Nrf2在阿特拉津誘導(dǎo)小鼠心臟氧化應(yīng)激中的作用

陳俊宇，索　琪，黃連弟，黃歆梅，劉　劍*，劉金莎

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；4.吉林大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

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Nrf2在阿特拉津誘導(dǎo)小鼠心臟氧化應(yīng)激中的作用

陳俊宇1，2，索琪3，黃連弟2，黃歆梅4，劉劍3*，劉金莎1*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；4.吉林大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

摘要：目的觀察阿特拉津(ATR)處理后小鼠心臟組織中過氧化產(chǎn)物的含量及Nrf2信號(hào)通路的活化，探討ATR導(dǎo)致的心臟組織氧化應(yīng)激損傷及保護(hù)機(jī)制。方法以玉米油溶解ATR，將32只雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分為0 mg/kg、5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg ATR劑量組，灌胃處理28 d，于第29 d處死小鼠取心臟組織勻漿并提取總蛋白，生化和Western blot方法檢測(cè)心肌組織中過氧化產(chǎn)物含量、Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及抗氧化酶活性。結(jié)果ATR暴露小鼠心肌組織中NO、MDA含量增高；Nrf2及Keap1表達(dá)降低；Ⅱ相解毒酶表達(dá)增高；SOD、CAT、GSH-PX含量增加。結(jié)論ATR暴露可誘導(dǎo)小鼠心臟組織活性氧生成增多，Nrf2/ARE通路激活，通過上調(diào)Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶進(jìn)行抗氧化防御。

關(guān)鍵詞：阿特拉津；小鼠；心臟；氧化應(yīng)激；Nrf2

(ChinJLabDiagn,2016,20:0355)

阿特拉津(atrazine,ATR )是全球使用范圍最廣的除草劑之一，化學(xué)名為2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪，廣泛用于包括玉米，高粱，甘蔗等農(nóng)作物中控制雜草和禾本科植物[1,2]。在中國目前估計(jì)每年使用量已超過幾百萬公斤，并造成了嚴(yán)重污染。ATR具有生物蓄積作用，被美國環(huán)境保護(hù)機(jī)構(gòu)規(guī)定為可能的人類致癌物，同時(shí)被廣泛認(rèn)為是一種激素干擾物。最近幾年，關(guān)于ATR誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷的研究逐漸引起學(xué)者們的重視[3]。

目前，據(jù)報(bào)道在多種物種如鯽魚、大鼠等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ATR可以提高活性氧的濃度[4,5]。在肝臟、睪丸、附睪等多種組織中印證了ATR引起還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)濃度增高，抗氧化酶活性增高[6,7]，但是ATR對(duì)心臟組織是否能引起氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究比較少見。

本實(shí)驗(yàn)通過小鼠為期28天的ATR經(jīng)口給藥，檢測(cè)心臟組織勻漿的氧化應(yīng)激狀態(tài)和氧化酶活性，分析Nrf2通路的變化情況，探討ATR是否導(dǎo)致心臟組織的氧化應(yīng)激損傷及心臟自我保護(hù)的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物分組及處理

4周齡雌性BALB/C小鼠購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分4組，每組8只。ATR以玉米油溶解，對(duì)照組以玉米油灌胃，設(shè)低、中、高三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，ATR劑量分別為5 mg·kg-1、25 mg·kg-1

和125 mg·kg-1[8]，小鼠恒定溫度、恒定濕度飼養(yǎng)于該動(dòng)物中心，自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)周期28天，第29天腹主動(dòng)脈取血處死小鼠，立即取心臟組織。

1.2主要試劑及儀器

ATR購于美國sigma公司，純度為99%。NO、MDA、SOD、CAT、GSH-PX生化檢測(cè)試劑盒購于南京建成有限公司。Nrf2通路相關(guān)抗體購于美國Proteintech Group公司。羊抗兔IgG單克隆抗體及ECL試劑盒購于美國promega公司。其余試劑購于美國sigma公司。凝膠成像系統(tǒng)(2500R，中國Tanon)，電泳儀(AE-8800，美國Bio-rad)，分光光度計(jì)(VIS-7220，北京第二光學(xué)儀器廠)等儀器均為吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院前列腺疾病防治研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3生化法檢測(cè)GSH-PX、MDA的濃度及CAT、SOD、NO的活性

取心臟組織100 g加入1 ml PBS冰上研磨，制備10%心臟組織勻漿，bradford法測(cè)定蛋白濃度，-20℃保存。先后按試劑盒說明書檢測(cè)GSH-PX、MDA含量及CAT、SOD、NO活性。

1.4western blot方法檢測(cè)NQO1、Nrf2、HO1、KEAP1蛋白表達(dá)

研磨心臟組織(液氮中)，裂解蛋白，12 000 r離心40 min，上清為勻漿，定量后取30 μg，加緩沖液，99℃水浴，SDS-PAGE電泳分離蛋白，100 V轉(zhuǎn)膜1 h，封閉后TBST洗膜，封閉一抗、二抗，ECL發(fā)光法顯色拍照。β-actin為內(nèi)參，GIS凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白光密度值，計(jì)算相對(duì)光密度(A)值。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1NO、MDA含量增高

檢測(cè)心臟組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于對(duì)照組，低劑量組ATR(5mg/kg)的心臟組織勻漿中MDA水平增高，高劑量組ATR(125mg/kg)的心臟組織勻漿中NO增高(P<0.05)，MDA含量明顯增高(P<0.01)，提示ATR在小鼠心臟組織中誘導(dǎo)活性氧生成增加，見表1。

表1　心臟組織內(nèi)MDA及NO含量

*：與對(duì)照組相比P<0.05

2.2Nrf2及Keap1表達(dá)變化

本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步分析ATR誘導(dǎo)活性氧增加后心臟組織的保護(hù)性變化，通過western blot法檢測(cè)Keap1和Nrf2的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組 ATR處理后，5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg劑量組Nrf2的表達(dá)比對(duì)照組中降低，各實(shí)驗(yàn)組的Keap1的蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，如圖1。

*：與對(duì)照組相比P<0.05; **：與對(duì)照組相比P<0.01

2.3Ⅱ相解毒酶表達(dá)增高

為了探討Nrf2激活后Ⅱ相解毒酶的激活情況，我們檢測(cè)了心臟組織中HO1和NQO1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：相對(duì)于對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組中ATR處理后的心臟組織中HO1含量均增加，各劑量組NQO1的含量增加，以上均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，如圖2。

2.4SOD、CAT、GSH-PX活力變化

上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nrf2通路被激活，同樣為了探討心臟組織中抗氧化酶的活性，我們通過生化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組(5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg)SOD和GSH-PX均較對(duì)照組水平增高，其中25 mg/kg和125 mg/kg 劑量組SOD明顯增高，125 mg/kg劑量組CAT活力同樣增高(P<0.05)，見表2。

*：與對(duì)照組相比P<0.05

劑量(mg/kg)SOD(u/mgprot)CAT(u/mgprot)GSH-PX(u/mgprot)052512537.24±10.6857.89±12.8*69.14±5.10**62.87±9.9**3.41±1.805.39±2.648.54±0.649.33±1.35*88.24±21.07132.73±27.65*121.59±18.54*128.58±29.71*

*：與對(duì)照組相比P<0.05;**：與對(duì)照組相比P<0.01

3討論

ATR是在地表水和地下水中常見的污染物。事實(shí)上，農(nóng)業(yè)徑流和灌溉用水是ATR污染的主要來源[9]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，ATR具有神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)毒性、氧化應(yīng)激損傷及腫瘤促發(fā)作用[10-13]。最近幾年，ATR誘發(fā)多組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷已引起研究者們的重視。本實(shí)驗(yàn)ATR以每日灌胃的形式給藥4周齡雌性BALB/C鼠，以玉米油為對(duì)照組，以濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR為實(shí)驗(yàn)組，飼養(yǎng)28天后處死小鼠，分析小鼠心臟組織的活性氧濃度和抗氧化防御系統(tǒng)狀態(tài)。

高濃度的活性氧(reactive oxygen species,ROS)是破壞包括脂質(zhì)膜、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要介質(zhì)，稱之為氧化應(yīng)激損傷[14]。盡管細(xì)胞中存在抗氧化防御系統(tǒng)，可以抵消一定的ROS產(chǎn)生的氧化損傷，但在整個(gè)生命周期累積與氧自由基相關(guān)的DNA 、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的損傷在一些年齡依賴性疾病的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如癌癥，動(dòng)脈硬化，關(guān)節(jié)炎，神經(jīng)退行性疾病和其他疾病。為了探討ATR在體內(nèi)對(duì)卵巢組織的影響，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并分析了ATR劑量組和對(duì)照組中活性氧的水平。本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)了丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和一氧化氮(NO)。NO是主要的活性氧之一，MDA代表著細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，5 mg/kg 的ATR給藥28天后小鼠心臟組織勻漿中MDA水平增高，在125 mg/kg的高劑量ATR作用下NO含量增高，MDA含量明顯增高，說明ATR導(dǎo)致小鼠發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。

細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷的主要防御機(jī)制之一就是NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factors 2，Nrf2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。生理狀態(tài)下，Nrf2與接頭蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)相結(jié)合，使Nrf2被隔絕在細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)氧化應(yīng)激傳感器Keap1遇到活性氧后，Nrf2解離釋放[16]。Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，參與調(diào)控抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

本實(shí)驗(yàn)首先通過western blot檢測(cè)ATR作用28天后大鼠心臟組織中的Nrf2與Keap1蛋白含量，分析活性氧增多后，Nrf2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況。發(fā)現(xiàn)ATR處理后，5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg劑量組Nrf2的表達(dá)比對(duì)照組降低(P<0.05)，各實(shí)驗(yàn)組的Keap1的蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。說明ATR可影響Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控。

ARE的活化由Nrf2和Keap1緊密調(diào)控，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核后，結(jié)合于ARE位點(diǎn)，激活下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等細(xì)胞保護(hù)基因。Ⅱ相解毒酶的主要代表是血紅素氧合酶-l(hemeoxygenase 1，HO1) 和 NAD(P)H：苯醌氧化還原酶(NAD(P)H：quinone oxidoreductase l，NQOl) 。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同劑量的ATR均表現(xiàn)為誘導(dǎo)心臟組織HO1和NQO1含量增加，說明Nrf2活化后，Ⅱ相解毒酶的組織含量增加。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心臟組織的抗氧化酶含量同樣發(fā)現(xiàn)濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg 的ATR上調(diào)SOD和GSH-PX水平，125 mg/kg劑量組中心臟組織的CAT活力同樣增高，以上說明ATR誘導(dǎo)下通過Nrf2/ARE通路的活化，上調(diào)了抗氧化酶的表達(dá)。

綜上，ATR誘導(dǎo)小鼠心臟組織中活性氧生成增多，進(jìn)一步下調(diào)了Keap1的表達(dá)，激活了Nrf2/ ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與ARE位點(diǎn)結(jié)合，激活A(yù)RE下游的保護(hù)性基因，使Ⅱ相解毒酶HO1和NQOl表達(dá)上調(diào)，抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT的活力增加。本實(shí)驗(yàn)初步明確ATR作為心臟的氧化損傷因子，對(duì)心臟Nrf2/ARE抗氧化損傷防御系統(tǒng)具有強(qiáng)有力的誘導(dǎo)作用，為進(jìn)一步分析ATR對(duì)心臟的損傷機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4結(jié)論

BALB/C小鼠ATR連續(xù)給藥誘導(dǎo)心臟組織的活性氧生成增多，Nrf2/ARE通路被激活，通過Ⅱ相解毒酶HO1和NQOl及抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT表達(dá)上調(diào)進(jìn)行抗氧化防御。

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The role of Nrf2 in atrazine induced oxidant response of heart in mouse

CHENJun-yu,SUOQi,HUANGLian-di,etal.

(ClinicalCollageofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the contents of peroxidation product and the activation of Nrf2 signaling pathway in heart tissue of mouses treated by atrazine (ATR),and to evaluate the mechanism of ATR on heart tissue oxidative stress injury and its protection mechanism.Methods32 female BALB/C rats were randomly divided into 4 groups,treated by a daily gavage of 0 mg/kg (control group) and 5,25 and 125 mg/kg (experiment groups) atrazine dissolved in maize oil respectively for 28 days,and the animals were sacrificed on day 29.The heart tissues were collected to homogenize and isolate the total protein.Biochemical process and Western blot were employed to detect the contents of peroxidation product,the expressions of Nrf2 signaling pathways related proteins and the activation of antioxidase in the heart tissues.ResultsAfter treated by ATR,the content of NO and MDA were increased;Nrf2 and Keap1 were decreased;Ⅱ phase detoxifying enzymes was increased;SOD,CAT,GSH-PX were increased.ConclusionAfter treated by ATR,the reactive oxygen in heart tissue was increased, and the Nrf2/ARE signaling pathway was activated to resist the oxidation through up-regulating the expression of Ⅱ phase detoxifying enzymes and antioxidase

Key words:atrazine;mouse;heart;oxidative stress;Nrf2

(收稿日期：2015-10-19)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R992

文章編號(hào)：1007-4287(2016)03-0355-04

*通訊作者