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    B7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義

    2016-04-21 08:10:50尹鳳玲卓世超
    實(shí)用癌癥雜志 2016年3期
    關(guān)鍵詞:卵巢癌

    徐 梅 張 夢(mèng) 劉 洋 張 蓓 尹鳳玲 劉 霞 卓世超

    221009 江蘇省徐州市中心醫(yī)院

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    B7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義

    徐梅張夢(mèng)劉洋張蓓尹鳳玲劉霞卓世超

    221009 江蘇省徐州市中心醫(yī)院

    【摘要】目的探討B(tài)7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義。方法將收治的112例上皮性卵巢癌及10例良性卵巢囊腫的組織蠟塊制作成組織芯片,免疫組化檢測(cè)芯片協(xié)同刺激分子B7-H1的表達(dá)情況,χ2檢驗(yàn)B7-H1表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)及多因素 COX回歸。結(jié)果B7-H1在良性卵巢囊腫中均為低表達(dá),在卵巢癌組織中高表達(dá)率為55.4%(62/112);其表達(dá)水平與患者年齡、組織類型、細(xì)胞分化、腫瘤大小及是否合并CA125升高無(wú)關(guān)(P>0.05),而與患者FIGO分期及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05);B7-H1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)和總生存期(overall survival,OS)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為24.9和17.51,P值均<0.001)。COX回歸分析表明,B7-H1表達(dá)水平和FIGO分期是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論卵巢癌組織中B7-H1的表達(dá)水平與預(yù)后差和生存期短相關(guān),可為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

    【關(guān)鍵詞】卵巢癌;協(xié)同刺激分子;B7-H1

    (ThePracticalJournalofCancer,2016,31:380~383)

    隨著腫瘤免疫學(xué)及現(xiàn)代生物科技的發(fā)展,腫瘤免疫治療已經(jīng)取得突破性的進(jìn)展。B7家族是T細(xì)胞活化的重要協(xié)同刺激分子,B7-H1也稱PD-L1(programmed death-1-ligand 1),是該家族的第三個(gè)成員,該分子在誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫逃逸過(guò)程中具有重要作用[1]。而B7-H1在卵巢癌中的作用目前研究尚少,值得探討。我們收集與卵巢癌相關(guān)的臨床資料,擬合多因素COX模型分析B7-H1分子表達(dá)對(duì)卵巢癌患者復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)的影響,從而探討B(tài)7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義,為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

    1材料與方法

    1.1試劑

    B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體,USCNLIFE,USA,鼠/兔通用型二抗,購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

    1.2病例資料

    112例石蠟包埋組織標(biāo)本取自2005年2月至2009年12月間在我院住院手術(shù)治療的卵巢癌患者。年齡21~78歲,平均(55.1±12.5)歲;其中漿液性囊腺癌93例、粘液性囊腺癌12例、子宮內(nèi)膜樣腺癌3例、透明細(xì)胞癌4例;腫瘤大小1~4 000 cm3,平均(171.9±423.2)cm3;FIGO分期Ⅰ期26例、Ⅱ期7例、Ⅲ期72例、Ⅳ期7例;細(xì)胞分化Ⅰ級(jí)9例、Ⅱ級(jí)20例、Ⅲ級(jí)78例、交界性腫瘤5例;腫瘤位于雙側(cè)者65例,右側(cè)24例、左側(cè)23例;82例患者血CA125水平升高;腫瘤轉(zhuǎn)移85例。所有患者術(shù)前未接受化療或放療。手術(shù)標(biāo)本取材時(shí),癌組織均取自腫瘤原發(fā)灶。另取同期10例因良性卵巢囊腫手術(shù)切除的標(biāo)本做正常對(duì)照。

    所有患者均同時(shí)滿足下列條件:術(shù)后生存期≥3個(gè)月,死亡原因是卵巢癌而非其他疾病。通過(guò)查閱住院病例、電話或登門隨訪等方式對(duì)所有患者追蹤隨訪至2014年12月。

    1.3免疫組織化學(xué)染色

    由上海芯超公司將采集的所有蠟塊制作成組織芯片,然后進(jìn)行Elivision TM 免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后,將切片浸在檸檬酸鹽緩沖液中水浴加熱至100 ℃,持續(xù)30 min,進(jìn)行抗原修復(fù)。然后將切片冷卻浸在3%H2O2中30 min。然后用PBS浸洗3次。再加一抗B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體,1∶400稀釋,4 ℃過(guò)夜,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。將切片在PBS中浸洗3次,然后加二抗,室溫放置30 min,用PBS洗去二抗,經(jīng)DAB顯色,蘇木精復(fù)染,0.1%鹽酸酒精分化。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥后用中性樹脂封片。

    1.4免疫組化結(jié)果判讀

    應(yīng)用Immunohistochemical Scores(IHS)法對(duì)免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行評(píng)估。在200倍高倍鏡下,隨機(jī)選擇5個(gè)腫瘤區(qū)域,計(jì)數(shù)胞質(zhì)/胞膜內(nèi)有陽(yáng)性染色的腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù),根據(jù)其所占比例計(jì)分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分,陽(yáng)性細(xì)胞占1%~10%為1分,11%~50%為2分,51%~80%為分,81%~100%為4分;同時(shí)評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞染色的強(qiáng)弱:陰性計(jì)0分,弱陽(yáng)性計(jì)1分,中度陽(yáng)性計(jì)2分,強(qiáng)陽(yáng)性計(jì)3分。兩項(xiàng)得分的乘積即為該例病變的免疫組化評(píng)分:0為-,1~4分為+,5~8分為++,9~12分為+++。評(píng)分<4分為低表達(dá),≥4分為高表達(dá)。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,B7-H1高表達(dá)組及低表達(dá)組間比較采用χ2檢驗(yàn),生存分析采用Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)及Kaplan-Meier生存曲線法,對(duì)B7-H1表達(dá)、細(xì)胞分化程度、轉(zhuǎn)移與否及FIGO分期及年齡多因素分析采用COX模型分析。

    2結(jié)果

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:B7-H1分子在10例正常卵巢囊腫中均呈低表達(dá),在112例卵巢癌組織中高表達(dá)率為55.4%(62/112)。 且表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中,呈棕黃色至棕褐色顆粒或團(tuán)塊。

    B7-H1表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)類型、組織分化程度、FIGO臨床分期、腫瘤大小、CA125水平及轉(zhuǎn)移與否的關(guān)系見表1。

    表1 卵巢癌組織中B7-H1表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

    Kaplan-Meier 法檢測(cè)B7-H1表達(dá)水平不同患者的PFS及OS曲線見圖1和圖2?;颊逷FS的計(jì)算起點(diǎn)為手術(shù)當(dāng)日,終點(diǎn)為患者確診為腫瘤復(fù)發(fā)或病情惡化時(shí)。OS的計(jì)算起點(diǎn)為手術(shù)當(dāng)日,終點(diǎn)為患者死亡日期或截止日期。隨訪截止日期為2014年12月31日。112例卵巢癌患者隨訪5年中,B7-H1低表達(dá)者復(fù)發(fā)率為46.0%(23/50)、死亡率為34.0%(17/50);而高表達(dá)者復(fù)發(fā)率為82.3%(51/62)、死亡率為66.1%(41/62);B7-H1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者PFS[(1059.1±151.8)天 vs(2358.8±180.2)天]和OS[(1675.8±169.2)天vs(2654.1±149.4)天]比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為24.9和17.51,P值均<0.001)。

    COX回歸多因素分析結(jié)果: B7-H1表達(dá)情況(B=0.98,RR=2.66,P=0.002)和FIGO分期(B=0.78,RR=2.17,P=0.03)是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。

    圖1 B7-H1不同表達(dá)水平患者的PFS曲線圖

    圖2 B7-H1不同表達(dá)水平患者的OS曲線圖

    3討論

    B7-H1也稱pD-L1(programmed death ligand-1),是1999年發(fā)現(xiàn)的B7家族成員,B7-H1基因定位于人9p24.2[2],編碼產(chǎn)物為一個(gè)含290個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白,B7-H1的受體為PD-1(CD279),PD-1最初是通過(guò)削減雜交技術(shù),從小鼠凋亡期的雜交瘤及造血祖細(xì)胞系克隆得到的。由于其和細(xì)胞凋亡相關(guān)故被命名為程序性死亡-1(programmed death-1,PD-1)。人類PD-1基因編碼含288個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白,其細(xì)胞外區(qū)為免疫球蛋白樣IgV區(qū),細(xì)胞質(zhì)區(qū)含有2個(gè)酪氨酸基序,N端有1個(gè)免疫受體酪氨酸依賴抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM),C端有1個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine switch motif,ITSM),這兩個(gè)酪氨酸殘基磷酸化后可分別與酪氨酸磷酸酶 SHP-1 和 SHP-2結(jié)合,下調(diào) TCR 和 BCR 下游激活信號(hào)的磷酸化,轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號(hào),發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的作用[2-4]。這種表達(dá)特點(diǎn)可能與保護(hù)組織免受不必要的炎性反應(yīng)或免疫反應(yīng)有關(guān)。近些年的研究發(fā)現(xiàn),在許多人類腫瘤組織(如胃癌[5-6]、食管癌[7]、胰腺癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]、膀胱癌[11]、腎細(xì)胞癌[12]、淋巴瘤[13]、乳腺癌[14]和白血病[15]等)中均可檢測(cè)到 B7-H1 蛋白的異常表達(dá)。

    B7-H1在腫瘤組織中的表達(dá)水平和患者的臨床病理因素及預(yù)后存在顯著相關(guān)性。Ohigashi等[7]對(duì)食管癌患者腫瘤細(xì)胞B7-H1的表達(dá)水平與愈后相關(guān)性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)術(shù)前癌細(xì)胞B7-H1陽(yáng)性患者明顯比B7-H1陰性患者愈后差,1年生存率明顯降低,且癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。Wu等[5]對(duì)102例胃癌組織中B7-H1的表達(dá)情況和臨床病理學(xué)及預(yù)后相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),B7-H1在正常胃組織中沒(méi)有表達(dá),在胃腺瘤中微弱表達(dá),但在42.2%胃癌組織中強(qiáng)表達(dá)。而且,其表達(dá)程度和腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的生存期相關(guān)。多因素分析顯示,B7-H1表達(dá)情況是評(píng)價(jià)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。本研究檢測(cè)B7-H1在112例卵巢癌組織中的表達(dá)情況,并對(duì)患者進(jìn)行5到10年的隨訪,結(jié)果顯示B7-H1陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿或(和)胞膜,在10例良性卵巢囊腫中B7-H1均為低表達(dá),在卵巢癌中的B7-H1高表達(dá)率為55.4%,略高于于曉偉等[16]的研究結(jié)果。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn),B7-H1的表達(dá)水平和細(xì)胞分化、腫瘤大小、是否合并CA125升高及患者年齡無(wú)明顯相關(guān)性,而和患者FIGO分期及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?;颊吲R床分期越晚或是并發(fā)轉(zhuǎn)移者,其B7-H1表達(dá)水平越高。這和Wang等[11]采用mate分析研究B7-H1在膀胱癌中表達(dá)水平得出的結(jié)論類似。Hamanishi等[10]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中B7-H1的表達(dá)水平和腫瘤組織中CD8+T的數(shù)量負(fù)相關(guān),且多因素分析顯示,它們是患者的獨(dú)立預(yù)后因素。我們的研究顯示,B7-H1低表達(dá)者比高表達(dá)者有更長(zhǎng)的PFS和OS,高表達(dá)相對(duì)低表達(dá)有更高的復(fù)發(fā)率(82% vs 46%)和死亡率(66.1% vs 34%)。說(shuō)明卵巢癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1與預(yù)后差和生存短有關(guān)。而COX回歸分析亦顯示,B7-H1表達(dá)水平和FIGO分期是EOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

    Sun等[6]成功構(gòu)建兩種鼠抗人PD-L1單克隆抗體10E10 和2H11,它們可以抑制腫瘤相關(guān)PD-L1誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡,通過(guò)共刺激分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和免疫干預(yù)途徑進(jìn)行腫瘤免疫治療具有重要價(jià)值。DC表達(dá)B7-H1本身即可限制DC處于未成熟狀態(tài),與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及腫瘤進(jìn)展相關(guān)[9],通過(guò)沉默DC細(xì)胞B7-H1的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤免疫的實(shí)驗(yàn)研究也獲得了肯定的結(jié)果[17],這充分說(shuō)明B7-H1可作為激活機(jī)體抗腫瘤免疫治療的很好靶點(diǎn)。目前,該療法已被應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)治療并取得一定的成效[18]。因此,通過(guò)分子生物學(xué)手段檢測(cè)和控制卵巢癌細(xì)胞表面B7-H1分子的表達(dá),對(duì)于卵巢癌的治療和預(yù)防具有重要意義。

    參考文獻(xiàn)

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    (編輯:吳小紅)

    Expression and Clinical Significance of B7-H1 in Ovarian Cancer

    XUMei,ZHANGMeng,LIUYang,etal.

    CentralHospitalofXuzhou,Xuzhou,221009

    【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of B7-H1 in ovarian cancer.Methods112 biopsies from patients with epithelial ovarian cancer(EOC) and 10 specimens from ovarian benign neoplasm were processed into tissue chips.The expression of B7-H1 were detected by immunohistochemical method and its relationship with patients' clinical parameter were tested by Pearson Chi-Square.Survival curves were constructed using the Kaplan-Meier method and the log-rank test.The independent prognostic factors were evaluated by using the Cox regression model.ResultsThe B7-H1 high expression rates were 0 in benign ovarian neoplasm tissues and 55.4%(62/112) in EOC tissues.The level of B7-H1 expression was positively correlated with clinical stage and distant metastases(P<0.05).No relationship was observed between the expression of B7-H1 and age,primary tumor size,primary tumor classification,histological grade and the level of blood CA125(P>0.05).The progression-free survival(PFS) and the overall survival(OS) were significantly lower in patients with B7-H1 high expression than in those with B7-H1 low expression.Multi-variable analysis revealed that the expression of B7-H1 and the clinical stage could be regarded as the independent factor in evaluating the prognosis of EOC patients.ConclusionThe level of B7-H1 expression in EOC tissues is significantly correlated with the poor prognosis and relapse rate.B7-H1 might be a beneficial target for immunotherapy in EOC patients.

    【Key words】Ovarian neoplasrn;Co-stimulator;B7-H1

    (收稿日期2015-04-30修回日期 2015-10-28)

    中圖分類號(hào):R737.31

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1001-5930(2016)03-0380-04

    DOI:10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.010

    通訊作者:徐梅

    基金項(xiàng)目:徐州市醫(yī)學(xué)科研資助項(xiàng)目(編號(hào):XWJ2011038),徐州市中心醫(yī)院博士創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)科研資助(編號(hào):XZB201205)

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