夜福利在线看| 久久久色成人| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲av电影不卡..在线观看| 中文资源天堂在线| 国产一区二区在线观看日韩| 在线观看午夜福利视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲av美国av| 成人性生交大片免费视频hd| 9191精品国产免费久久| 色噜噜av男人的天堂激情| 性色avwww在线观看| 成人欧美大片| 国产三级在线视频| 久久亚洲真实| 亚洲av成人精品一区久久| 免费在线观看成人毛片| 国内精品久久久久精免费| 91字幕亚洲| 日本a在线网址| 天堂网av新在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲av电影在线进入| 国产精品永久免费网站| 午夜福利高清视频| 欧美成人性av电影在线观看| 怎么达到女性高潮| 国产精品影院久久| 亚洲五月天丁香| 精品国内亚洲2022精品成人| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产欧美日韩一区二区三| 桃红色精品国产亚洲av| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产av一区在线观看免费| 亚洲精品在线观看二区| 夜夜爽天天搞| 久久久精品大字幕| 亚洲美女黄片视频| 一区二区三区免费毛片| 成人精品一区二区免费| 少妇人妻一区二区三区视频| a在线观看视频网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 中文字幕熟女人妻在线| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲av二区三区四区| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 男女之事视频高清在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日韩欧美免费精品| 直男gayav资源| 国产野战对白在线观看| 欧美色视频一区免费| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国产美女午夜福利| netflix在线观看网站| 久久这里只有精品中国| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久久久中文| 欧美午夜高清在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | bbb黄色大片| 又黄又爽又免费观看的视频| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美另类亚洲清纯唯美| 大型黄色视频在线免费观看| 天天躁日日操中文字幕| 色综合婷婷激情| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久九九精品影院| 国产色婷婷99| 久久这里只有精品中国| 午夜激情欧美在线| 午夜两性在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩欧美在线乱码| 日韩欧美三级三区| 色综合欧美亚洲国产小说| 此物有八面人人有两片| 毛片女人毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久精品大字幕| 一区福利在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产极品精品免费视频能看的| 久久6这里有精品| 国产亚洲精品av在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲美女搞黄在线观看 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲精品av在线| 亚洲国产欧美人成| 国产色爽女视频免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 少妇的逼水好多| 亚洲,欧美精品.| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲电影在线观看av| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美3d第一页| 中出人妻视频一区二区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费高清视频大片| 久久久久性生活片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 午夜福利在线观看吧| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久成人免费电影| 欧美色视频一区免费| 一本综合久久免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 在现免费观看毛片| 欧美高清成人免费视频www| 婷婷色综合大香蕉| 舔av片在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久精品人妻少妇| 制服丝袜大香蕉在线| 又爽又黄a免费视频| 国产不卡一卡二| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品野战在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 日本免费a在线| 亚洲第一电影网av| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 一本精品99久久精品77| 嫩草影视91久久| 夜夜爽天天搞| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 一级av片app| 好男人电影高清在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 成人国产综合亚洲| 长腿黑丝高跟| 久久久国产成人精品二区| 成人特级黄色片久久久久久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 婷婷亚洲欧美| 亚洲av.av天堂| 国产人妻一区二区三区在| 免费在线观看日本一区| 婷婷色综合大香蕉| 无人区码免费观看不卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 一级黄色大片毛片| 亚洲黑人精品在线| 国产av麻豆久久久久久久| 精品国产三级普通话版| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 免费观看人在逋| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产成年人精品一区二区| 中文字幕免费在线视频6| 美女免费视频网站| 亚洲av免费高清在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美一区二区亚洲| 日韩欧美国产在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 一级av片app| av在线蜜桃| 久久午夜福利片|