水飛薊賓對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠保護作用的研究

張秀俠

(武安市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科，河北 邯鄲　056300)

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水飛薊賓對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠保護作用的研究

張秀俠

(武安市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科，河北 邯鄲056300)

摘要：目的研究水飛薊賓(SIL)對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，并探討其可能的作用機制。方法取112只清潔級雄性大鼠隨機分為6組：假手術組、模型對照組、水飛薊賓(100、200和400 mg·kg(-1))預處理組和尼莫地平(32 mg·kg(-1))預處理組，通過中動脈線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。再灌注6 h后，進行神經(jīng)功能評分，分析測定腦組織梗死體積及含水量；通過蘇木精-尹紅(HE)染色法觀察腦組織形態(tài)學變化；測定血清中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量及總抗氧化能力(T-AOC)水平；測定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量；通過TUNEL染色觀察神經(jīng)細胞凋亡狀況并計算凋亡指數(shù)(AI)，通過Western blot方法測定腦組織中NF-κB蛋白表達并進行半定量分析。結果與模型組相比，水飛薊賓(200和400 mg·kg(-1))預處理組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低、腦梗死體積和含水量均顯著降低，腦組織病理形態(tài)學變化及神經(jīng)細胞凋亡均明顯減輕，凋亡指數(shù)顯著降低；腦組織中SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低；血清中CPK，LDH含量顯著降低；腦組織中NF-κB蛋白表達量顯著降低；水分薊賓400 mg·kg(-1)預處理組血清中T-AOC水平顯著升高；差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。結論水分薊賓對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用，其作用機制可能與水分薊賓能夠改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中抗氧化酶活性、抑制氧化應激損傷有關。

關鍵詞：水分薊賓；腦缺血再灌注；大鼠；保護

水飛薊賓(Silibinin，SIL)是菊科植物水飛薊的主要活性成分之一，屬于水飛薊素的一種，具有抗氧化、抗腫瘤、抑制炎癥反應、抗纖維化、促進細胞再生和促進脂代謝等廣泛的藥理學作用[1-4]。王利平等[5]研究發(fā)現(xiàn)水分薊賓對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，本研究通過中動脈線栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，研究水分薊賓對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。

1材料與方法

1.1試驗藥物與試劑水飛薊賓膠囊(天津天士力制藥股份有限公司，藥品規(guī)格：每粒35 mg，批號：20140517)；尼莫地平片(德國拜耳公司，批號：BJ05004，規(guī)格：每片30 mg)；磷酸肌酸激酶(CPK)、乳鼠脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒；蘇木精—尹紅(HE)染色試劑盒、末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；核轉錄因子-kB(NF-κB)單克隆抗體購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物SPF級雄性SD大鼠，240～280 g，購自河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，室溫23～25℃、相對濕度60%～70%、光照周期12 h:12 h環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.3主要儀器BS300型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；UV-1200 紫外-可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；24D臺式高速離心機(深圳市賽泰克生物科技有限公司)；FA25勻漿機(上海洽姆儀器科技有限公司)；DYY-11 型多用電泳儀(北京六一儀器廠)；JY-SCZ2電泳槽(北京六一儀器廠)；RM-2135型切片機(德國Leica公司)；倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組及模型制備取112只實驗用清潔級雄性SD大鼠隨機分為：假手術組、模型對照組、水飛薊賓(100、200和400 mg·kg-1)預處理組和尼莫地平(32 mg·kg-1)預處理組；水分薊賓各預處理組和尼莫地平預處理組均于手術前7 d開始灌胃給藥，每天1次，假手術組和模型對照組分別給予等體積的生理鹽水。除假手術組外，其余各組大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛實施麻醉后，參照Longa等[6]報道的試驗方法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型；假手術組行手術通路，除不插入栓線外，其余操作同手術組。

1.4.2神經(jīng)功能評分再灌注6 h后，行盲法評分：置地上，向缺血對側轉圈，計1分；提鼠尾，對側前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內旋，分別計1、2、3分；對側推動時阻力下降，據(jù)下降程度計1～3分；置金屬網(wǎng)上，據(jù)對側肌張力下降程度計1～3分。

1.4.3梗死體積(IV%)的測定再灌注6 h后，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和腦干后沿冠狀做5個切片，置于1% TTC染色液中，于37℃水浴環(huán)境中避光孵育30 min后，正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈蒼白色；用圖像分析軟件Imagepro Plus 6.0分析梗死體積百分比。

1.4.4含水量的測定再灌注6 h后，參照“1.4.3”的方法取大腦組織，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干后稱重，為濕重；置于110℃恒溫干燥箱中烘烤48 h后稱重，為干重，然后計算腦組織含水量：

腦含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%

1.4.5腦組織形態(tài)學改變的觀察再灌注6 h后，參照“1.4.3”的方法取大腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)和展片處理后，行常規(guī)HE染色，然后在光學顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學變化。

1.4.6腦組織中SOD、CAT活性和MDA含量的檢測再灌注6 h后，參照“1.4.3”的方法取大腦組織，于冰上剪碎后加入適量冷裂解液后進行研磨勻漿，3 000 rpm離心10 min后取上清液，通過紫外—可見分光光度計測定腦組織中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.7血清中CPK、LDH含量和T-AOC水平的檢測再灌注6 h后，腹腔注射10%水合氯醛實施麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，經(jīng)2 000 rpm離心5 min后取血清，然后通過全自動生化檢測儀測定各組大鼠血清中CPK、LDH含量及T-AOC水平。

1.4.8神經(jīng)細胞凋亡的觀察及凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)的計算取“1.4.5”所制備的腦組織石蠟切片，按照檢測試劑盒方法步驟行TUNEL染色(黃褐色為陽性著色)，于光學顯微鏡下觀察神經(jīng)細胞凋亡狀況；每張染色切片選取6個視野，計數(shù)視野內細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，取平均值，然后計算各組大鼠神經(jīng)細胞AI：

AI=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%

1.4.9NF-κB蛋白表達的檢測及半定量分析取“1.4.6”制備的腦組織勻漿上清液，，BCA法進行蛋白定量，變性后上樣、電泳：待溴酚藍接近膠底部時停止、轉膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4℃過夜；洗膜，二抗室溫搖床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

2結果

2.1各組大鼠神經(jīng)癥狀評分的變化較假手術組，模型組大鼠神經(jīng)癥狀評分顯著升高；經(jīng)水分薊賓(200、400 mg·kg-1)預處理后，局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01、0.05)，結果見表1。

2.2各組大鼠腦組織梗死體積和含水量的變化較假手術組，模型組大鼠腦組織梗死體積和含水量顯著升高；經(jīng)水分薊賓(200、400 mg·kg-1)預處理后，局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織梗死體積和含水量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01、0.05)，結果見表1。

±s,n=16)

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01。2.3各組大鼠腦組織結構形態(tài)學變化假手術組大鼠腦組織結構未見異常，而模型組大鼠缺血側腦組織出現(xiàn)明顯水腫，神經(jīng)元呈空泡狀，胞漿疏松、胞質染色不均，胞核固縮、深染等病理性形態(tài)學改變；經(jīng)水分薊賓預處理后，缺血區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學改變明顯減輕，其中以400 mg·kg-1預處理組效果最為顯著，結果見圖1。

圖1　各組大鼠腦組織形態(tài)學變化(HE×400)

注：A-假手術組；B-模型組；C-水分薊賓100 mg·kg-1組；D-水分薊賓200 mg·kg-1組；E-水分薊賓400 mg·kg-1組；F-尼莫地平32 mg·kg-1組。

2.4各組大鼠腦組織SOD、CAT活性和MDA含量的變化較假手術組，模型組大鼠腦組織中SOD、CAT活性均顯著降低且MDA含量顯著升高；而經(jīng)水分薊賓(200、400 mg·kg-1)預處理后，局灶性腦缺血再灌注組大鼠腦組織SOD、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01、0.05)，結果見表2。

表2各組大鼠腦組織中SOD、CAT活性

組別劑量/mg·kg-1SOD/U·mgprot-1CAT/U·mgprot-1MDA/nmol·mgprot-1假手術組—15.8±3.64.4±1.65.0±1.2模型組—7.4±2.9**2.5±1.0**7.1±1.6**水分薊賓組1008.3±3.52.7±1.26.8±1.720010.9±3.4△3.4±1.3△5.6±1.4△△40012.7±3.7△△4.0±1.7△△5.2±1.2△△尼莫地平組329.6±3.1△2.9±1.25.5±1.5△△

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01。

2.5各組大鼠血清中CPK、LDH含量及T-AOC水平的變化較假手術組，模型組大鼠血清中CPK、LDH含量顯著上升而T-AOC水平顯著降低；經(jīng)水分薊賓(200、400 mg·kg-1)預處理后，局灶性腦缺血再灌注組大鼠血清中CPK和LDH含量顯著降低，T-AOC水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，結果見表3。

表3各組大鼠血清中CPK、

組別劑量/mg·kg-1CPK/U·L-1LDH/U·L-1T-AOC/U·L-1假手術組—162.3±14.1179.6±18.315.9±3.4模型組—357.5±32.8**365.7±31.5**7.6±2.5**水分薊賓組100316.7±30.2320.3±29.68.3±2.9200264.8±27.5△281.4±26.8△9.8±3.1△400225.6±24.7△△253.2±22.9△△12.1±3.5△△尼莫地平組32270.1±26.3△276.5±27.1△9.2±2.8

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01。

2.6各組大鼠神經(jīng)元凋亡狀況及凋亡指數(shù)(AI)假手術大鼠腦組織僅存在極少量的凋亡神經(jīng)元，模型組大鼠神經(jīng)元凋亡狀況明顯加重，而水分薊賓預處理組大鼠神經(jīng)元凋亡狀況較模型組明顯較輕，其中以400 mg·kg-1預處理組效果最為顯著，結果見圖2。比較各組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)較假手術組顯著升高；而水分薊賓(200、400 mg·kg-1)預處理組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01、0.05)，結果見表4。

2.7各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達的變化通過Western blot檢測并進行半定量分析發(fā)現(xiàn)：模型對照組NF-κB蛋白表達量較假手術組顯著增高(P<0.01)；經(jīng)水分薊賓(200、400 mg·kg-1)預處理后，局灶性腦缺血再灌注組大鼠腦組織中NF-κB蛋白表達量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，結果見圖3和表5。

圖2　各組大鼠神經(jīng)元凋亡狀況(TUNEL×400)

注：A-假手術組；B-模型組；C-水分薊賓100 mg·kg-1組；D-水分薊賓200 mg·kg-1組；E-水分薊賓400 mg·kg-1組；F-尼莫地平32 mg·kg-1組。

組別劑量/mg·kg-1AI/%假手術組—2.8±1.0模型組—40.5±5.2**水分薊賓組10034.2±4.920026.3±4.1△40017.8±3.5△△尼莫地平組3227.1±3.9△△

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01。

圖3　各組大鼠腦組織中NF-κB蛋白表達

注：A-假手術組；B-模型組；C-水分薊賓100 mg·kg-1組；D-水分薊賓200 mg·kg-1組；E-水分薊賓400 mg·kg-1組；F-尼莫地平32 mg·kg-1組。

組別劑量/mg·kg-1NF-κB/β-actin假手術組—0.15±0.04模型組—0.43±0.12**水分薊賓組1000.39±0.132000.33±0.08△4000.26±0.07△△尼莫地平組320.29±0.09△

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01。

3討論

隨著飲食結構及生活習慣的改變，尤其是人口老齡化的加劇，缺血性腦血管病的發(fā)病率有逐年上升，嚴重危害著人類的生命健康，目前臨床上主要采用及時溶栓恢復血流再灌注的治療方法，但往往引起腦組織損傷加重的現(xiàn)象，即“再灌注損傷”[8]，其病理生理機制尚未完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，血流再灌注后抗氧化酶活性受到抑制、氧自由基大量生成與過剩，導致機體廣泛的氧化應激損傷，是腦缺血再灌注損傷重要的病理基礎。

水飛薊賓(Silibinin，SIL)是菊科植物水飛薊的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抑制炎癥反應、抗纖維化、促進細胞再生和促進脂代謝等藥理學作用[1-4]。本實驗通過中動脈線栓法復制局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型進行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)水分薊賓預處理后，能夠顯著改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能障礙，降低腦組織含水量，改善腦組織病變，抑制神經(jīng)元凋亡，縮小梗死灶，提示水分薊賓對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用。

綜上所述，水分薊賓對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用，其作用機制可能與水分薊賓能夠有效改善抗氧化酶活性、提高機體清除自由基能力、抑制氧化應激損傷有關。

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Protective effects of Silibinin on the rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury

ZHANG Xiu-xia

(DepartmentofNeurology,Wu’anFirstPeople’sHospital,Handan,Hebei056300,China)

Abstract:Objective To investigate the protective effects of Silibinin (SIL) on the rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods 112 rats were randomized into 6 groups:sham operation group,model control group,SIL 100,200 and 400 mg·kg(-1) treatment groups and Nimodipine (32 mg·kg(-1)) treatment group; focal cerebral ischemia-reperfusion rat models were made by Zea-Longa occluding suture. 6h after reperfusion,the neurological deficits,ratio of infarct volume,water content of the brain were evaluated; the histopathological changes and neurocyte apoptosis were observed,and the AI was determined. The content of CPK,LDH and the level of T-AOC in serum were determined; the activity of SOD,CAT and the content of MDA in brain tissue were determined; the expression of NF-κB protein was detected by Western blot and semi-quantitative analysis.Results Compared with model control group,the neurological scores of SIL (200 and 400 mg·kg(-1)) pre-treatment groups were significantly decreased,and the ratio of infarct volume and brain water were significantly decreased; the histopathological changes and neurocyte apoptosis of SI pre-treatment groups were significantly improved and the AI was significantly decreased; the activity of SOD,CAT in brain tissue were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased,the content of CPK,LDH in serum were significantly decreased,the expression of NF-κB protein was significantly down-regulated(P<0.05,P<0.01),and the level of T-AOC in SIL 400 mg·kg(-1) pre-treatment group was significantly increased.Conclusions SIL had protective effects on the rats with focal cerebral ischemic-reperfusion injury,which was perhaps related with its pharmacological effects of enhancing the activity of antioxidant enzymes and depressing the oxidative stress injury.

Key words:silibinin;ischemic-reperfusion;rat;protection

(收稿日期：2015-11-05，修回日期：2015-12-24)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.010

基金項目：河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃(No 20130359)