羥基紅花黃色素A對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用

高　亭　蔣引娣　李　敏　何小鵬

712000 陜西中醫(yī)藥大學(xué)(高　亭);712000 咸陽(yáng)市中心醫(yī)院(高　亭，蔣引娣，李　敏,何小鵬)

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羥基紅花黃色素A對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用

高亭蔣引娣李敏何小鵬

712000 陜西中醫(yī)藥大學(xué)(高亭);712000 咸陽(yáng)市中心醫(yī)院(高亭，蔣引娣，李敏,何小鵬)

【摘要】目的研究羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)對(duì)C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的血管抑制作用。方法C57BL/6近交系小鼠30只，造模后，分為5組，每組6只，分別使用生理鹽水、環(huán)磷酰胺(CTX)及HSYA(分低、中、高3個(gè)劑量)作用于動(dòng)物模型。觀察各組腫瘤體積大小，分析小鼠生長(zhǎng)曲線，并在造模第22天處死所有小鼠，無菌條件下剝?nèi)×鼋M織進(jìn)行HE染色,觀察不同濃度HSYA在不同視野下對(duì)腫瘤血管的抑制情況。結(jié)果HSYA中、小劑量組對(duì)小鼠移植瘤血管生成有一定抑制作用。結(jié)論中藥羥基紅花黃色素A(HSYA)對(duì)Lewis肺癌小鼠移植瘤血管生成有一定的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】羥基紅花黃色素A；Lewis肺癌移植瘤；血管生成；HE染色

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:356～358)

肺癌仍是世界上最致命的腫瘤，2010年，在美國(guó)因肺癌死亡的人數(shù)約有157 300人，其中15 000～20 000人從未有過吸煙史[1-2]。盡管在過去二十年肺癌治療方式取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是長(zhǎng)期生存者卻很少：只有約10%的患者肺癌得到了緩解。新生血管在腫瘤的生成過程中起著重要的作用，對(duì)于其發(fā)生機(jī)制一直在不斷的研究。在前期的研究[3]當(dāng)中本課題組人員發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A(HSYA)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)具有一定的抑制作用，進(jìn)而證明HSYA對(duì)腫瘤血管生成是有一定抑制作用的，但是在病理改變中是否可以更直觀的看到，本課題組在新的實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤組織進(jìn)行HE染色后進(jìn)行顯微鏡觀察，以獲得個(gè)直觀的病理結(jié)果。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及細(xì)胞株

30只C57BL/6雄性小鼠，體重18～20 g，周齡6～8周，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供;小鼠Lewis肺癌瘤株由上海細(xì)胞所購(gòu)置。

1.2藥物與試劑

藥物及主要試劑環(huán)磷酰胺(CTX)，購(gòu)自江蘇恒瑞股份有限公司，200 mg/支;HSYA標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，純度:HPLC≥98.4%;10% 的中性甲醛溶液、脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木精、1%鹽酸酒精、伊紅、中性樹膠由咸陽(yáng)市中心醫(yī)院病理科提供。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠Lewis肺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清及DMEM的完全培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。藥物配置HSYA 標(biāo)準(zhǔn)品，用生理鹽水配制28、56及112 mg/L溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，無菌分裝，-20 ℃冷凍保存(HSYA 遇熱易分解)。陽(yáng)性藥CTX 用生理鹽水配成2 g/L的溶液。造模把瘤細(xì)胞株傳代至足夠數(shù)量后，待貼壁的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞活力大于95%，調(diào)整濃度，配制成1×107mL-1單細(xì)胞懸液，按0.2 mL/只接種于小鼠側(cè)肋腹皮下，復(fù)制小鼠Lewis 肺癌移植瘤模型。動(dòng)物分組及給藥瘤株接種24 h 后，將小鼠采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字編排分為5組，每組6只。分為對(duì)照組、CTX組(25 mg/kg)及HSYA大、中、小劑量組(1.40、0.70、0.35 mg/kg)。瘤株接種第2 天開始，HSYA大、中、小劑量組分別腹腔注射相應(yīng)濃度藥物(2次/d);對(duì)照組給予腹腔注射等量滅菌生理鹽水(2次/d);CTX組為瘤株接種第2天開始腹腔注射CTX 25 mg/kg(1次/2 d)。

1.4觀察項(xiàng)目

1.4.1HSYA對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠生活狀況的影響

用藥第2日開始對(duì)小鼠活動(dòng)情況，飲水、進(jìn)食、腫瘤破潰情況況進(jìn)行觀察并記錄。

1.4.2HSYA對(duì)Lewis肺癌移植瘤血管生成的病理影響第22 天，處死全部小鼠，取腫瘤組織，10%中性甲醛固定、石蠟包理，5 μm連續(xù)切片。采用HE染色法染色后，分別對(duì)每張切片觀察5個(gè)不同視野，觀察每個(gè)實(shí)驗(yàn)中腫瘤血管生成情況。

2結(jié)果

2.1HSYA對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠生活狀況的影響

用藥第20天生理鹽水組小鼠可見腫瘤破潰、出血，小鼠體型消瘦，不喜活動(dòng)，移動(dòng)遲緩，具有明顯的惡液質(zhì)體征，飲水、進(jìn)食明顯減少，毛色灰暗；HSYA小劑量組小鼠可見腫瘤突出皮膚，但無破潰及出血點(diǎn)，小鼠活動(dòng)略受限，毛色光滑；HSYA大、中劑量組小鼠可見腫瘤明顯突出皮膚表面，有明顯出血點(diǎn)，個(gè)別小鼠有明顯破潰，小鼠活動(dòng)稍遲緩，飲水、進(jìn)食可。CTX組小鼠可在皮下觸及黃豆大小突起，不能用游標(biāo)卡尺測(cè)及，小鼠活動(dòng)正常，無明顯功能障礙(圖1)。

2.2各組小鼠生存期的比較

各組57/6小鼠治療觀察120天，統(tǒng)計(jì)生存時(shí)間，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，使用Kaplan-Meier比較各組生存差異，得出各組中位生存率及95%可信區(qū)間，見表1。

圖1　C57BL/6小鼠皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)曲線

組別n平均生存期/天中位生存期/天95%可信區(qū)間下限上限生理鹽水組638±8.14222.154.2CTX組6101.7±14.711572.8128.4HSYA大劑量640.8±13.31514.866.9HSYA中劑量640.1±6.04828.351.8HSYA小劑量651.2±8.55138.968.4

2.3HSYA對(duì)Lewis肺癌移植瘤血管生成的HE染色表現(xiàn)

光學(xué)顯微鏡下可見大量Lewis肺癌細(xì)胞紊亂排列，形態(tài)不一，大小不等，細(xì)胞核藍(lán)色深染。生理鹽水組腫瘤細(xì)胞密集分布并侵入血管管腔；HSYA大劑量組可見以大血管為主，血管周圍有癌細(xì)胞聚集，血管壁被癌細(xì)胞破壞，管腔內(nèi)可見癌細(xì)胞浸潤(rùn)，且可見明顯的癌巢形成；HSYA中劑量組可見散在血管形成，管壁周圍亦被腫瘤細(xì)胞所包圍，且有個(gè)別管壁被腫瘤細(xì)胞所破壞；HSYA小劑量組癌細(xì)胞弱密集，無明顯血管生成；CTX 組腫瘤細(xì)胞有較多壞死,血管生成少見。

3討論

中醫(yī)認(rèn)為肺癌為正氣不足，邪氣內(nèi)侵致使血瘀、痰凝等病理變化壅滯于臟腑經(jīng)絡(luò)而形成[3]。腫瘤的血管形成是導(dǎo)致血瘀、痰凝主要原因，亦是導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)與侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素，抑制腫瘤血管生成是治療腫瘤的重要方法。本研究發(fā)現(xiàn)，小劑量HSYA作用于荷瘤小鼠，能有效抑制小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，但其治療效果較陽(yáng)性對(duì)照組(CTX組)較差，這可能是因?yàn)镃TX對(duì)早期處于分裂期的癌細(xì)胞有較大的殺傷作用，同時(shí)又具有抑制腫瘤血管生成的作用[4]。腫瘤組織的病理切片HE染色后亦顯示，HSYA 大劑量組血管生成較多，且以大血管為主，這是因?yàn)镠SYA大劑量情況下主要表現(xiàn)為活血化瘀的作用，有利于腫瘤血管的生成。而HSYA小劑量組未見明顯血管生成。觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)HSYA中、小劑量組干預(yù)的荷瘤小鼠生存質(zhì)量明顯好于生理鹽水組，所以HSYA中、小劑量在抑制小鼠移植瘤生長(zhǎng)的同時(shí)為小鼠帶來了生存優(yōu)勢(shì)。Xi等[5]研究證實(shí)HSYA對(duì)裸鼠人胃腺癌BGC-823移植瘤血管生成有一定的抑制作用。本研究同樣顯示，移植瘤經(jīng)HSYA治療后，瘤組織的血管生長(zhǎng)不及生理鹽水組多，這與奚勝燕等的研究一致。

研究顯示腫瘤在生長(zhǎng)到1～2 mm左右是就需要通過腫瘤的新生血管來為腫瘤提供足夠的養(yǎng)分[6]，而腫瘤血管形成是通過一些列復(fù)雜的過程實(shí)現(xiàn)的，如內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、細(xì)胞基質(zhì)的降解等。應(yīng)用藥物干預(yù)腫瘤血管生成的任何一個(gè)關(guān)節(jié)均可以導(dǎo)致腫瘤血管生成障礙，本研究人員[7]在前期研究中發(fā)現(xiàn)HSYA可以有效抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，從而抑制了腫瘤新生血管的形成。本次病理結(jié)果更進(jìn)一步揭示了HSYA對(duì)血管抑制作用的具體表現(xiàn)。

因此，通過病理分析我們可以得出HSYA對(duì)腫瘤血管生成有一定抑制作用，這與我們前期[7]測(cè)定VEGF表的結(jié)果相一致。HSYA對(duì)腫瘤生成的其他分子機(jī)制是否仍有抑制作用，我們將在下一步的課題研究中繼續(xù)深入研究。

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(編輯：吳小紅)

Anti-tumor Effect of Hydroxysafflor Yellow A on Transplanted Tumor of Lewis Lung Cancer Mice

GAOTing,JIANGYindi,LIMin,etal.

ShaanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,XianyangCentralHospital,Xianyang,712000

【Abstract】ObjectiveTo study the inhibitive effect of hydroxysafflor yellow A on transplanted tumor of Lewis lung cancer in C57BL/6 mice.MethodsThe model of C57BL/6 mice bearing Lewis lung cancer was established by subcutaneous seeding of Lewis lung cancer cells,and randomly divided into 5 groups(n=6).Tumor-bearing mice were injected with normal saline,cyclophosphamide(CTX)or hydroxysafflor yellow A (low,medium or high dose)in each group.All mice were sacrificed on day 22nd under aseptic condition for the rumor collection.The transplanted tumors use hematoxylin-eosin staining.Different concentrations of hydroxysafflor yellow A inhibition of tumor blood vessels were observed.Results Small dose and medium dose hydroxysafflor yellow A can inhibit angiogenesis in transplanted tumor of mice.ConclusionHydroxysafflor yellow A can inhibit tumor angiogenesis of Lewis lung cancer in mice.

【Key words】Hydroxysafflor yellow A；Transplanted tumor of Lewis lung cancer;Angiogenesis;Hematoxylin-eosin staining

(收稿日期2015-04-10修回日期 2015-10-13)

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)03-0356-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.003

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：14JK1208)