高壓氧治療對(duì)于急性腦梗死患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4的表達(dá)及預(yù)后的影響

雷　蕾，周志斌，姜　丹，彭　軍

(武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢　430064)

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高壓氧治療對(duì)于急性腦梗死患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4的表達(dá)及預(yù)后的影響

雷蕾，周志斌，姜丹，彭軍

(武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢430064)

摘要：目的觀察高壓氧治療對(duì)于急性腦梗死患者外周血單核細(xì)胞(PBMCs) Toll樣受體4 (TLR-4)mRNA的表達(dá)及神經(jīng)功能康復(fù)的影響。方法入選58例腦梗死患者，隨機(jī)分為對(duì)照組和高壓氧治療組，兩組患者均予常規(guī)藥物治療，高壓氧治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上予以高壓氧治療。另入選25例健康體檢者為健康對(duì)照組(正常組)，高壓氧治療前、治療第5、10天分離兩組患者PBMCs，熒光定量RT-PCR法檢測(cè)TLR-4mRNA表達(dá)。高壓氧治療前、治療第5、10天及起病21 d患者隨訪進(jìn)行美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NIHSS)及日常生活能力(ADL)評(píng)分。結(jié)果腦梗死患者(對(duì)照組，高壓氧治療組)起病時(shí)外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA的表達(dá)均顯著高于正常組，治療后兩組患者外周血TLR-4mRNA表達(dá)均下降，高壓氧治療組顯著低于對(duì)照組。高壓氧治療組治療第10天及起病21 d后NIHSS評(píng)分均顯著低于對(duì)照組，ADL評(píng)分則高于對(duì)照組。結(jié)論高壓氧治療顯著降低急性腦梗死患者外周血TLR-4mRNA的表達(dá)，減輕腦損傷后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，改善預(yù)后。

關(guān)鍵詞:高壓氧；腦梗死；Toll樣受體4；神經(jīng)功能預(yù)后

Toll樣受體(Toll-like receptor ,TLR)是天然免疫中重要的病原體識(shí)別受體，可介導(dǎo)炎性因子的釋放和免疫細(xì)胞激活，進(jìn)而誘導(dǎo)獲得免疫[1]。作為T(mén)LR家族成員之一，TLR-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦梗死等非病原微生物性炎癥損傷過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用,其參與介導(dǎo)腦缺血炎性損傷，促進(jìn)腦缺血再灌注損害，而TLR-4基因缺失時(shí)則表現(xiàn)出對(duì)腦組織的保護(hù)作用[2]。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)治療則可有效減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性死亡[3-4]。本研究通過(guò)觀察急性腦梗死患者HBO治療前后外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)TLR-4mRNA的表達(dá)及神經(jīng)功能康復(fù)情況，進(jìn)一步探討其在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中的作用，為臨床治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇自2014年1月至2014年12月本院神經(jīng)內(nèi)科住院的診斷為急性腦梗死的患者58例,男35例,女23例,年齡(62.7±12.9)歲。均為初次發(fā)病,入院時(shí)間在起病72 h以內(nèi)。所有病例均符合1995 年全國(guó)第4 屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的腦梗死標(biāo)準(zhǔn)[5],均經(jīng)頭顱計(jì)算機(jī)體層掃描(computerized tomography,CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI) 檢查確診?；颊呔?jīng)詳細(xì)的神經(jīng)系統(tǒng)體檢及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查(心電圖、胸片、肝腎功能、凝血功能、血常規(guī)等)。排除標(biāo)準(zhǔn):明顯的肝腎功能障礙,感染或惡性疾病患者，肺大泡、氣胸、慢性阻塞性肺病患者，血壓超過(guò)180/110 mmHg的患者。將患者隨機(jī)分為對(duì)照組和高壓氧治療組(隨機(jī)數(shù)字表法)。本研究經(jīng)過(guò)武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均充分告知知情同意，并簽署知情同意書(shū)。兩組患者年齡、性別、吸煙、飲酒、血壓、血脂等危險(xiǎn)因素以及神經(jīng)功能評(píng)分、日常生活能力評(píng)分方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，另取25名健康體檢者為健康對(duì)照組。

1.2研究方法兩組患者均根據(jù)中國(guó)急性缺血性卒中診治指南2010[6]推薦行常規(guī)抗血小板聚集、腦保護(hù)、調(diào)脂、調(diào)控血壓對(duì)癥治療，高壓氧治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，入院后24 h內(nèi)予高壓氧治療。采用GY3200型多人氧艙，治療方案：加壓艙壓力取 0.1 MPa，采用間斷吸氧，階段性吸氧20 min×3，吸氧過(guò)程中休息5 min×2，連續(xù)治療10次為1個(gè)療程。高壓氧治療前、治療第5天，10 d分離其PBMCs，熒光定量RT-PCR法檢測(cè)TLR-4mRNA表達(dá)。治療前、治療第5天，10天及起病21 d對(duì)患者隨訪進(jìn)行美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分(the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)，采用Barthel指數(shù)(Barthel Index，BI)評(píng)分進(jìn)行日常生活能力(activities ofdaily living，ADL)評(píng)定。

1.3人外周血單核細(xì)胞的分離取清晨空腹外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞。PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞2次，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)示細(xì)胞存活率為98%，入Trizol中混勻，與血漿標(biāo)本分別置入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4熒光定量RT-PCR Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA。行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)體系為: cDNA 1 μL、2× SYBR Green PCR Master mix12.5 μL、上下游引物各100 nm、ddH2O 滅補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增的反應(yīng)條件: 95℃5 min, 94℃ 20 s,56℃ 20 s, 72℃ 20 s, 72℃ 5 min,55℃ 10 s,40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行融點(diǎn)曲線分析，于60～95℃之間進(jìn)行測(cè)定，(升溫幅度：0.5℃/次，5秒/次)。引物序列如下TLR-4：上游5’-acatcaaatgcccctactca-3’，下游5’-ctaaaccagccagaccttga-3’; β-actin：上游5’-cattaaggagaagctgtgct-3’,下游5’-gttgaaggtagtttcgtgga-3’。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值通過(guò)公式2-ΔΔCt分析計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組患者基線臨床資料比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩組患者年齡、性別構(gòu)成、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等危險(xiǎn)因素以及NIHSS評(píng)分、ADL評(píng)分方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常組比較，年齡、性別構(gòu)成差異無(wú)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1　各組患者一般臨床資料比較

注：高血壓：指需要治療的高血壓患者；糖尿病：需要治療(包括飲食控制)的胰島素依賴和非胰島素依賴的糖尿病患者。高脂血癥：根據(jù)本院實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷膽固醇或甘油三酯水平增高的患者。

2.2高壓氧治療對(duì)于患者外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA的表達(dá)的影響高壓氧治療前(0 d)，急性腦梗死患者(高壓氧組，對(duì)照組)外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA顯著高于正常組，高壓氧組第5天外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA較0 d下降。高壓氧治療第10天，高壓氧組，對(duì)照組外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA均較0 d下降，高壓氧治療組下降至基線水平(正常組)，顯著低于對(duì)照組(圖1)。

2.3各組患者治療前后NIHSS、ADL評(píng)分高壓氧治療組患者在高壓氧治療10 d及起病21 d后NIHSS評(píng)分及ADL評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組，并且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，改善愈明顯。但在治療第5天兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

圖1　各組患者外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA的表達(dá)

注：與健康對(duì)照組相比,*P<0.01，同時(shí)間與對(duì)照組相比,△P<0.01,與第5天對(duì)照組相比,§P<0.01。

表2　高壓氧組與對(duì)照組治療前后NIHSS、ADL評(píng)分比較

3討論

腦缺血再灌注導(dǎo)致的炎性反應(yīng)參與了腦損傷過(guò)程[7]，炎癥免疫反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。過(guò)度炎癥免疫是包括腦梗死在內(nèi)的多臟器缺血再灌注損傷等病理情況的共同標(biāo)志，而TLR-4在病原菌介導(dǎo)的炎癥及非感染性炎癥中均起著重要的作用。TLR-4在中樞神經(jīng)主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用， 損傷介質(zhì)主要來(lái)源于小膠質(zhì)細(xì)胞。腦組織發(fā)生缺血后，缺血血管、受損腦細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)可以釋放一些蛋白分子，如釋放熱休克蛋白、透明質(zhì)酸、防御素和彈性蛋白酶，這些內(nèi)源性激活物作為內(nèi)源性配體與 TLR4受體相互結(jié)合，通過(guò)MAPK/NF-κB和NF-κB/IRF3等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-113等多種炎性因子、趨化因子等"級(jí)聯(lián)式"釋放，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，參與介導(dǎo)并加重腦缺血炎性損傷[8-9]。

腦缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)研究表明，TLR-4缺陷小鼠腦缺血再灌注后的梗死體積較野生型小鼠顯著縮小。TLR-4基因小鼠的腦缺血后炎性反應(yīng)和腦損害有所減輕。Caso等[10]通過(guò)建立小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞動(dòng)物模型，研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比(野生小鼠)，TLR-4基因敲除小鼠腦梗死體積較小，炎癥反應(yīng)較輕，血清TNF-α和IL-6、干擾素調(diào)節(jié)因子1等炎性因子明顯降低，神經(jīng)功能及行為功能恢復(fù)結(jié)果較好，推論其發(fā)生的機(jī)制可能是由于TLR-4缺陷，導(dǎo)致其介導(dǎo)的炎性信號(hào)通路被阻斷或抑制，降低了免疫反應(yīng)和組織損害程度。Brea等[11]應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦梗死急性期患者外周血單核細(xì)胞TLR-4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與患者預(yù)后獨(dú)立相關(guān)，預(yù)后較差的患者TLR-4的表達(dá)顯著增高，同時(shí)其血清TNF-α、IL-1β、IL-6、 VCAM-1等炎性因子表達(dá)水平同步顯著增高，TLR-4表達(dá)與TNF-α、IL-1β、IL-6、 VCAM-1水平呈正相關(guān)。TLR-4表達(dá)與腦梗死體積獨(dú)立正相關(guān)。本研究亦表明急性腦梗死患者急性期外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA表達(dá)較健康對(duì)照組顯著增高。TLR-4mRNA增高的機(jī)制可能是腦梗死時(shí)腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增高及壞死物質(zhì)釋放，TLR-4啟動(dòng)免疫反應(yīng)，通過(guò)其信號(hào)通路引起TNF-α等炎性因子分泌增多，參與介導(dǎo)腦缺血炎性損傷。同時(shí)可吸引富含TLR-4表達(dá)的外源性的單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性趨化聚集，成為加劇炎性損傷的效應(yīng)細(xì)胞。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床觀察表明高壓氧治療在腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)方面發(fā)揮著積極作用，是治療缺血性腦血管病的一種有潛力的物理療法。但其作用機(jī)制尚未明確。其腦保護(hù)機(jī)制大致有如下幾點(diǎn)[12-13]：(1)提高血氧分壓與血氧含量，改善微循環(huán)，改善代謝，增加組織內(nèi)氧的彌散，迅速改善病灶供氧及代謝，減少酸性代謝物質(zhì)；(2)維護(hù)血腦屏障的完整性，降低血腦屏障通透性減少血液中水分向組織滲透，減輕組織水腫，降低顱內(nèi)壓；(3)抑制興奮性氨基酸毒性作用，及抑制海馬一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA 的表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡；(4)清除腦組織自由基，加強(qiáng)組織抗氧化能力，減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)；(5)降低血液黏滯度，減輕血小板的聚集，有利于缺氧腦區(qū)血液循環(huán)的恢復(fù)。

本研究表明，雖然在高壓氧治療第5天，高壓氧治療組與對(duì)照組兩組NIHSS評(píng)分及ADL評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在高壓氧治療第10天及起病21 d后，高壓氧治療組患者NIHSS評(píng)分及ADL評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組，并且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，改善愈明顯。表明高壓氧治療可有效改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后。同時(shí)高壓氧治療組顯著抑制患者外周血單核細(xì)胞TLR-4mRNA表達(dá)的增高，治療10 d時(shí)基本恢復(fù)至基線水平。徐江等[14]研究表明高壓氧治療可顯著抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織NF-κB 的活性和 ICAM-1 的表達(dá)的增高，減少腦梗死的體積。本研究表明高壓氧治療可抑制腦梗死患者外周血TLR-4的表達(dá)，而TLR-4位于NF-κB等炎性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的上游，這可能是其高壓氧治療減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機(jī)制之一。

總之，本研究表明高壓氧治療可通過(guò)抑制TLR-4的表達(dá)，減輕腦損傷后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)缺血性腦血管病患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，改善預(yù)后。

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Effects of hyperbaric oxygen on the rehabilitation of nervous function and expression of Toll-like receptor4 mRNA on peripheral blood mononuclear cells in patients with acute cerebral infarction

LEI Lei, ZHOU Zhi-bin, JIANG Dan, et al

(DepartmentofNeurology,TianyouHospitalAffiliatedtoWuhanUniversityofTechnology,Wuhan,Hubei430064,China)

Abstract:Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygen(HBO) on the rehabilitation of nervous function and expression of Toll-like receptor4(TLR-4)mRNA on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in serum in patients with acute cerebral infarction.Methods The 58 patients with acute cerebral infarction were randomized into control group and HBO group. All patients were undergoing conventional medical treatment, and HBO group also received HBO therapy. In addition, 25 health controls were included. The expression of TLR-4 mRNA on PBMCs from 80 patients were measured by real time quantitative RT-PCR before and on the 5th ,10th day of HBO treatment. The National Institutes of Health stroke scale(NIHSS) and the Barthel index(BI) were also used for evaluation before and on the 5th，10th day of HBO treatment，and 21st day after onset.ResultsThe expression of TLR-4 on PBMCs in patients with acute cerebral infarction was significantly increased compared to health controls (P< 0.01) on the onset. After treatment, it declined, and HBO group was significantly lower than control group.On the 10th day of treatment，and 21st day after onset，in HBO group，NIHSS scores were significantly lower while BI scores were significantly higher than control group(P< 0.01) . Conclusions The expression of TLR-4 mRNA on PBMCs of acute cerebral patients can be significantly depressed by HBO therapy, which decreases inflammatory reaction secondary to cerebral injury, promotes rehabilitation of nervous function and improves the outcome.

Key words:hyperbaric oxygen；cerebral infarction；Toll-like receptor4；nervous function；outcome

(收稿日期：2015-08-17，修回日期：2015-11-21)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.026