重金屬協(xié)同選擇環(huán)境細菌抗生素抗性及其機制研究進展

張佳奇，徐　艷，羅　義，毛大慶*

（1.天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津300072；2.南開大學環(huán)境科學與工程學院教育部環(huán)境污染過程與基準重點實驗室，天津300071）

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重金屬協(xié)同選擇環(huán)境細菌抗生素抗性及其機制研究進展

張佳奇1，徐艷2，羅義2，毛大慶1*

（1.天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津300072；2.南開大學環(huán)境科學與工程學院教育部環(huán)境污染過程與基準重點實驗室，天津300071）

摘要：抗生素的長期濫用，引起環(huán)境細菌耐藥性不斷增強，加速了抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes, ARGs）在環(huán)境中的傳播擴散。在重金屬污染的環(huán)境中，細菌不僅具備重金屬抗性，并且具備多種抗生素抗性，抗生素抗性基因的污染水平也隨之升高。在介紹重金屬與抗生素抗性最新研究進展的基礎(chǔ)上，闡述了環(huán)境細菌的抗生素抗性、重金屬抗性及其相關(guān)抗性機制，并著重論述重金屬和抗生素協(xié)同選擇環(huán)境細菌耐藥性及其機制。

關(guān)鍵詞：抗生素抗性；重金屬抗性；協(xié)同選擇抗性；協(xié)同選擇抗性機制

張佳奇，徐艷，羅義,等.重金屬協(xié)同選擇環(huán)境細菌抗生素抗性及其機制研究進展[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2016, 35（3）：409-418.

ZHANG Jia-qi, XU Yan, LUO Yi, et al. Co-selection mechanisms of bacterial resistance to heavy metals and antibiotics[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35（3）: 409-418.

近年來，由于抗生素的濫用引起細菌耐藥問題越來越受到關(guān)注。在抗生素長期作用下抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）在環(huán)境中以及細菌中被不斷篩選和富集，從而表現(xiàn)為耐藥性整體水平升高，進而導致抗生素類藥物的治療效力大大降低，迫使抗生素不斷升級換代。通?？股卦诃h(huán)境中的含量極低（通常在10-9～10-6數(shù)量級），遠低于最低抑菌濃度（MIC），在低濃度抗生素長期選擇壓力作用下，細菌逐漸產(chǎn)生耐藥性且攜帶的抗性基因持久存在，并在各種環(huán)境介質(zhì)中傳播擴散。尤其是最近出現(xiàn)的“超級細菌”被賦予了能夠抵抗幾乎所有抗生素的能力，其抗性根源在于該細菌攜帶的NDM-1（New Delhi metallo-β-lactamase-1）抗性基因，該基因自首次發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)在全球迅速蔓延[1]。據(jù)此，抗生素抗性基因作為一個新的全球性污染問題已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將“細菌耐藥問題”作為21世紀威脅人類健康最大的挑戰(zhàn)之一，并將在全球范圍內(nèi)對抗性基因的控制做出戰(zhàn)略部署。

1　環(huán)境中抗生素抗性與重金屬抗性的研究進展

目前人們認為抗生素的濫用是引起環(huán)境細菌耐藥性增加的主要因素，Luo等[2]對我國海河流域表層水和沉積物中抗生素抗性基因的定量研究發(fā)現(xiàn)，兩種磺胺類抗生素抗性基因sul1和sul2的相對豐度與磺胺類抗生素的含量存在顯著的正相關(guān)性。沈群輝等[3]的研究也獲得了類似的發(fā)現(xiàn)，黃浦江流域江水中sul3 和tetW以及底泥中的sul2豐度與對應(yīng)的磺胺類抗生素含量顯著正相關(guān)，江水中sulA與水中的氯霉素、四環(huán)素的含量顯著相關(guān)。這些研究表明，環(huán)境中的殘留抗生素作為抗生素抗性基因富集的環(huán)境選擇壓力促進了環(huán)境中抗性基因水平升高。然而近期研究發(fā)現(xiàn)，在臨床和自然環(huán)境中，抗生素使用量的減少有時并不能有效控制抗生素抗性在環(huán)境中的傳播和擴散[4]。Enne 等[5]研究結(jié)果表明，盡管臨床上磺胺類抗生素的使用量已經(jīng)減少了97%，但是大腸桿菌的磺胺抗性豐度卻依然保持不變，對于這種現(xiàn)象，有研究認為磺胺抗性基因與其他的抗性基因連鎖在同一個可移動的遺傳元件上。Dantas等[6]從土壤中提取了480種鏈霉菌菌株，發(fā)現(xiàn)平均每種菌株對7～8種抗生素有耐藥性，且其耐藥對象還包括新開發(fā)出來的抗生素。細菌抗性基因?qū)θ驴股匾簿哂心退幮?，說明抗生素的存在并不是抗性基因發(fā)展的唯一影響因子。因此，環(huán)境中其他因素同樣可能影響抗性基因的濃度水平及其傳播擴散[7-8]。

在自然環(huán)境中，某些重金屬離子作為細菌生長所必需的微量元素（如Zn、Cu、Mn、Mg、Ca、K等），當處于痕量水平時可促進微生物生長，并且能通過各種生理代謝機制維持體內(nèi)所需金屬離子的動態(tài)平衡；然而，當上述金屬離子超過一定濃度時，就會阻礙細菌生長，降低多樣性，甚至殺死菌體。與抗生素相比較，重金屬化學性質(zhì)較穩(wěn)定，在環(huán)境中不易降解，其作為典型的環(huán)境污染物，在我國水/土環(huán)境介質(zhì)中具有較高的背景值，已引起廣泛關(guān)注。細菌可以通過相應(yīng)機制對重金屬毒性產(chǎn)生耐受或抗性。目前，一些金屬如Zn、Cu等微量元素作為飼料添加劑已被廣泛添加到飼料中，造成養(yǎng)殖業(yè)的重金屬污染問題，同時為了實現(xiàn)增產(chǎn)，多種抗生素也被添加到畜禽養(yǎng)殖飼料中，我們已經(jīng)在養(yǎng)殖動物的糞便中發(fā)現(xiàn)高濃度的抗生素和重金屬[7]。高濃度的抗生素和重金屬導致畜禽養(yǎng)殖廠及其周邊環(huán)境抗生素和重金屬交叉污染，重金屬和抗生素對細菌產(chǎn)生抗生素和重金屬抗性的協(xié)同、交叉等機制，加劇了抗生素抗性基因的污染[8]。

越來越多的研究表明抗生素抗性基因的豐度與環(huán)境中的重金屬污染密切相關(guān)。De la lglesia等[9]研究認為，抗生素抗性基因的豐度與抗生素以及As、Cu等重金屬污染程度顯著相關(guān)，表明As、Cu等重金屬和抗生素的復合污染可以增加環(huán)境中抗性基因的豐度。同時，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)重金屬與細菌耐藥性的關(guān)系。在重金屬污染地區(qū)，細菌不僅對重金屬具備抗性，還能對多種抗生素產(chǎn)生抗性，即抗生素抗性基因水平隨著重金屬污染水平增加而增加[10-25]。

Kolpin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，地表水與城市水循環(huán)系統(tǒng)中含有大量多重抗性細菌，在重金屬污染的位點會導致抗藥性的增強。Gao等[11]對上海一個污水廠的水樣研究也發(fā)現(xiàn)，樣品中Zn和Pb含量大小對紅霉素抗性基因具有重要的選擇作用。Stepanauskas等[12]在實驗室模擬的微宇宙實驗中發(fā)現(xiàn)水中抗生素抗性檢出頻率隨重金屬暴露濃度的升高而升高，在金屬Cd的影響下，氨芐青霉素抗性菌株（Ralstonia mannitolilytica）富集。重金屬引起微生物抗藥性水平升高在野外研究中也有報道。Berg等[13]對高Cu污染地區(qū)的土壤土著菌的研究表明，在這些環(huán)境中的微生物不僅對Cu具有很高的耐受性，對四環(huán)素和萬古霉素的耐藥性也顯著增加，同時發(fā)現(xiàn)土壤中的Cu不僅篩選出對其具有抗性的土著菌，也篩選出了對抗生素具有抗性的土著菌。Knapp等[14]對蘇格蘭地區(qū)多處土壤樣品的研究分析表明，土壤中Cu的含量與土壤中多種抗性基因（tetM、tetW、blaOXA、ermB、ermF）的豐度有著顯著的正相關(guān)性，而Cr、Ni、Pb等金屬的含量與一些特定的抗性基因豐度具有顯著正相關(guān)性。其中與金屬Cr相關(guān)的基因型有tetM、blaCTX-M、blaOXA，與金屬Ni相關(guān)的基因型是tetW，而tetM基因型的豐度同時受到金屬Cu、Ni和Pb的含量水平的影響。在農(nóng)業(yè)土壤中Cu的廣泛富集不僅能增強土著菌對Cu的耐受性，而且能夠增強其抗生素抗性[15]。Wardwell等[16]研究表明，在美國緬因州中心沼澤泥樣品中，Hg含量的增加不僅能增強環(huán)境中細菌對Hg的抗性，而且能同時增加細菌的多重抗藥性。Alonso等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，土壤中Cu的暴露特異性能夠選擇出對Cu具有抗性的菌株，同時能夠協(xié)同選擇抗生素抗性菌株。Ji等[18]對上海多個畜牧養(yǎng)殖場的動物糞便和周邊土壤樣品的研究發(fā)現(xiàn)，樣品中Cu、Zn和Hg的含量與磺胺類抗性基因，特別是sul2基因的豐度具有顯著的正相關(guān)性，同時發(fā)現(xiàn)重金屬As的含量與tetB基因豐度也具有顯著正相關(guān)性。研究結(jié)果說明，糞肥和施用過糞肥的土壤中的重金屬能協(xié)同選擇部分抗性基因。不僅在土壤介質(zhì)，水環(huán)境中也有重金屬污染引起微生物抗藥性增強的報道。McKinney等[19]對畜牧養(yǎng)殖場泄湖水樣的研究發(fā)現(xiàn)，樣品中重金屬含量與抗生素抗性基因豐度存在相關(guān)性。Lu等[20]對大遼河和遼河入?？诘乃畼友芯堪l(fā)現(xiàn)，在大遼河樣品中，金屬Cr、Co、Ni、Cu、Zn和Pb的含量與sul1、sul2和sul3基因豐度具有顯著正相關(guān)性，同時金屬Mn、Ni和Zn的含量與int1豐度顯著相關(guān)。Icgen等[21]研究了土耳其克澤爾河水中重金屬與抗生素抗性共生微生物，對290株分離菌株的研究發(fā)現(xiàn)，24株對重金屬與抗生素同時具有抗性，其中50%～92%的分離菌株對重金屬Pb、Sn、Ag、Ni、Ba、Li具有抗性，超過50%的菌株抗喹諾酮類、磺胺類、氨基糖苷類抗生素。Devarajan等[22]對瑞士日內(nèi)瓦湖不同位置底泥沉積物樣品的定性定量研究表明，樣品中抗性基因（blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaNDM和aadA）和大腸桿菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬等指示細菌的豐度、含量與有機物質(zhì)含量、重金屬含量密切相關(guān)。Wu等[23]對上?；⒘值貐^(qū)和溆浦地區(qū)兩個垃圾中轉(zhuǎn)站和一個垃圾填埋場的垃圾滲濾液樣品研究表明，sul1、sul2、tetM、tetQ、ermB及mefA等抗性基因豐度與Cr、Cd、Ni和As等金屬含量水平有著顯著相關(guān)性。此外，在臨床研究中Alonso等[24]發(fā)現(xiàn)，臨床分離的革蘭式陰性菌（Stenotrophomonas maltophilia）中包含抗生素抗性基因和重金屬抗性基因，在該研究中發(fā)現(xiàn)的抗性基因中包括抗大環(huán)內(nèi)酯類基因（mphB）和抗鎘外流泵基因（cadA），及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)編碼基因（cadC）。Ahmad等[25]研究發(fā)現(xiàn)，從煉油廠的廢水中分離出的菌株至少抗一種重金屬（＞200 μg·mL-1），在研究的13種抗菌類藥物中，這些菌株也至少抗一種抗菌類藥物。

上述研究表明，環(huán)境中的重金屬污染對抗生素抗性基因的篩選具有促進作用。

2　細菌抗生素抗性與重金屬抗性的協(xié)同選擇機制

目前，公認的細菌耐藥性機制包括：細菌生理活動使抗生素分解或失去活性；細菌生理活動使抗生素作用的靶點發(fā)生改變；抗生素的存在改變細菌細胞特性；細菌產(chǎn)生藥泵將進入細胞的抗生素泵出細胞。細菌的重金屬抗性機制有：細菌細胞阻止金屬離子內(nèi)流作用；細胞內(nèi)的隔離作用和解毒作用；細胞促進金屬離子外流；進入細胞內(nèi)金屬的轉(zhuǎn)化作用等。

隨著微生物抗性的提高和微生物耐藥性的普遍存在，加上新型合成和復合金屬材料以及重金屬抗菌劑的廣泛應(yīng)用，重金屬與抗生素的協(xié)同選擇抗性問題越來越普遍，并且引起廣泛的關(guān)注。

2.1細菌抗生素抗性與重金屬抗性的協(xié)同抗性機制

協(xié)同抗性指細菌攜帶的多種特定抗性基因位于同一遺傳元件上，如質(zhì)粒、整合子或者轉(zhuǎn)座子等[8，10]（圖1）。研究發(fā)現(xiàn)重金屬抗性基因和抗生素抗性基因可以存在于質(zhì)粒上[21，26]，利用轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒消除及質(zhì)粒測序等方法可證實兩者的協(xié)同抗性。

Rasmussen等[26]對丹麥海港水域的研究發(fā)現(xiàn)，從重金屬污染的水域中分離出來的菌株較之非重金屬污染水域分離出來的菌株含有更多的抗性質(zhì)粒。Davison等[27]研究同樣發(fā)現(xiàn)，抗生素的選擇壓力的存在對于抗生素抗性基因的選擇并不一定是必需的。從自然環(huán)境中分離出來的菌株，通常發(fā)現(xiàn)抗生素抗性基因和重金屬抗性基因是相關(guān)聯(lián)的。在臨床樣本中，重金屬銀與磺胺類抗生素抗性的協(xié)同選擇是因為銀和磺胺類抗生素的抗性基因位于同一個復制子上[28]。臨床上，用0.5% AgNO3溶液處理患者的燒傷表面，對處理后燒傷表面分離得到鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）進行研究，結(jié)果表明Ag離子可以選擇出對Ag和多種抗生素同時具有抗性的菌株，這些菌株攜帶有這兩種抗性基因的抗性質(zhì)粒[29]。Summers 等[30]和Edlund等[31]的研究指出，牙科上使用的牙科Hg合金可以篩選出口腔和腸道內(nèi)抗生素抗性增強的菌株。Davis等[32]對牙科Hg合金的研究也發(fā)現(xiàn)，從空腔中分離得到的屎腸桿菌中發(fā)現(xiàn)一種新的抗Hg操縱子位于轉(zhuǎn)座子上（Tnmer1在ISL3家族），且在該轉(zhuǎn)座子上發(fā)現(xiàn)抗鏈霉素基因aadK。除了在臨床樣本上發(fā)現(xiàn)抗生素抗性基因與重金屬抗性基因在同一個基因遺傳元件上有相關(guān)性外，在人工養(yǎng)殖環(huán)境樣本中也發(fā)現(xiàn)有這兩類基因協(xié)同存在的報道。Hasman等[33]發(fā)現(xiàn)從養(yǎng)豬場分離出的屎腸桿菌（E. faecium）對銅和大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類抗生素具有抗性，同時發(fā)現(xiàn)抗Cu基因tcrB與抗大環(huán)內(nèi)酯類基因ermB、抗糖肽類抗生基因vanA存在相關(guān)性，原因可能由于它們同時位于同一接合質(zhì)粒上。McIntosh等[34]從水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida），并在其中一個IncA/C的質(zhì)粒上鑒定出抗Hg操縱子（mer operon）和多種抗生素抗性基因，包括氟洛芬抗生素的抗性基因floR。Wright等[35]和Rosewarne等[36]發(fā)現(xiàn)受重金屬污染的水環(huán)境中，Ⅰ類整合子的豐度有顯著的提升。此外，通過病原體傷寒沙門氏菌血清型CT18基因組測序，發(fā)現(xiàn)接合質(zhì)粒（pHCM1）上存在抗甲氧芐氨嘧啶（dhfr1b）、磺胺類藥（sul2）、氨芐青霉素（bla）和鏈霉素（strAB）基因以及一個抗Hg操縱子[10]。

圖1　細菌抗生素與重金屬協(xié)同選擇抗性機制圖示Figure 1 Co-selection mechanisms for bacterial antibiotic and heavy metal resistance

綜上所述，細菌協(xié)同抗性產(chǎn)生的本質(zhì)原因是抗生素抗性基因和重金屬抗性基因位于同一個抗性遺傳載體上。細菌抗生素抗性和重金屬抗性連鎖傳播的主要載體有接合性質(zhì)粒、整合子及轉(zhuǎn)座子[37]。整合子作為基因捕獲系統(tǒng)，位于染色體和質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，通過質(zhì)粒或作為轉(zhuǎn)座子的一部分在細菌間進行傳播[38]。其中一類整合子被認定對抗性連鎖傳播有重要作用，它們通常含有耐藥基因盒，并且在長期重金屬壓力下，這類整合子介導的耐藥細菌具有選擇性優(yōu)勢。

諸多研究發(fā)現(xiàn)，在多種細菌體內(nèi)存在可移動的抗性連鎖傳播載體。Zhang等[37]在香港沙田的五個污水處理廠的活性污泥樣本中都發(fā)現(xiàn)一類整合酶基因intⅠ1與抗生素和重金屬抗性基因同時存在，從香港兩座污水廠活性污泥中分離出來的109株腸桿菌Enterobacteriaceae中，33%的菌株中同樣也發(fā)現(xiàn)一類整合子。除了污水廠活性污泥樣本，一類整合子普遍存在于環(huán)境污水中、自然河流及土壤介質(zhì)中，在介導抗生素和重金屬抗性中起重要作用[35-36]。上述研究表明，在特定環(huán)境中，這些可移動抗性遺傳載體在細菌抗生素抗性基因和重金屬抗性基因連鎖傳播過程中發(fā)揮重要作用，并對重金屬和抗生素復合污染環(huán)境下細菌協(xié)同抗性的產(chǎn)生起到?jīng)Q定性作用。

2.2細菌抗生素抗性與重金屬抗性的交叉抗性機制

交叉抗性是指細菌細胞利用同一種抗性系統(tǒng)對抗生素和重金屬同時產(chǎn)生抗性，例如外排泵系統(tǒng)（圖1）。這種間接的選擇過程是因為抗生素和重金屬的抗性機制的耦合作用，這種抗性機制在生理學上的耦合作用稱為交叉抗性；而如圖中1-1部分在基因上的耦合作用稱為協(xié)同抗性。在交叉抗性的作用情形下，菌株對多種抗菌劑具有抗性，這些抗菌劑包括多種抗生素和重金屬離子[39]。當不同的抗生素攻擊同一靶點時，可啟動細胞共同通路或者共享一個共同的途徑獲得各自的作用目標。

之前研究發(fā)現(xiàn)，傷寒沙門菌（S.enterica serovar）具有多種藥物外排泵，其中外排泵mdtABC和AcrD使其對β-內(nèi)酰胺、新生霉素、Cu和Zn離子產(chǎn)生抗性。Aendekerk等[ 40]對銅綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中MexGHI-OpmD外排泵的研究發(fā)現(xiàn)，整個外排泵的反式運輸機制增強了對金屬V和抗生素替卡西林的抗性。Gillings等[41]和Stokes等[42]研究發(fā)現(xiàn)，從淡水中分離出來的細菌Ⅰ類整合子靠近編碼多重抗藥性的外排泵系統(tǒng)czcA，而這個外排泵系統(tǒng)能夠外排Zn2+、Cd2+和Co2+等離子。Hayashi等[43]的研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥假單胞菌（Burkholderia cepacia）是具有多重耐藥性的菌株，其中B.cepacia KF1菌株不僅對多種β-內(nèi)酰胺類藥物具有抗性，而且對卡那霉素、紅霉素、四環(huán)素、新生霉素、利福平等也具有抗性。而B. cepacia KF1的這些抗性表型是由OprM和OprA的外排泵系統(tǒng)作用的結(jié)果。Hernanadez等[44]從煉油廠污染土壤中分離出兩種腸桿菌（Escherichia hermannii 和Enterobacter cloacae），發(fā)現(xiàn)這兩種菌在釩酸存在條件下，不僅能夠很好地蓄積重金屬，同時對更多抗生素產(chǎn)生抗性。原因可能是釩酸刺激了多重抗性表型，促進這些菌種中膜結(jié)合外流泵系統(tǒng)發(fā)揮作用，對其精確的機制尚需要進一步研究。

2.3細菌抗生素抗性與重金屬抗性的協(xié)同調(diào)控機制

協(xié)同調(diào)控是指細菌在抗生素或重金屬任何一種壓力下，細菌體內(nèi)的一系列轉(zhuǎn)錄和翻譯應(yīng)答系統(tǒng)均會對其作出反應(yīng)的作用過程（圖1）。例如細菌可通過雙組分系統(tǒng)進行協(xié)同調(diào)控，對環(huán)境變化作出應(yīng)答[45-49]。

為應(yīng)對不同的環(huán)境變化，細菌演化出多種細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，其中磷酸化和去磷酸化在生物體中廣泛存在，其過程由不同的激酶催化完成。幾乎所有的細胞都利用磷酸化介導的信號轉(zhuǎn)導機制來應(yīng)對代謝以及環(huán)境和細胞周期的變化[45]。雙組分系統(tǒng)在細菌、古生菌和真菌中均有發(fā)現(xiàn)，其在細菌中存在最為廣泛，參與對環(huán)境刺激作出反應(yīng)的多種信號轉(zhuǎn)導過程[46-49]。雙組分系統(tǒng)有多個“靶點”，如感應(yīng)外界刺激的位點、激酶自主磷酸化位點和反應(yīng)調(diào)控蛋白磷酸化位點等。雙組分系統(tǒng)能感應(yīng)不同環(huán)境刺激并作出應(yīng)答反應(yīng)。

重金屬污染的環(huán)境能夠觸發(fā)菌株中協(xié)同調(diào)控機制的運行，通過協(xié)同調(diào)控抗生素抗性基因的表達增強菌株對抗生素的耐受性。重金屬離子能夠協(xié)同調(diào)控抗生素抗性基因，進而降低菌株對抗生素的敏感度[50]。Harrison等[51]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌體內(nèi)SoxS蛋白就是AcrAB外排泵系統(tǒng)的調(diào)控子。在由CrO-7和Cu2+引起的細胞氧化應(yīng)激作用下，SoxS蛋白增加，使得AcrAB外排系統(tǒng)的表達增強，細菌對氯霉素、四環(huán)素、新生霉素、新青霉素Ⅲ等抗生素的耐受性增強。

綠膿假單胞菌（P.aeruginosa）中copRS和czcRS雙組分系統(tǒng)分別調(diào)控對Cu、Zn、Cd和Co的抗性，然而負調(diào)控OprD基因?qū)股禺a(chǎn)生抗性；用Cu處理該菌，czcRS雙組分系統(tǒng)操縱子和czcCBA操縱子的轉(zhuǎn)錄水平均提高，同時引起膜孔蛋白OprD減少，最終導致對亞胺培南產(chǎn)生抗性，即Cu激活copR，后者參與調(diào)控czcRS雙重組分系統(tǒng)，進而控制抗生素的進入和重金屬的排出[52]。微陣列分析恒溫培養(yǎng)下的大腸桿菌（E. coli MG1655）表明過量的Zn會使mdtABC操縱子上調(diào)，從而對新生霉素、脫氧膽酸鹽和Zn離子產(chǎn)生抗性[53]。隨后研究也表明，在過量的Zn條件壓力下，與環(huán)境和臨床相關(guān)的mtd系統(tǒng)會上調(diào)，大腸桿菌的質(zhì)?；騬obA（為DNA結(jié)合蛋白質(zhì)XylS-AraC的一員）的超表達分析表明這個基因增加了突變體的抗性譜，使得大腸桿菌對一系列不同的抗生素和金屬Ag、Cd等也產(chǎn)生抗性[54]。

除細菌的雙組分系統(tǒng)以外，細菌抗生素和重金屬的協(xié)同調(diào)控對菌群生物膜的形成也有重大影響。細菌生物膜被認為是工業(yè)、臨床和生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中細菌的主要生長表型（圖2），會導致一些在臨床上頑固的感染，包括綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌。生物膜表型的表達是細菌群體感應(yīng)的結(jié)果。細菌之間的空間狹小，為基因的橫向轉(zhuǎn)移提供了理想的環(huán)境。自然條件下，微生物以浮游和生物膜兩種生長狀態(tài)存在，形成生物膜的細菌對金屬和抗生素的耐受性遠遠高于浮游細菌。研究表明向浮游細菌中加入金屬或抗生素會刺激產(chǎn)生胞外多糖（EPS），導致細胞黏附，最終形成生物膜。刺激產(chǎn)生的胞外多糖對生物膜的形成和生物膜三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要的作用[50]。

圖2　菌群生物膜誘導作用圖示[55]Figure 2 Mechanisms induced by bacterial biofilm[55]

研究證實，發(fā)現(xiàn)古細菌、藍藻和假單胞菌在重金屬暴露下容易刺激EPS的產(chǎn)生。與未形成生物膜的浮游綠膿假單胞菌P.aeruginosa相比，形成生物膜的綠膿假胞單菌對Pb和Cu離子的耐受性分別提高了2倍和600倍[56]。因此，重金屬與抗生素的共調(diào)控和交叉抗性對生物膜生成機制的研究十分重要，如果細菌暴露于任何重金屬存在的環(huán)境中，將誘導生物膜的增長，同時導致細菌抗生素抗性的提高。

3　細菌抗生素抗性基因的其他影響因素

其他一些環(huán)境地球化學因素對抗性基因的影響不容忽視，例如包括溫度、pH值、溶解氧、離子（重金屬）、濁度、氮、磷、細菌總數(shù)在內(nèi)的水質(zhì)因子，以及光照和氧氣等因素。其中溫度、pH值、溶解氧、濁度、氮、磷及細菌總數(shù)代表了水環(huán)境水質(zhì)狀況，這些指標的變化將導致整體微生物的豐度與種群結(jié)構(gòu)的差異。Liao 等[57]對我國南部未開采的銅礦紅土中的微生物量、微生物呼吸作用、土壤基質(zhì)利用模型進行研究，結(jié)果表明土壤微生物群落在很大程度上受到重金屬的影響，在相對高濃度的重金屬污染環(huán)境下，微生物量和呼吸作用受到負面影響。研究還發(fā)現(xiàn)，兩個重要的微生物生理生化參數(shù)——微生物C/N比和代謝熵與重金屬壓力顯著相關(guān)，隨著重金屬濃度的升高，C/N比會明顯下降而代謝熵增加，唯一碳源利用模型多變量數(shù)據(jù)分析表明，重金屬的污染對微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能差異有重要影響[57]。微生物群落組成結(jié)構(gòu)是抗生素抗性基因產(chǎn)生和傳播的原因。有研究指出，土著菌本身群落結(jié)構(gòu)的不同和多樣性也會影響到它們自身對Cu污染的敏感性和抗性的不同。所以，菌群自身的差異就部分控制了Cu對它們的影響[58-59]。Novo等[60]的研究表明，在污水處理過程中，微生物群落結(jié)構(gòu)組成對四環(huán)素類抗生素的降解具有一定的影響，并且污水中四環(huán)素濃度與Epsilonproteobacteria具有正相關(guān)關(guān)系，與Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria和Firmicutes具有負相關(guān)關(guān)系。Forsberg等[61]就一系列農(nóng)業(yè)土壤和草地土壤對18種抗生素的抵抗力進行功能元基因組的篩選，發(fā)現(xiàn)土壤細菌很少擁有物種之間抗生素抗性基因交換的序列特征，認為土壤中細菌群落的組成結(jié)構(gòu)是促進抗生素抗性基因變化的重要因素。Tom-Petersen等[62]在不同的土壤條件下研究發(fā)現(xiàn)，Cu本身的生物有效性會有很大的差異，所以銅在不同的實驗中對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響是不同的[62]。不同的土壤組成成分會通過不同的物理化學反應(yīng)，例如吸附作用、絡(luò)合作用和沉淀作用等，影響到金屬離子的固定，除了微生物群落結(jié)構(gòu)差異的影響，土壤本身的條件也會影響抗生素抗性基因的傳播。鄭加玉等[63]研究表明，人工濕地處理3種四環(huán)素類抗生素抗性基因（tetM、tetO、tetW）的結(jié)果發(fā)現(xiàn)沸石濕地對3種抗生素抗性基因的去除效果好于火山巖濕地。腐殖土中抗生素抗性基因絕對含量高于紅壤土，說明腐殖土對抗生素抗性基因具有較好的累積能力，植物的存在減少了土壤中tetM和tetO累積量，但是增加了tetW累積量。

Sara等[64]對污水處理系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，在對四環(huán)素類抗生素藥物的去除過程中，溫度對其去除率的影響主要是通過影響微生物的活性實現(xiàn)的。溫度是微生物的一個重要生態(tài)因子，在最佳溫度范圍內(nèi)，微生物可以達到最大的生長速度和最佳的代謝效率，從而提高對四環(huán)素類抗生素的去除效率。四環(huán)素在不同體系pH值條件下會發(fā)生質(zhì)子化和去質(zhì)子化反應(yīng)，改變其在溶液中的存在形式而呈現(xiàn)不同價態(tài)的離子屬性，從而影響其在污水處理過程中與活性微生物之間的相互作用，進而影響其去除過程機制[65]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在污水廠中抗生素抗性基因的濃度有明顯的季節(jié)特征，冬季高于夏季[66]。原因不僅是冬夏兩季污水中收納的抗生素種類不同，更是因為兩季節(jié)污水中微生物的群落結(jié)構(gòu)組成不同。城市污水是一個多組分的復雜體系，往往含有多種抗生素和其他污染物質(zhì)，如重金屬、殺菌劑等，這些物質(zhì)的共同作用也會對細菌微生物產(chǎn)生共選擇效應(yīng)和交叉抗性作用[67]。重金屬濃度與抗生素抗性之間有著復雜的關(guān)系，重金屬和抗生素的交叉作用主要表現(xiàn)為協(xié)同抗性和抗性殺菌，濃度對交叉抗性組合的影響主要分為3種類型。在低濃度表現(xiàn)為協(xié)同抗性、高濃度表現(xiàn)為協(xié)同殺菌的抗性組合有Cr6+或Zn2+與紅霉素，Cu2+與頭孢拉定；在低濃度表現(xiàn)協(xié)同殺菌、高濃度表現(xiàn)為協(xié)同抗性的抗性組合有Cr6+或Zn2+與阿莫西林；菌體的抗生素抗性變化只與重金屬種類相關(guān)的抗性組合有Cu2+與四環(huán)素、阿莫西林或紅霉素，Cr6+與頭孢拉定[68]。

抗生素在自然環(huán)境中的殘留對抗生素抗性基因具有直接的選擇壓力。上述研究發(fā)現(xiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)對四環(huán)素類抗生素的降解和富集產(chǎn)生影響，且溫度通過影響環(huán)境中微生物的群落生長狀態(tài)對四環(huán)素類抗生素發(fā)揮重要的影響作用。另外，由于抗生素自身結(jié)構(gòu)性質(zhì)的不同，大多抗生素具有光降解特性。在強光照下會加速抗生素的降解，減少對相應(yīng)抗性的選擇性壓力，誘導產(chǎn)生的抗性基因也就相應(yīng)減少?？股毓饨到膺^程中受到pH、催化劑、初始濃度等因素的影響，研究發(fā)現(xiàn)鹽酸四環(huán)素的光催化降解與pH、TiO2投加量和四環(huán)素的初始濃度有關(guān)。改變影響因子會使多種抗生素的共同降解產(chǎn)生選擇性，例如四環(huán)素與磺胺甲惡唑共同降解時，堿性條件下會優(yōu)先降解四環(huán)素[69]。水環(huán)境和土壤環(huán)境中抗生素的降解情況不同，這與水環(huán)境和土壤環(huán)境中的光照、溫度、水分等條件差異有關(guān)，且與抗生素種類有關(guān)。在土壤環(huán)境中，Schlusener等[70]研究了大環(huán)內(nèi)脂類抗生素在土壤中的有氧生物降解，實驗結(jié)果表明紅霉素在土壤中的降解半衰期是20 d，而羅紅霉素在整個實驗過程中幾乎不降解。另有研究發(fā)現(xiàn)，水環(huán)境中氧氣是否充足對抗生素的降解也造成很大的影響，在可吸收礁湖肥料區(qū)域的地下水中測不到莫能菌素，表明莫能菌素在地表有氧層的降解比在無氧條件下快[71]。Pei等[72]在研究生物處理對廢水中抗生素抗性基因的作用時發(fā)現(xiàn)，厭氧和光照處理后，四環(huán)素類抗性基因tetO、tetW和磺胺類抗性基因sul1、sul2有明顯的降低趨勢。研究還發(fā)現(xiàn)，在好氧處理過程中，tetO基因在4℃時增長到豐度的最高值；在厭氧處理過程中，tetO基因在20℃時增長到濃度的最大值[72]。Toes等[73]對大腸桿菌中兩種Cu抗性基因copA和cusA的研究發(fā)現(xiàn)，前者在好氧與厭氧環(huán)境下低、中、高的Cu選擇壓力下都有表達，后者只在厭氧和好氧環(huán)境中的高濃度Cu選擇壓力下表達；然而，對奧奈達希瓦式菌（Shewanella oneidensis）的研究發(fā)現(xiàn)，在好氧和厭氧的環(huán)境中Cu的選擇壓力下會優(yōu)先引起cusA基因的表達。

綜上所述，自然環(huán)境中抗生素、抗生素抗性基因的影響因素往往不是單獨發(fā)揮作用。自然環(huán)境條件下的溫度、pH值、溶解氧、重金屬離子濃度對微生物群落組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，微生物群落組成結(jié)構(gòu)和自然光照條件對環(huán)境中抗生素的降解和富集產(chǎn)生影響，進而影響到環(huán)境中抗生素抗性基因的產(chǎn)生與傳播。于此同時，重金屬與抗生素的交叉污染對抗性基因的協(xié)同選擇與傳播產(chǎn)生復雜的綜合影響。

4　重金屬引起的細菌抗藥性未來研究展望

目前研究發(fā)現(xiàn)，在抗菌藥物的過度消費和抗藥細菌的頻繁檢出之間存在明顯的相關(guān)性。除了抗菌藥外，其他污染物也可能成為驅(qū)使環(huán)境中抗性基因的選擇性的重要因素。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中對含有毒金屬殺菌劑的使用，在食品行業(yè)和醫(yī)療領(lǐng)域含Hg和Ag的防腐劑、藥劑的廣泛使用，以及動物飼料中重金屬添加劑的添加都會造成重金屬污染物直接被吸收進入人體，并可能長期蓄積造成嚴重的健康危害，而且還能引起環(huán)境中細菌耐藥性水平總體升高，最終造成更大的健康危害。因此，開展微生物抗重金屬及抗生素抗性機制的研究，對于研究重金屬污染作為一種環(huán)境選擇壓力對病原微生物攜帶抗性基因的維持機制非常重要，對降低醫(yī)療領(lǐng)域抗生素耐藥性以及消除環(huán)境中的細菌耐藥性均具有重要意義。

目前對環(huán)境抗生素抗性的研究主要集中在抗性基因的定性、定量以及一些相應(yīng)抗性菌株的檢測等，大多數(shù)研究比較單一，缺乏整體性和系統(tǒng)性?，F(xiàn)實環(huán)境的污染情況卻日趨復雜，存在多種抗生素污染、抗生素-重金屬復合型污染等。因此，相關(guān)研究在考慮抗生素污染物的前提下，還應(yīng)該考慮復合型污染所帶來的環(huán)境效應(yīng)，在以后的研究中還需開展以下關(guān)于環(huán)境中抗性基因的研究：

開展抗生素抗性基因在環(huán)境中的傳播、擴散機制以及控制對策的研究。對抗性基因從污染源向地表水遷移、地下水滲漏以及在土壤介質(zhì)中的傳播規(guī)律應(yīng)予特別重視，同時應(yīng)對漁業(yè)、畜牧環(huán)境中抗生素抗性基因、重金屬抗性基因的傳播、擴散機制開展深入的研究，以期更加有效地遏制抗生素抗性基因在環(huán)境中的擴散。

開展環(huán)境中抗生素和重金屬的復合污染、多重抗性以及抗性基因組學的研究。許多抗生素抗性基因常與一些可移動遺傳元件相關(guān)聯(lián)，而這些元件往往還攜帶大量的其他種類的抗性基因，如重金屬抗性基因、抗殺蟲劑基因等，從而使微生物具有多重抗性，對環(huán)境和人類生活都造成更大的潛在危害。因此，需開展對各環(huán)境介質(zhì)中多重抗性的污染水平、抗性基因種類以及基因水平遷移規(guī)律的研究，評估其生態(tài)健康風險，為國家制定相關(guān)政策提供理論依據(jù)。

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Co-selection mechanisms of bacterial resistance to heavy metals and antibiotics

ZHANG Jia-qi1, XU Yan2, LUO Yi2, MAO Da-qing1*
（1.College of Environmental Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2.College of Environmental Science and Engineering, Ministry of Education Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Nankai University, Tianjin 300071, China）

Abstract：Excessive uses of antibiotics and increasingly serious pollution of heavy metals are continuously contributing to the emergence, persistence and transmission of antibiotic resistant genes（ARGs）in the environment. This paper summarized the latest research on antibiotic resistance and heavy metals resistance, and illustrated pollution status of ARGs and heavy-metal resistance genes and its coincidence mechanisms in bacteria in various environment. Bacteria were resistant not only to heavy metals, but also to multiple antibiotics in heavymetal contaminated environment. Heavy-metal stresses caused elevated abundance of ARGs in natural rivers, sewage plants and livestock farms. Under heavy metal stresses, bacteria obtained antibiotic resistance through（a）co-resistance mechanism, i.e. antibiotic and heavymetal resistance genes located on a same vector such as plasmids, integrons, and transposons;（b）cross-resistance mechanism such as efflux pumps taking effect when stimulated by heavy metals;（c）co-regulation mechanism, which relies on a two-component system and takes effect when stimulated by heavy metals. Finally, heavy metal stresses in the environment were promoting bacteria to obtain antibiotic resistance and to propagate ARGs among and in bacterial community. Nowadays, human beings are facing not only a serious pollution of antibiotics and heavy metals but a challenge of ARGs pollution.

Keywords：antibiotic resistance；heavy-metal resistance; co-selection resistance; co-selection resistance mechanism

*通信作者：毛大慶E-mail：mao@tju.edu.cn

作者簡介：張佳奇（1991—），男，湖北赤壁人，碩士生，研究方向為分子生態(tài)。E-mail：958759870@qq.com

基金項目：國家自然科學基金項目（31270542，41473085）

收稿日期：2015-10-13

中圖分類號：X503

文獻標志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）03-0409-10

doi:10.11654/jaes.2016.03.001