設(shè)施番茄連作障礙與土壤芽孢桿菌和假單胞菌及微生物群落的關(guān)系分析

葛曉穎，孫志剛，李　濤，歐陽竹*

（1.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所/中國科學(xué)院生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點實驗室/中國科學(xué)院禹城試驗站，北京100101；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

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設(shè)施番茄連作障礙與土壤芽孢桿菌和假單胞菌及微生物群落的關(guān)系分析

葛曉穎1，2，孫志剛1，李濤1，2，歐陽竹1*

（1.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所/中國科學(xué)院生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點實驗室/中國科學(xué)院禹城試驗站，北京100101；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

摘要：以山東壽光及禹城地區(qū)不同連作年限（1～21年）的54個設(shè)施番茄土壤為研究對象，研究芽孢桿菌（Bacillus spp.）和假單胞菌（Pseudomonas spp.）及土壤微生物群落隨連作年限的變化及其與土壤養(yǎng)分的關(guān)系，進(jìn)而分析土壤中芽孢桿菌和假單胞菌與連作障礙之間的關(guān)系。結(jié)果表明：土壤細(xì)菌隨著連作年限的持續(xù)增加而逐漸減少，連作年限少于6～10年時芽孢桿菌和假單胞菌的數(shù)量為增加趨勢，連作6～10年后表現(xiàn)為減少趨勢；PCR-DGGE（變性濃度梯度凝膠電泳）結(jié)果顯示，作為土壤優(yōu)勢種群的芽孢桿菌及假單胞菌也在連作4～5年后減少，均與連作障礙發(fā)生（集中于5～10年）的時間基本吻合。土壤微生物生物量氮、碳隨著連作年限呈增加趨勢，符合指數(shù)增長模型（R2分別為0.30及0.20，P＜0.001）。由于設(shè)施番茄土壤肥料投入量大，土壤有機(jī)碳、C/N隨著連作年限的增加而增加，呈顯著正相關(guān)關(guān)系；土壤細(xì)菌數(shù)量與土壤C/N呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過對設(shè)施連作番茄土壤分析可知，連作番茄土壤中土壤細(xì)菌數(shù)量隨連作年限呈減少趨勢，芽孢桿菌及假單胞菌數(shù)量隨著連作年限的變化與土壤連作障礙出現(xiàn)的時間基本吻合，可能是導(dǎo)致連作土壤微生物群落發(fā)生變化的原因。

關(guān)鍵詞：設(shè)施番茄；連作障礙；微生物群落；芽孢桿菌；假單胞菌

葛曉穎，孫志剛，李濤，等.設(shè)施番茄連作障礙與土壤芽孢桿菌和假單胞菌及微生物群落的關(guān)系分析[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2016, 35（2）：514-523.

GE Xiao-ying, SUN Zhi-gang, LI Tao, et al. Soil Pseudomonas spp., Bacillus spp., and microbial communities under tomato continuous cropping in greenhouse production[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35（2）: 514-523.

2012年我國番茄（Lycopersicum esculentum Mill.）栽培面積達(dá)到100萬hm2[1]，是最重要的棚室蔬菜之一。設(shè)施番茄經(jīng)濟(jì)效益高、農(nóng)民增收效果明顯、單位面積產(chǎn)值遠(yuǎn)超過大田糧食和露地蔬菜作物。連作是目前我國設(shè)施番茄栽培的主要方式，長期連續(xù)種植同一種蔬菜作物，將導(dǎo)致連作土壤中有害微生物逐漸富集，土傳病害頻繁發(fā)生。目前，研究者將連作障礙歸因于土壤微生物群落的變化[2]。土壤微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)及土壤-作物生長體系中均發(fā)揮重要作用，土壤微生物總量、活性和有益微生物數(shù)量是評價土壤活性高低的重要指標(biāo)[3]。在健康的土壤生態(tài)系統(tǒng)中，有益微生物的種類和數(shù)量遠(yuǎn)大于有害微生物，而同一種作物長期連作導(dǎo)致土壤微生物和植物之間相互選擇，使得某些特定微生物富集，病原菌數(shù)量增加，而有益細(xì)菌種類和數(shù)量減少[4]。長期連作的土壤微生物特性主要表現(xiàn)為多樣性下降；細(xì)菌數(shù)量下降、真菌數(shù)量上升；病原微生物數(shù)量上升、有益微生物數(shù)量下降等[5]。

植物促生菌即PGPR是指自由生活在土壤、根際、根表以及葉際，在一定條件下有利于植物生長的細(xì)菌[6]。相對于價格昂貴、高生產(chǎn)值、高環(huán)境風(fēng)險的化學(xué)肥料來說，PGPR作為潛在的土壤微生物資源，對于發(fā)展可持續(xù)型及環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)有非常重要的意義。土壤假單胞菌（Pseudomonas spp.）及芽孢桿菌（Bacillus spp.）含眾多植物促生菌（PGPR），是重要的土壤細(xì)菌。多種假單胞菌及芽孢桿菌接種到作物中可以促進(jìn)作物生長[7]、減少作物病蟲害[8]。而長期連作導(dǎo)致土壤假單胞菌多樣性耗竭[9]，芽孢桿菌數(shù)量減少[5]。茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的番茄青枯病是設(shè)施番茄中最常見的土傳細(xì)菌病害，國內(nèi)外眾多研究表明，設(shè)施番茄連作障礙與致病型茄科勞爾氏菌有關(guān)，芽孢桿菌及假單胞菌類PGPR對勞爾氏菌有很好的抑制效果[10]。

目前針對芽孢桿菌及假單胞菌的研究可歸結(jié)于兩個方面：一方面驗證某一或某些菌株的PGPR特性，以期得到能夠在多種作物或土壤中發(fā)揮作用的菌種資源；另一方面則是研究PGPR類芽孢桿菌及假單胞菌在不同作物或土壤類型中發(fā)揮作用的機(jī)理。本研究則首次嘗試將芽孢桿菌及假單胞菌當(dāng)作一類土壤微生物，研究其在土壤微生物群落中發(fā)揮的作用及其與連作障礙的關(guān)系。因此，本研究選擇山東壽光及禹城地區(qū)集約化蔬菜產(chǎn)區(qū)的不同連作年限設(shè)施番茄土壤（1～21年），對其中芽孢桿菌及假單胞菌的數(shù)量以及土壤微生物群落、土壤碳氮進(jìn)行分析，探討土壤中芽孢桿菌及假單胞菌隨著連作年限的變化與土壤連作障礙之間的關(guān)系，以期為解決我國蔬菜連作障礙問題提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究區(qū)域及樣本采集

本研究以我國最大的蔬菜生產(chǎn)基地——山東省壽光市蔬菜生產(chǎn)基地以及位于山東省北部的禹城蔬菜生產(chǎn)區(qū)不同連作年限番茄大棚土壤為研究對象。壽光（118°32'～119°10'E，36°41'～37°19'N）有我國最大的設(shè)施蔬菜生產(chǎn)基地，其耕地面積的65%用于設(shè)施蔬菜生產(chǎn)[15]。壽光處于中緯度帶，屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，年平均氣溫12.7℃，歷年平均降水量593.8 mm。土壤類型、無霜期及其他信息見Ruan等[8]。禹城地處山東西北部（116°22'～116°45'E，36°41'～37°12'N），同屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，年均溫度為13.1℃，年均降水量593.2 mm，其他信息包括土壤類型、無霜期等見Chen等[11]。

樣品采集于2012年11月，選擇栽培措施和管理方法相近、不同連作年限的設(shè)施番茄大棚54個，在采樣的同時調(diào)查施肥量及產(chǎn)量，如表1所示。每個大棚取0～20 cm根層土壤，采用“之”字型取樣，每棚取7鉆，充分混勻，取新鮮土壤測定微生物生物量C、N。然后將土樣分為兩份，其中一份過0.5 mm孔徑的篩子并放入4℃冰箱保存，供常規(guī)土壤理化指標(biāo)測定，包括土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷及速效鉀等；另一份存于超低溫冰箱中（溫度-80℃），供測定土壤中細(xì)菌、芽孢桿菌、假單胞菌的數(shù)量和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等微生物指標(biāo)。

表1　土壤樣本量及相應(yīng)氮磷鉀施肥量調(diào)查Table 1 Annual nitrogen，phosphorus，and potassium fertilizer inputs in soils of greenhouse tomato under continuous operation for a wide range of years in Shouguang（SG）and Yucheng（YC）Counties

1.2土壤化學(xué)性質(zhì)測定

土壤pH測定使用1：2.5的土水比；土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）使用重鉻酸鉀氧化法[12]；土壤全氮（TN）使用凱氏定氮法；土壤有效磷（AP）和速效鉀（AK）分別用Olsen磷法和火焰分光光度計法（FP6410，上海儀電分析儀器有限分司）測定，參考中國農(nóng)業(yè)出版社出版的《土壤農(nóng)化分析》[13]方法進(jìn)行。

1.3土壤微生物生物量碳和生物量氮

采用氯仿熏蒸浸提方法測定微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）[14]。稱取相當(dāng)于20.0 g干土重的新鮮土壤放入培養(yǎng)皿中，將其置于真空干燥器中（底部含有少量NaOH和去乙醇氯仿），抽真空后保持氯仿沸騰3～5 min，然后將干燥器轉(zhuǎn)移到黑暗條件下于25℃熏蒸24 h，將熏蒸好的土壤全部轉(zhuǎn)移到250 mL三角瓶中，加入約100 mL 0.5 mol·L-1K2SO4提取液（土水比為1：5），振蕩30 min后過濾。溶液中的有機(jī)碳（TOC）和總氮用自動TOC分析儀（Vario TOC，Elementar lnc.）測定。同時，未熏蒸空白和試劑空白也用以上同樣的方法處理，每份土壤重復(fù)3次。MBC和MBN采用Tian等[15]的方法計算。

1.4土壤DNA提取

土壤DNA提取使用MOBIO土壤DNA提取試劑盒進(jìn)行（MOBIO Laboratories，lnc. CA，USA）。提取出的DNA用微量紫外分光光度計（UV-2550，日本島津）進(jìn)行濃度及純度檢測。檢測后的DNA存放于-20℃冰箱中以備qPCR（熒光定量PCR）及PCR-DGGE（變性濃度梯度凝膠電泳）分析使用。

1.5qPCR分析

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)菌株與培養(yǎng)基

本研究用qPCR方法定量土壤中的細(xì)菌、芽孢桿菌及假單胞菌。標(biāo)準(zhǔn)株分別是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌，其中枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌來自中國微生物菌種保存中心（CGMCC）。將標(biāo)準(zhǔn)株接種于NA培養(yǎng)基（葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏0.5 g，牛肉浸膏3 g，加水至1 L，調(diào)pH至7.0）上，于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用于定量土壤總細(xì)菌、芽孢桿菌及假單胞菌的特異性引物如表2所示。引物的專一性對定量結(jié)果起決定性作用，因此試驗前需驗證所選擇的引物專一性。方法如下：應(yīng)用枯草芽孢桿菌的DNA及芽孢桿菌屬的定量引物（Bac F及Bac R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物為500 bp，而以水為對照或以熒光假單胞菌的DNA與芽孢桿菌屬的定量引物反應(yīng)，在500 bp處無擴(kuò)增產(chǎn)物，證明芽孢桿菌的引物是專一性的。用同樣的方法測定土壤細(xì)菌及假單胞菌的引物也為專一性引物，可以在qPCR反應(yīng)中用于定量土壤中的細(xì)菌和假單胞菌。

土壤細(xì)菌、芽孢桿菌、假單胞菌采用Invitrogen公司的實時熒光PCR試劑盒SYBR Green qRT-PCR kit with ROX在ABI7500TM進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。將經(jīng)過濃度和純度檢測的陽性質(zhì)粒依次稀釋，1.0×100～1.0×10-7，每個梯度3次重復(fù)，最后選取擴(kuò)增效率高的5～6個梯度用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。陰性對照以無菌超純水代替。每個樣品重復(fù)3次。各反應(yīng)的退火溫度及擴(kuò)增產(chǎn)物片段見表2。

1.6PCR-DGGE

選擇壽光地區(qū)栽培模式、管理方法相近的不同連作年限番茄土壤進(jìn)行PCR-DGGE分析。PCR擴(kuò)增引物是16S rDNA的V3區(qū)通用引物，分別是338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和534R 5'-CGCC CGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG （ATTACCGCGGCT GCTGG）-3'[19]。PCR反應(yīng)條件：94 ℃10 min；94℃變性1 min，55℃退火1.5 min（每個循環(huán)降低0.1℃），72℃延伸1.5 min此過程進(jìn)行30個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

表2　實時熒光定量土壤總細(xì)菌、芽孢桿菌及假單胞菌的引物Table 2 Primers for total bacteria，Bacillus spp. and Pseudomonas spp.

DGGE電泳條件：采用的膠濃度為8%，變性范圍為30%～60%，電泳條件為150 V、420 min。在含0.5 μg·mL-1EB的1×TAE緩沖液中染色15 min，取出后用凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA）進(jìn)行拍照。測序時將回收的產(chǎn)物片段重新擴(kuò)增，引物及循環(huán)反應(yīng)條件與PCR反應(yīng)的引物序列及反應(yīng)條件相同，產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化（天根生物科技有限公司，中國）。測序過程由寶杰羅生物科技有限公司（北京）完成。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

本研究根據(jù)文獻(xiàn)資料中連作障礙發(fā)生的時間進(jìn)行歸納（下文表5），將不同連作年限的土壤按照連作番茄的年限劃分為4個范圍：≤3年（CCY3，新建大棚），4～5年（CCY5，開始出現(xiàn)連作障礙的時間），6～10年（CCY10，連作障礙集中發(fā)生的時間），＞10年（CCY10+，老齡棚，包括連作11～21年的土壤）。土壤理化性質(zhì)、肥料用量以及產(chǎn)量均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（sd）的形式表示。不同處理間的差異顯著性檢驗采用單因素ANOVA，LSD檢驗，P＜0.05為差異顯著。在指數(shù)模型、線性模型、二次方程式模型、對數(shù)模型及多項式模型等趨勢線模型中，通過比較R2以及P值選擇最為合適的趨勢線模型。不同變量之間的相關(guān)性通過Spearman（2-tailed）分析得出。

所有數(shù)據(jù)分析均通過SPSS12.0完成，在數(shù)據(jù)處理過程中剔除部分異常值（例如MBN測定值為負(fù)數(shù)的2個樣品）。為了研究土壤中細(xì)菌、芽孢桿菌及假單胞菌數(shù)量的變化規(guī)律，qPCR測定土壤DNA樣品時，將檢測不到數(shù)值或個別嚴(yán)重偏離整體平均值的樣品剔除。

表3　不同連作年限設(shè)施番茄土壤理化性質(zhì)Table 3 Chemical properties of soils in tomato continuous cropping in greenhouses for a wide range of years

2　結(jié)果與分析

2.1土壤養(yǎng)分的變化

不同連作年限番茄土壤的pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、碳氮比、有效磷及速效鉀如表3所示。土壤pH隨連作年限呈下降趨勢，但差異并不顯著。土壤有機(jī)質(zhì)隨連作年限呈上升趨勢，CCY5與CCY3相比，有機(jī)質(zhì)的變化差異并不顯著，而CCY10、CCY10+與CCY3及CCY5相比顯著增加了土壤有機(jī)質(zhì)的含量，分別比CCY3增加了16%、36%。CCY10+土壤中全氮顯著高于其他連作年限，比CCY3增加22%。CCY10+土壤中C/N相比CCY3增加了10%。土壤有效磷及速效鉀在不同連作年限土壤中的變化無顯著性差異。

不同土壤化學(xué)性質(zhì)與連作年限間（1～21年）的相關(guān)關(guān)系分析表明，土壤有機(jī)質(zhì)及C/N與土壤連作年限呈顯著相關(guān)（P＜0.01），但其他土壤養(yǎng)分含量與土壤連作年限之間無顯著相關(guān)關(guān)系。

2.2土壤微生物生物量碳、氮的變化

不同連作年限土壤樣品的微生物生物量碳、氮的變化如圖1所示。微生物生物量碳氮隨不同連作年限表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，在連作初期即0～3年內(nèi)，微生物生物量碳、氮均較低，在連作4～10年期間均處于快速增長的階段，而連作10年以上則增長趨于平緩。土壤MBN值介于20.9～93.8 mg·kg-1之間（平均值為57.3 mg·kg-1），MBC值介于87.9～263.1 mg·kg-1之間（平均值為178.7 mg·kg-1）。土壤微生物生物量碳、氮與連作年限之間符合對數(shù)模型：MBN與連作年限R2= 0.30，n=52（其中2個樣品的測定值為負(fù)數(shù)，判斷為異常值，已舍去），P＜0.001；MBC與連作年限R2=0.20，n=54，P＜0.001。CCY10+土壤中MBN含量比CCY3土壤增加21.6 mg·kg-1（50.2%），MBC含量比CCY3土壤增加37.2 mg·kg-1（22.8%）。

圖1　不同連作年限土壤微生物生物量碳、氮含量Figure 1 Soil microbial biomass-C and N over years of tomato continuous cropping in greenhouse

2.3細(xì)菌、芽孢桿菌及假單胞菌的數(shù)量

由標(biāo)準(zhǔn)菌株及本研究所選擇的定量引物得到標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)（Ct）與各反應(yīng)體系測定的基因拷貝數(shù)（Copy number）均有很好的線性關(guān)系（土壤細(xì)菌、芽孢桿菌及假單胞菌的R2分別是0.996、0.992及0.999），標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。土壤細(xì)菌總量隨著番茄連作年限的增加而下降（圖3），符合對數(shù)模型（R2=0.18，n= 42，P=0.02），細(xì)菌數(shù)量從CCY3土壤中的6.9×106個下降為CCY10+土壤中的4.9×106個（下降29.3%）。連作年限小于6年時，芽孢桿菌、假單胞菌數(shù)量隨著連作年限不斷增加；連作年限大于10年時，隨著連作年限的增加而減少；總體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖3）。整體變化趨勢符合多項式模型：芽孢桿菌為R2= 0.12，n=44，P=0.08；假單胞菌為R2=0.20，n=42，P= 0.07。

圖2　定量土壤細(xì)菌、芽孢桿菌和假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curves for total bacteria，Bacillus spp. and Pseudomonas spp.

2.4土壤性質(zhì)之間的相關(guān)性分析

不同連作年限番茄土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物性質(zhì)之間的相關(guān)性如表4所示。土壤有機(jī)質(zhì)與全氮、C/N之間表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與P2O5及土壤假單胞菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。TN與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），但與土壤P2O5、K2O及芽孢桿菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。土壤細(xì)菌數(shù)量與C/N及芽孢桿菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；芽孢桿菌數(shù)量與假單胞菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

2.5土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

不同連作年限番茄土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4所示。連作4年的土壤獲得條帶數(shù)最多（20條），連作11年土壤條帶數(shù)最少（12條）。不同連作年限土壤的DGGE圖譜中存在特異性條帶，如：條帶Ⅰ（假單胞菌）和條帶Ⅱ（海洋沉積細(xì)菌）僅存在于連作4年的土壤中；條帶Ⅲ（芽孢桿菌）僅存在于連作7年的土壤中；條帶Ⅳ（不可培養(yǎng)的微桿菌）僅存在于連作13年的土壤中。除以上所述的一些特異性菌群外，還有一些菌群并非單一存在于某一特定土壤，但是其在不同土壤中條帶亮度有所不同，如條帶V（Nealsonii芽孢桿菌）和條帶Ⅵ（假單胞菌）雖然同時存在于各個連作年限的土壤中，但是在連作4年和5年的土壤中其條帶亮度大于其他連作年限土壤，說明在連作4年和5年的土壤中，芽孢桿菌和假單胞菌的種群數(shù)量大于其他連作年限土壤。

表5列出了幾種常見作物連作年限與土壤微生物性質(zhì)及作物產(chǎn)量的關(guān)系。土壤微生物方面的障礙主要表現(xiàn)為微生物多樣性下降、微生物生物量減少、功能群落減少、有益微生物減少、土傳病害增加等。土壤出現(xiàn)連作障礙的時間多數(shù)集中于4～10年之間。作物方面的連作障礙主要表現(xiàn)為產(chǎn)量下降，時間集中于連作4～7年。

圖3　土壤細(xì)菌、芽孢桿菌和假單胞菌的數(shù)量隨種植年限的變化趨勢Figure 3 Soil total bacteria，Bacillus spp. and Pseudomonas spp. copy number changed with years of tomato continuous cropping

圖4　不同連作年限設(shè)施番茄土壤DGGE圖譜Figure 4 DGGE patterns under different continuous tomato cropping years

3　討論

3.1長期連作對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

長期連續(xù)種植設(shè)施番茄對土壤化學(xué)性質(zhì)有顯著影響。Guo等[38]指出在集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其是長期連作設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中，大量投入N肥（表1）及氮肥利用效率低下會導(dǎo)致土壤發(fā)生酸化。在本研究中，土壤pH隨連作年限的增加呈下降趨勢，由CCY3土壤中的8.02下降為CCY10+土壤中的7.88。設(shè)施番茄最適宜生長的pH為7.0左右，從本研究來看，由于土壤本身為鹽堿性土壤，長期連作雖然導(dǎo)致土壤酸化，但pH的下降使得土壤酸堿性更適宜番茄生長。

長期連作設(shè)施番茄導(dǎo)致土壤SOM及TN增加（表3）。為了培肥土壤、確保高產(chǎn)，農(nóng)戶每年都會將一定量的有機(jī)肥（如牛糞、雞糞等）投入設(shè)施番茄土壤中，這部分有機(jī)肥成為增加土壤有機(jī)質(zhì)及總氮的主要來源。任濤[39]總結(jié)14個相關(guān)研究結(jié)果表明，SOC在連作前10年范圍內(nèi)表現(xiàn)為增加趨勢，連作10年后表現(xiàn)為下降趨勢。Yang等[40]總結(jié)100多個相關(guān)研究結(jié)果表明，土壤N庫與土壤C庫為線性相關(guān)關(guān)系，且SOC的增加會導(dǎo)致TN的增加。同樣的，在本研究中，SOM 與TN也呈線性相關(guān)關(guān)系（TN=13.798SOM+1.454，R2= 0.697 4，n=54）。土壤TN與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)，也與其他研究結(jié)果一致[8]，表明N肥的過量使用導(dǎo)致土壤pH值下降[38]。也有SOC及TN隨著連作年限變化呈現(xiàn)相反變化趨勢的研究結(jié)果，Naranjo等[41]研究表明SOC及TN隨著甘蔗連作年限（5～30年）的增加而降低，但SOC及TN的降低并未導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量下降，而是增加67%。將本研究中選取的連作番茄土壤肥料投入量與該甘蔗試驗的肥料投入量相比，發(fā)現(xiàn)設(shè)施番茄的肥料投入量遠(yuǎn)大于甘蔗肥料的投入量，因此SOM及TN的變化趨勢不同是合理的。

表4　不同連作年限番茄土壤性質(zhì)之間的相關(guān)性分析Table 4 Spearman correlation coefficients between chemical properties and microbial properties of soils with different continuous cropping years

表5　幾種常見作物連作年限對土壤性質(zhì)及產(chǎn)量的影響Table 5 Soil properties and yield responses to continuous cropping years for several commonly continuously-cultured crops

3.2不同連作年限對土壤MBC及MBN的影響

土壤微生物生物量與土壤團(tuán)聚體、土壤養(yǎng)分循環(huán)以及土壤有機(jī)質(zhì)都有重要關(guān)系，因此它是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)[42]，也是評價土壤質(zhì)量的必要指標(biāo)之一。研究表明，對土壤MBC及MBN影響最主要的因素是有機(jī)肥的調(diào)控而非其他養(yǎng)分或環(huán)境因子[42-43]。本研究結(jié)果表明，MBC與MBN隨著連作年限的增加而增加，符合對數(shù)增長模型（圖1）。土壤有機(jī)碳含量是影響土壤微生物生物量的關(guān)鍵因素[43]，土壤有機(jī)碳含量越高，則土壤微生物生物量越高。本研究中土壤有機(jī)質(zhì)隨著連作年限的增長而增加，MBC與MBN也表現(xiàn)為隨連作年限的增長而增加。

在本研究中，雖然土壤MBC及MBN隨著連作年限而增加，但連作設(shè)施番茄土壤MBC及MBN的平均值遠(yuǎn)低于草地土壤的微生物生物量（781±253 mg·kg-1，Trasar-Cepeda等[44]），也低于普通農(nóng)田土壤微生物生物量（351±21 mg·kg-1，Cynthia等[42]）。農(nóng)田擾動是造成這一現(xiàn)象的原因之一，例如不斷地施用化肥、灌溉等，影響了土壤微生物生物量的恢復(fù)，使得土壤微生物群落處于持續(xù)的擾動-恢復(fù)狀態(tài)。除此以外，近期也有相關(guān)研究表明化學(xué)肥料的投入對土壤微生物生物量有抑制作用。設(shè)施番茄生產(chǎn)過程中，農(nóng)戶習(xí)慣性投入過量的肥料可能對土壤微生物群落產(chǎn)生不利的影響（表1）。

3.3不同連作年限對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過對已發(fā)表的連作年限相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)，得出連作障礙通常出現(xiàn)在連作5～10年間（表5），包括產(chǎn)生土壤鹽漬化、土壤微生物多樣性下降，土壤真菌及病菌數(shù)量增加、作物產(chǎn)量下降等。本研究選擇壽光地區(qū)栽培措施、管理方法相似、連作年限不同的設(shè)施番茄土壤，采用qPCR及DGGE兩種方法研究土壤中兩種重要土壤細(xì)菌——芽孢桿菌和假單胞菌及微生物群落隨連作年限的變化規(guī)律。結(jié)果表明，土壤芽孢桿菌、假單胞菌及土壤微生物優(yōu)勢種群均在連作6～10年間表現(xiàn)出下降趨勢（圖3和圖4），與生產(chǎn)中連作障礙出現(xiàn)的時間基本吻合。

未受干擾的自然土壤中，有益微生物和有害微生物通常處于平衡狀態(tài)，有利于作物生長；相反，現(xiàn)代集約化農(nóng)業(yè)栽培體系中，連續(xù)單一種植后，土壤微生物的平衡狀態(tài)被打破，有益微生物減少，有害微生物增加，不利于作物生長。就目前已有的研究來看，大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的PGPR細(xì)菌屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬[45]，這兩個菌屬中的多種菌株都具有抑制土傳病害和促進(jìn)作物生長的功能[7]，例如熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。但并非所有的芽孢桿菌及假單胞菌都是PGPR細(xì)菌，因此并沒有明確的證據(jù)表明土壤芽孢桿菌及假單胞菌的含量可以用來作為土壤微生物指標(biāo)，指示土壤性質(zhì)。但本研究發(fā)現(xiàn)土壤芽孢桿菌及假單胞菌連作6～10年開始下降，與連作障礙發(fā)生的時間基本一致。因此，我們可以推斷，土壤中芽孢桿菌和假單胞菌作為包含大量植物促生菌的優(yōu)勢細(xì)菌種群，它們的存在對維持良好的土壤微生態(tài)環(huán)境有一定的作用。

土壤細(xì)菌數(shù)量隨連作年限的增加表現(xiàn)為逐漸下降趨勢（圖3）。近期有很多研究表明，土壤肥力、有機(jī)物質(zhì)、植被類型、土壤pH等都對土壤細(xì)菌豐度及群落結(jié)構(gòu)有重要影響[44，46]，Wu等[47]采用qPCR的方法研究水稻長期施肥試驗中土壤細(xì)菌的變化，結(jié)果表明在養(yǎng)分含量較高的土壤中細(xì)菌數(shù)量較高。Wessén等[48]也得出相似的研究結(jié)果，即長期施用硝酸鈣及硫酸銨的土壤具有較高的細(xì)菌數(shù)量。因此，施用化肥有助于增加土壤細(xì)菌含量。在本研究中，采集樣品的兩個區(qū)域農(nóng)戶的施肥方式和數(shù)量相似，均為頻繁施用過量化學(xué)肥料（表1），我們推斷施肥不是導(dǎo)致土壤細(xì)菌數(shù)量下降的直接原因。Shen等[46]的研究表明，土壤細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)與土壤pH呈顯著正相關(guān)。根據(jù)這一結(jié)果，本研究中因施肥導(dǎo)致的pH隨連作年限不斷下降可能是導(dǎo)致土壤細(xì)菌數(shù)量下降的直接原因。

DGGE圖譜（圖4）表明土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群在連作4～5年后開始下降，也與文獻(xiàn)中連作障礙出現(xiàn)的時間一致。對DGGE圖譜的測序結(jié)果表明，連作4年和5年土壤中的條帶Ⅰ和Ⅵ為假單胞菌，連作7年和4年土壤中的條帶Ⅲ和V為芽孢桿菌。根據(jù)這些條帶的亮度來看，DGGE對兩種細(xì)菌的定性研究結(jié)果與qPCR的研究結(jié)果一致。此外，DGGE對設(shè)施番茄土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化分析也與近期連作黃瓜的研究結(jié)果一致。土壤微生物群落變化帶來微生物群落功能變化，進(jìn)而影響作物生長[46]。

4　結(jié)論

土壤細(xì)菌隨著連作年限的增加而逐漸減少，可能與土壤pH降低有關(guān)；當(dāng)連作年限少于6～10年時，芽孢桿菌和假單胞菌的數(shù)量表現(xiàn)為增加趨勢，連作6～10年后逐漸減少；DGGE圖譜及測序結(jié)果定性地反映了作為土壤優(yōu)勢菌群的芽孢桿菌和假單胞菌在連作4～5年后種群密度降低，均與連作障礙發(fā)生的時間基本吻合。因此，作為土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌及PGPR的重要組成，芽孢桿菌及假單胞菌的數(shù)量變化可能與導(dǎo)致連作障礙的土壤微生物群落變化有關(guān)。在未來的研究中，應(yīng)用多種研究手段在不同作物體系中分析芽孢桿菌及假單胞菌與連作障礙的關(guān)系，將對研究連作障礙的機(jī)理及調(diào)控有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] FAO. Production：Crops. 2015b. http：//faostat. fao. org/site/567/default. aspx#ancor.

[2]王敬國,陳清,林杉,等.設(shè)施菜田退化土壤修復(fù)與資源高效利用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2011：46-48. WANG Jing-guo, CHEN Qing, LIN Shan, et al. Management of degraded vegetable soils in greenhouses[M]. Beijing：China Agricultural University Press, 2011：46-48.

[3]何文壽.設(shè)施農(nóng)業(yè)中存在的土壤障礙及其對策研究進(jìn)展[J].土壤, 2004, 36（3）：235-242. HE Wen-shou. Soil problems and countermeasure in facility agriculture in China[J]. Soils, 2004, 36（3）：235-242.

[4]吳鳳芝,趙鳳艷,劉元英.設(shè)施蔬菜連作障礙原因綜合分析與防治措施[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2000, 31（3）：241-247. WU Feng-zhi, ZHAO Feng-yan, LIU Yuan-ying. Comprehensive analysis and preventive measures for the cause of continuous cropping obstacle of facilities[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2000, 31（3）：241-247.

[5] Xiong W, Zhao Q Y, Zhao J, et al. Different continuous cropping spans significantly affect microbial community membership and structure in a vanilla-grown soil as revealed by deep pyrosequencing[J]. Microbial E-cology, 2015, 70（1）：209-218.

[6] Bashan Y, Holguin G. Proposal for the division of plant growth-promoting rhizobacteria into two classifications：Biocontrol -PGPB（Plant Growth-Promoting Bacteria）and PGPB[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1998, 30（4）：1225-1228.

[7] Gravel V, Antoun H, Tweddell R J. Growth stimulation and fruit yield improvement of greenhouse tomato plants by inoculation with Pseudomonas putida or Trichoderma atroviride：Possible role of indole acetic acid（IAA）[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2007, 39（8）：1968-1977. [8] Ruan W B, Ren T, Chen Q, et al. Effects of conventional and reduced N inputs on nematode communities and plant yield under intensive vegetable production[J]. Applied Soil Ecology, 2013, 66（4）：48-55.

[9] Xiong W, Li Z G, Liu H J, et al. The effect of long-term continuous cropping of black pepper on soil bacterial communities as determined by 454 pyrosequencing[J]. Plos ONE, 2015, 10（8）：1-13.

[10] Zhou T T, Chen D, Li C Y, et al. Isolation and characterization of Pseudomonas brassicacearum J12 as an antagonist against Ralstonia solanacearum and identification of its antimicrobial components[J]. Microbiological Research, 2012, 167（7）：388-394.

[11] Chen B, Ouyang Z, Sun Z G, et al. Evaluation on the potential of improving border irrigation performance through border dimensions optimization：A case study on the irrigation districts along the lower Yellow River [J]. Irrigation Science, 2013, 31（4）：715-728.

[12] Nelson D W, Sommers L E. Total carbon, organic carbon and organic matter[M]//Methods of soil analysis. Part 3：Chemical methods, soil science society of America. Wisconsin：Madison, 1996：961-1010.

[13]鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005. BAO Shi-dan. Soil agro-chemistrical analysis[M]. Beijing：China A-griculture Press, 2005.

[14] Ge T D, Chen X J, Yuan H Z, et al. Microbial biomass, activity, and community structure in horticultural soils under conventional and organic management strategies[J]. European Journal of Soil Biology, 2013, 96（6）：122-128.

[15] Tian Y Q, Zhang X Y, Liu J, et al. Microbial properties of rhizosphere soils as affected by rotation, grafting, and soil sterilization in intensive vegetable production systems[J]. Scientia Horticulturae, 2009, 123 （2）：139-147.

[16] Castillo M, Marti'n-Oru'e S M, Manzanilla E G, et al. Quantification of total bacteria, enter bacteria and lactobacilli population in pig digesta by real-time PCR[J]. Veterinary Microbiology, 2006, 114（1-2）：165-170.

[17] Mori K, R Iriye, M Hirata. Quantification of Bacillus species in a wastewater treatment system by the molecular analyses[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2004, 9（6）：482-489.

[18] Kaare J, Oivind E, CarstenS J, et al. Quantitative selective PCR of 16S ribosomal DNA correlates well with selective agar plating in describing population dynamics of indigenous Pseudomonas spp. in soil hot spots [J]. Applied Environmental Microbiology, 1999, 65（4）：1786-1788.

[19] Muyzer G, Smalla K. Application of denaturing gradient gel elec -trophoresis（DGGE）and temperature gradient gel electrophoresis （TGGE）in microbial ecology[J]. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 1998, 73（1）：127-141.

[20]胡元森.黃瓜連作障礙因子分析及其生物修復(fù)措施探討[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005. HU Yuan-sen. Factors analysis of continuous cucumber cropping obstacle and its preparatory bioremediation[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2005.

[21]馬云華,魏珉,王秀峰.日光溫室連作黃瓜根區(qū)微生物區(qū)系及酶活性的變化[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2004, 6（6）：1005-1008. MA Yun-hua, WEI Min, WANG Xiu-feng. Variation of microflora and enzyme activity in continuous cropping cucumber soil in solar greenhouse[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2004, 6（6）：1005-1008.

[22]申衛(wèi)收,林先貴,張華勇,等.不同栽培條件下蔬菜塑料大棚土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的變化[J].土壤學(xué)報, 2008, 45（1）：137-142. SHEN Wei-shou, LIN Xian-gui, ZHANG Hua-yong, et al. Numbers of Fusarium oxysporum in different greenhouse vegetable soils[J]. Acta Pedologica Sinica, 2008, 45（1）：137-142.

[23]時立波.連作年限及殺線劑對番茄根圍土壤線蟲及微生物影響的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009. SHI Li-bo. Effects of continuous tomato-cropping and different nematicides on soil nematodes and soil microorganism from rhizosphere soil[D]. Taian: Shandong Agricultural University, 2009.

[24]張靜文.連作和輪作棉田土壤微生物多樣性分析及PGPR菌株篩選[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009. ZHANG Jing-wen. Soil microbial diversity analysis in cotton continuous fields under continuous and rotation cropping systems and screening of plant-growth promoting rhizobacteria strains[D]. Urumchi:Xinjiang Agricultural University, 2009.

[25]顧美英,徐萬里,茆軍,等.連作對新疆綠洲棉田土壤微生物數(shù)量及酶活性的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2009, 27（1）：1-11. GU Mei-ying, XU Wan-li, MAO Jun, et al. Effects of cotton continuous cropping on the amount of soil microbes and enzyme activities in Xinjiang[J]. Agricultural Research in the Arid Areas, 2009, 27（1）：1-11.

[26]劉建國,張偉,李彥斌,等.新疆綠洲棉花長期連作對土壤理化性狀與土壤酶活性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42（2）：725-733. LIU Jian-guo, ZHANG Wei, LI Yan-bin, et al. Effects of long-term continuous cropping system of cotton on soil physical-chemical properties and activities of soil enzyme in oasis in Xinjiang[J]. Scientia agriculture sinica, 2009, 42（2）：725-733.

[27]盤莫誼,張楊珠,肖嫩群,等.煙草連作對旱地土壤微生物及酶活性的影響[J].世界科技研究與發(fā)展, 2008, 30（3）：295-297. PAN Mo-yi, ZHANG Yang-zhu, XIAO Nen-qun, et al. Effect of con-tinuous cropping tobacco on the microbes and enzyme activities in dry land soil[J]. World Sci-tech R&D, 2008, 30（3）：295-297.

[28]陳冬梅,柯文輝,陳蘭蘭,等.連作對白肋煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2010, 21（7）：1751-1758. CHEN Dong-mei, KE Wen-hui, CHEN Lan-lan, et al. Diversity of bacterial community in rhizosphere soil under effects of continuously planting burley tobacco[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2010, 21（7）：1751-1758.

[29]楊宇虹,陳冬梅,晉艷,等.連作煙草對土壤微生物區(qū)系影響的T-RFLP分析[J].中國煙草學(xué)報, 2012, 18（1）：40-45. YANG Yu-hong, CHEN Dong-mei, JIN Yan, et al. T-RFLP analysis of soil microbial diversity after continuous tobacco cropping[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2012, 18（1）：40-45.

[30]賈歡歡.馬鈴薯連作對根際細(xì)菌和真菌遺傳多樣性的影響[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013. JIA Huan-huan. Effect of continuous potato cropping on genetic diversity of bacterium and fungi in potato rhizosphere[D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University, 2013.

[31]許永利.生姜連作土壤生態(tài)系統(tǒng)調(diào)控研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014. XU Yong-li. Regulation on ginger continuous cropping soil ecosystem [D]. Beijing：China Agriculture University, 2014.

[32]陳政.連作生姜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013. CHEN Zheng. Analysis of continuous cropping on rhizosphere microbial community structure in ginger field[D]. Taian：Shandong Agriculture University, 2013.

[33]吳鳳芝,孟立君,王學(xué)征.設(shè)施蔬菜輪作和連作土壤酶活性的研究[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2006, 12（4）：554-558. WU Feng-zhi, MENG Li-jun, WANG Xue-zheng. Soil enzyme activities in vegetable rotation and continuous cropping system of under shed protection[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2006, 12（4）：554-558.

[34]賀麗娜,梁銀麗,高靜,等.連作對設(shè)施黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)及土壤酶活性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報, 2008, 36（5）：155 -159. HE Li-na, LIANG Yin-li, GAO Jing, et al. The effect of continuous cropping on yield, quality of cucumber and soil enzymes activities in solar greenhouse[J]. Journal of Northwest A&F University, 2008, 36 （5）：155-159.

[35]郭紅偉.連作對土壤性狀和辣椒生育、生理代謝的影響[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011. GUO Hong -wei. Effect of continuous cropping on physicochemical properties of soil and growth, physiological metabolism of pepper[D]. Nanjing: Agriculture University, 2011.

[36]許艷麗,劉曉冰,韓曉增,等.大豆連作對生長發(fā)育動態(tài)及產(chǎn)量的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 1999, 32（增刊1）：62-68. XU Yan-li, LIU Xiao-bing, HAN Xiao-zeng, et al. Effect of continuous cropping on yield and growth development of soybean[J]. Scientia A-gricultura Sinica, 1999, 32（Suppl1）：62-68.

[37]鄧陽春,黃建國.長期連作對烤煙產(chǎn)量和土壤養(yǎng)分的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2010, 16（4）：840-845. DENG Yang-chun, HUANG Jian-guo. Effect of long continuous cropping on the yields of flue-cured tobacco and nutrients in soils[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2010, 16（4）：840-845.

[38]Guo J H, Liu X J, Zhang Y, et al. Significant acidification in major Chinese croplands[J]. Science, 2010, 327（5968）：1008-1010.

[39]任濤.不同氮肥及有機(jī)肥投入對設(shè)施番茄土壤氮去向的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011：9-11. REN Tao. Effect of different nitrogen fertilizer and organic fertilizer on the soil nitrogen in greenhouse tomato[D]. Beijing：China Agriculture University, 2011：9-11.

[40] Yang Y H, Luo Y Q, Finzi A C. Carbon and nitrogen dynamics during forest stand development：A global synthesis[J]. New Phytologist, 2011, 190（4）：977-989.

[41] Naranjo D L F, Salgado -Garcia S, Lagunes -Espinoza L C, et al. Changes in the properties of a Mexican Fluvisol following 30 years of sugarcane cultivation[J]. Soil & Tillage Research, 2006, 88（1）：160-167.

[42] Cynthia K, Stuart A G. Controls over soil microbial biomass responses to carbon amendments in agricultural systems：A meta-analysis[J]. A-griculture Ecosystems & Environment, 2011, 144（1）：241-252.

[43] Fierer N, Strickland M S, Liptzin D, et al. Global patterns in belowground communities[J]. Ecology Letters, 2009, 12（11）：1238-1249.

[44] Trasar-Cepeda C, Leirós M C, Seoane S, et al. Biochemical properties of soils under crop rotation[J]. Applied Soil Ecology, 2008, 39（2）：133-143.

[45] Farah A, Iqbal A, Khan M S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities[J]. Microbiological Research, 2008, 163（2）：173-181.

[46] Shen J P, Zhang L M, Guo J F, et al. Impact of long-term fertilization practices on the abundance and composition of soil bacterial communities in Northeast China[J]. Applied Soil Ecology, 2010, 46（1）：119-214.

[47] Wu M N, Qin H L, Chen Z, et al. Effect of long-term fertilization on bacterial composition in rice paddy soil[J]. Biology and Fertility of Soil, 2011, 47（4）：397-405.

[48] Wessén E, Hallin S, Philippot L. Differential responses of bacterial and archaeal groups at high taxonomical ranks to soil management[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42（10）：1759-1765.

Soil Pseudomonas spp., Bacillus spp., and microbial communities under tomato continuous cropping in greenhouse production

GE Xiao-ying1,2, SUN Zhi-gang1, LI Tao1,2, OUYANG Zhu1*
（1. Key Laboratory of Ecosystem Network Observation and Modeling / Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Abstract：Long-term continuous cropping is unsustainable for vegetable production, especially for greenhouse vegetables. Most researchers have attributed the harmful effects of continuous cropping to the changes in soil microbial ecology. However, soil Pseudomonas spp. and Bacillus spp., two most important PGPR（plant growth promoting rhizobacteria）and dominant bacteria, have seldom been examined in investigating the microbial processes of continuous cropping obstacles until now. In this study, we investigated changes in soil Pseudomonas spp. and Bacillus spp. populations under continuous cropping and their relationships with soil microbial community using samples from 54 greenhouse tomato fields across continuous cropping years of 1～21 in Shouguang County and Yucheng County, Shandong, China. Results show that the number of total soil bacteria decreased as continuous cropping years increased, whereas the populations of Bacillus spp. and Pseudomonas spp. increased when continuous cropping years were shorter than 6～10 and then decreased after that. Results from PCR-DGGE （Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）profile and sequence showed that Bacillus spp. and Pseudomonas spp. decreased after 4～5-year continuous cropping, which was similar to the actual period during which continuous cropping obstacles commonly occur（mainly 5～10book=515,ebook=113years）. Soil organic carbon and C/N ratio significantly increased with the extension of continuous cropping time, and soil microbial C and N were a logarithmic function of continuous cropping year（R2were 0.20 and 0.30, respectively, P＜0.001）. Soil bacteria were significantly negatively correlated to soil C/N. Our investigation indicates that the occurrence of continuous cropping obstacles closely relates to the dynamic changes in these two dominant populations, suggesting that soil Bacillus spp. and Pseudomonas spp. play vital roles in maintaining soil ecology and soil health under long-term continuous cropping.

Keywords：greenhouse tomato; continuous cropping; microbial community structure; Bacillus spp.; Pseudomonas spp.

*通信作者：歐陽竹E-mail：ouyz@igsnrr.ac.cn

作者簡介：葛曉穎（1984—），女，內(nèi)蒙古巴彥淖爾市人，博士研究生，主要研究方向為農(nóng)田土壤養(yǎng)分及土壤微生物。E-mail：xiaoying_ge@126.com

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）之作物健康生長農(nóng)藝調(diào)控技術(shù)項目（2013AA102903）

收稿日期：2015-10-14

中圖分類號：S154.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）03-0514-10

doi:10.11654/jaes.2016.03.015