ABCC2基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的建立及鑒定

魏丹蕓，張　洪，彭　銳，張　英

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢　430060)

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ABCC2基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的建立及鑒定

魏丹蕓，張洪，彭銳，張英

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430060)

摘要：目的構(gòu)建攜帶ABCC2基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ABCC2基因的細(xì)胞株并進(jìn)行鑒定，為體外實(shí)驗(yàn)確定與多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)外排轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的底物藥物及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供細(xì)胞模型。方法根據(jù)GenBank提供的ABCC2基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增該基因并將其連接至慢病毒載體PZE-LV105,包裝病毒并感染HEK293細(xì)胞。用嘌呤霉素進(jìn)行篩選得到過(guò)表達(dá)ABCC2基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過(guò)基因測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTQ-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果測(cè)序結(jié)果證明重組慢病毒過(guò)表達(dá)載體所攜帶的ABCC2基因序列與GenBank提供的ABCC2序列一致；RTQ-PCR分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了ABCC2基因的HEK293細(xì)胞中MRP2 的mRNA相對(duì)表達(dá)比正常HEK293細(xì)胞和空白載體對(duì)照HEK293細(xì)胞高出約320倍；蛋白免疫印跡試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染了ABCC2基因的HEK293細(xì)胞中MRP2蛋白表達(dá)水平比正常HEK293細(xì)胞和空白載體對(duì)照HEK293細(xì)胞高出約150倍。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ABCC2基因的細(xì)胞株，該細(xì)胞株可用于初步篩選確定MRP2的特異性外排轉(zhuǎn)運(yùn)底物及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

關(guān)鍵詞：ABCC2基因；過(guò)表達(dá)；慢病毒載體；HEK293細(xì)胞

ABCC2基因編碼的蛋白質(zhì)是一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，一般稱(chēng)作ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)。該蛋白主要分布在肝臟、膽囊、腎臟、小腸和結(jié)腸等組織細(xì)胞[1]，負(fù)責(zé)外排轉(zhuǎn)運(yùn)特異性底物，尤其在很多治療性藥物和有毒性外源性物質(zhì)的膽汁排泄中發(fā)揮重要作用[2-4]。雖然ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物化合物廣泛，但其在不同的底物化合物轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用的大小卻不盡相同，因此，該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白很可能與底物藥物的藥效和不良反應(yīng)等高度相關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有一些研究通過(guò)比較正常小鼠和ABCC2缺陷小鼠對(duì)一些藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)活性來(lái)確定ABCC2蛋白的特異性底物及其對(duì)藥物應(yīng)用的影響[5-6]，然而，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ABCC2的細(xì)胞株不僅可以直觀(guān)地定量該蛋白表達(dá)水平，研究該蛋白的功能活性，減少科研成本，還可以一定程度上排除體內(nèi)其他相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的干擾。除此之外，構(gòu)建目的基因表達(dá)沉默的重組細(xì)胞也可以從另一方面反映目的蛋白的作用。因此，本研究通過(guò)分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ABCC2的HEK293細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究確定與多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)外排轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的底物藥物及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)工具。

1材料與方法

1.1細(xì)胞HEK293細(xì)胞(購(gòu)自萊德?tīng)柹锟萍加邢薰?；293Ta 慢病毒包裝細(xì)胞系(GeneCopoeia Cat No. Clv-PK-01)；GCI-L3 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(GeneCopoeia Cat No. STK300-10)；H1299 細(xì)胞系(ATCC Cat No.CRL-5803)。

1.2試劑PRM1640和DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司，Cat.No.SH30087.01)；0.25%胰酶-0.125%EDTA(Gibco公司)；青鏈霉素(Hyclone，Cat.No. SH30010)；PBS磷酸鉀緩沖液(Hyclone，Cat.No.SH30256.01B)；嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific Inc公司，貨號(hào)A1113802)；各種限制性?xún)?nèi)切酶和T4 DNA連接酶(購(gòu)自GeneCopoeia公司)；Premix Prime STARHSR試劑盒、Neasy Mini Kit試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自北京全式金生物公司)；HET高效轉(zhuǎn)染試劑盒(深圳百恩維生物科技有限公司，貨號(hào)：BW11002)；SYBR Primescript RT-PCR Kit(購(gòu)自大連Takara 公司)；引物合成及測(cè)序(由GeneCopoeia公司完成)；慢病毒載體PEZ-LV105(購(gòu)自GeneCopoeia公司，Cat.No.EX-Q0603-Lv105)；ABCC2抗體(購(gòu)自英國(guó)ABCAM公司)；二抗Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP (Southern biotech 貨號(hào)：6170-05 )；Polybrene(Sigma公司產(chǎn)品，Cat. No. H9268)；其它化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試劑為分析純。

1.3儀器單人超凈臺(tái)(AIRTECH)；CB150CoZ細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus)；電泳儀(Power Pac Basic，美國(guó)Bio-Rad公司)；高速離心機(jī)(Thermo Frescozl)；Thermo落地式培養(yǎng)搖床Forma 481(美國(guó)Thermo公司)；Odyssey infrared imaging system Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR)；定量PCR儀(ABI PRISM 7500 Sequence Detection System)；DU730核酸/蛋白分析儀(美國(guó)BECKMANCOULTER)；Positive clone 測(cè)序(Genecopoeia)。

1.4重組慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.4.1PCR擴(kuò)增人ABCC2基因根據(jù)NCBI基因庫(kù)中提供的人類(lèi)ABCC2基因序列(ACCESSION NO. ：NM_000392)并遵照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物。用于復(fù)制目的基因的PCR上游引物序列F： CTCGAG atgctggagaagttctgcaactc(大寫(xiě)字母代表XhoⅠ 酶切位點(diǎn))，下游引物序列R： TTCGAActagaattttgtgctgttcacattc(大寫(xiě)字母代表NSPⅤ 酶切位點(diǎn))。用于檢測(cè)目的基因表達(dá)的RTQ-PCR上游引物序列F：CCGTATCAGGTTTGCCAGTT，下游引物序列R：TGGAGGTGATCCAGGAAAAG。實(shí)驗(yàn)中作為內(nèi)參的β-actin 的上游引物是:5'-ACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3'，下游引物是：5'-CATGTCGTCCCAGTTGGTG-3'，引物均由GeneCopoeia公司合成。常規(guī)方法提取正常HEK239細(xì)胞中總RNA，配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，以cDNA為模板，依照Premix Prime STARHSR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR擴(kuò)增體系溶液，PCR反應(yīng)條件為98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物行1 %瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收RT-PCR產(chǎn)物。

1.4.2PEZ-ABCC2-LV105載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定用XhoⅠ和NSPⅤ 限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)ABCC2擴(kuò)增產(chǎn)物及PEZ-LV105質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，酶切得到的產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，用In-Fusion?HD EcoDryTmCloning Kit 做In-fusion連接反應(yīng)，將反應(yīng)體系置于37°C孵育15 min，然后50°C孵育15 min，然后置于冰上，使外源DNA片段和質(zhì)粒載體進(jìn)行連接。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌GCI-L3，涂含氨芐霉素抗性平板，挑取克隆，搖菌過(guò)夜，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒用XhoⅠ 和NSPⅤ 限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切初步鑒定后，由GeneCopoeia公司測(cè)序驗(yàn)證，篩選出所需的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒命名為PEZ-ABCC2-LV105。

1.4.3重組慢病毒的包裝與轉(zhuǎn)染復(fù)蘇293Ta細(xì)胞，在24孔板中以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種，以DMEM和胎牛血清(FBS)配制完全培養(yǎng)液(89%DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素)。用慢病毒載體對(duì)應(yīng)的慢病毒包裝試劑盒將PEZ-ABCC2-LV105和包裝載體共轉(zhuǎn)染至293Ta細(xì)胞中。在細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱中孵育48 h后吸取上清培養(yǎng)液，用0.45 μm 的低蛋白結(jié)合PES過(guò)濾膜過(guò)濾該培養(yǎng)基收集病毒上清。檢測(cè)病毒滴度，分裝后在-80℃冰箱保存，待用時(shí)取出融化。將人胚胎腎細(xì)胞HEK293接種于96孔板，24 h后加入包裝好的重組慢病毒，再過(guò)24 h加0.25 mg·L-1的嘌呤霉素培養(yǎng)基于每孔，壓力篩選1周，中間換液1次。1周后倒置顯微鏡下觀(guān)察，細(xì)胞培養(yǎng)板上圈出每一個(gè)細(xì)胞群，標(biāo)記，用0.25%胰酶消化畫(huà)圈的細(xì)胞群，每一團(tuán)細(xì)胞收集到新的24孔板的一個(gè)孔培養(yǎng)，繼續(xù)用0.25 mg·L-1的嘌呤霉素壓力篩選1周，做亞克隆篩選。再用倒置顯微鏡下觀(guān)察，挑選出正常生長(zhǎng)細(xì)胞群傳代，用0.20 mg·L-1的嘌呤霉素維持1個(gè)月穩(wěn)定培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞株。將沒(méi)有插入ABCC2基因片段的載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后得到的細(xì)胞作為空白載體對(duì)照。

1.5ABCC2過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的鑒定

1.5.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ABCC2 mRNA分別在6孔板中接種HEK293正常細(xì)胞、空白載體對(duì)照細(xì)胞和ABCC2過(guò)表達(dá)細(xì)胞，每孔約2×105個(gè)細(xì)胞。24 h后分別提取各自細(xì)胞組的總RNA，取1 μL RNA樣品50倍稀釋?zhuān)贐ioPhotometer plus 艾本德核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，說(shuō)明制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。用Primescript RT-PCR Kit將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。取三種細(xì)胞的cDNA 各5 μL，以之為模板進(jìn)行Q-PCR，檢測(cè)ABCC2 mRNA的表達(dá)量變化，確認(rèn)ABCC2過(guò)表達(dá)細(xì)胞株。

1.5.2Western blotting檢測(cè)MRP2蛋白的表達(dá)水平分別在6孔板中接種HEK293正常細(xì)胞、空白載體對(duì)照細(xì)胞和ABCC2過(guò)表達(dá)細(xì)胞，每孔約2×105個(gè)細(xì)胞，24 h后收集各組的細(xì)胞，分別加入RIPA裂解，并用BCA蛋白試劑盒測(cè)定樣品蛋白含量。將提取好樣品的蛋白溶液和上樣緩沖液按2∶1混合，煮沸5 min。冷卻后以12 000 rpm離心10 min(4℃)。然后在10% SDS-PAGE上電泳分離，80 V恒壓50 min，120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部止，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用時(shí)120 min，電壓100 mA。分別用一抗兔抗鼠ABCC2(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)于4℃孵育過(guò)夜，封閉1 h，再于羊抗兔二抗中避光孵育1 h，TBST洗膜后，在奧德賽雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

2結(jié)果

2.1重組慢病毒質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105的鑒定RT-PCR擴(kuò)增ABCC2基因開(kāi)放讀碼框ORF序列，目的片段大小為4 638 bp，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳在分子量為4 000～5 000 bp處出現(xiàn)清晰可見(jiàn)單一條帶，與目的片段大小相符(圖1)。用內(nèi)切酶Xho Ⅰ 和NSP Ⅴ 對(duì)重組慢病毒質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105進(jìn)行雙酶切處理后，1% 瓊脂糖凝膠電泳分析處理得到的產(chǎn)物，在分子量4 000～5 000 bp與目的片段相同位置和約8 000 bp(空載體PEZ-LV105大小8 745 bp)的位置分別出現(xiàn)單一條帶，符合預(yù)期結(jié)果(圖2)。PEZ-ABCC2-LV105經(jīng)雙酶切得到的目的片段經(jīng)堿基測(cè)序與ABCC2 NM_000392.3序列完全一致，表明已成功構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105。

圖1PCR擴(kuò)增ABCC2基因電泳結(jié)果

注：1.Maker；2.ABCC2基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2PEZ-ABCC2-LV105重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定目的片段

注：1.Maker；2.PEZ-LV105質(zhì)粒；3.PEZ-ABCC2-LV105質(zhì)粒。

2.2重組質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105的mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)分別從HEK293正常細(xì)胞、空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和重組ABCC2過(guò)表達(dá)細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)RT-PCR以GAPDH為內(nèi)參測(cè)定ABCC2 mRNA在各細(xì)胞中的表達(dá)水平。將正常HEK293細(xì)胞的ABCC2基因表達(dá)量作為對(duì)照，數(shù)值設(shè)為1，轉(zhuǎn)染了PEZ-ABCC2-LV105重組質(zhì)粒的細(xì)胞中ABCC2 mRNA的表達(dá)量比正常組高出約320倍，P<0.01，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞

注：與正常HEK293細(xì)胞相比，*P<0.01；與空白載體對(duì)照細(xì)胞比較，#P<0.01。

2.3Western blot檢測(cè)ABCC2蛋白表達(dá)水平以GAPDH蛋白為內(nèi)參，檢測(cè)HEK293正常細(xì)胞、空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和重組ABCC2過(guò)表達(dá)細(xì)胞中ABCC2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了ABCC2基因的HEK 293細(xì)胞中ABCC2蛋白表達(dá)量相對(duì)于正常HEK293細(xì)胞顯著增高(見(jiàn)圖4a)。經(jīng)歸一化處理后，灰度分析結(jié)果見(jiàn)圖4b。

圖4　Western blot檢測(cè)各組

注：與正常HEK293細(xì)胞相比，*P<0.01；與空白載體對(duì)照細(xì)胞比較，#P<0.01；1.正常HEK293細(xì)胞；2.轉(zhuǎn)染空載體PEZ-LV105的HEK293 細(xì)胞；3.轉(zhuǎn)染PEZ-ABCC2-LV105重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞。

3討論

多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)家族是參與多相有機(jī)離子運(yùn)輸?shù)闹饕狝TP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一[7]。雖然目前該蛋白家族為人所知的MRP1-9都被證實(shí)具有相似的蛋白序列、結(jié)構(gòu)、功能和底物[8]，但是因?yàn)镸RP2與藥物的吸收、分布和消除更為緊密相關(guān)，而且在抗癌藥物耐藥性產(chǎn)生中也扮演了重要的角色[9]，所以研究其在細(xì)胞中的定位、表達(dá)和功能以及它和底物藥物相互作用的機(jī)制對(duì)今后底物藥物的個(gè)體化應(yīng)用具有重要意義。

上述實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)ABCC2的重組細(xì)胞，大大提高了原本在正常細(xì)胞中表達(dá)量很低的MRP2蛋白，為體外研究ABCC2的功能、底物特異性和外排轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等提供有效的實(shí)驗(yàn)手段。在構(gòu)建重組細(xì)胞過(guò)程中最關(guān)鍵的步驟是構(gòu)建重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。因?yàn)槟康幕騉RF片段有4 638 bp，連接到慢病毒載體PEZ-LV105后形成12 677 bp的重組質(zhì)粒，這已屬于分子過(guò)大的質(zhì)粒，不僅轉(zhuǎn)染困難，而且還可能會(huì)影響標(biāo)記基因的表達(dá)[10]，因此沒(méi)有再在載體質(zhì)粒上連接標(biāo)記綠色熒光蛋白基因，但是獲得的重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293后，通過(guò)一定濃度嘌呤霉素的篩選和單克隆，輔以堿基測(cè)序、RTQ-PCR和Western blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)的檢測(cè)驗(yàn)證，依然可以確定穩(wěn)定重組ABCC2過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的成功構(gòu)建。

目前，國(guó)內(nèi)外均有應(yīng)用此種技術(shù)研究ABCC2對(duì)某些特定藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響[11-13]，以此進(jìn)一步確定其與藥物臨床治療效果(或毒性)的關(guān)聯(lián)。但是轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞多用昆蟲(chóng)細(xì)胞(Sf9)或者犬腎細(xì)胞(MDCK)，考慮到ABCC2可能在不同物種組織細(xì)胞中表達(dá)水平和功能的差異性[14]，本實(shí)驗(yàn)選擇了人胚腎細(xì)胞(HEK293)。成功構(gòu)建的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ABCC2基因的細(xì)胞株將應(yīng)用到今后體外篩選確定MRP2的特異性外排轉(zhuǎn)運(yùn)底物及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等研究中。

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Construction and identification of the recombinant cell line over-expressing ABCC2 gene

WEI Dan-yun,ZHANG Hong,PENG Rui,et al

(DepartmentofPharmacy,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan，Hubei430060,China)

Abstract:Objective To construct the lentiviral vecter carrying human ABCC2 gene,then to screen out the stable cell line over-expressing ABCC2 after package and transfection to HEK293 cells,thus to provide cell model to determine substrate drugs of multidrug resistance protein 2(MRP2) in vitro.Methods The primers were designed according to the cDNA sequence of ABCC2 gene from GenBank. The gene were amplified by PCR and connected to lentiviral vector PEZ-LV105. The recombined lentiviral vector was packaged and transfected to HEK293 cells. After puromycin screening,HEK293 cells over-expressing human ABCC2 gene were selected and cloned. Finally,gene sequencing，real-time quantitative PCR(RTQ-PCR)and Western blot assays were performed for identification.Results RTQ-PCR showed that the ABCC2 mRNA in HEK293 cells transfected with exogenous ABCC2 gene was about 320 times higher than that of normal HEK293 cells and blank carrier HEK293 cells. MRP2 protein level in HEK293 cells with ABCC2 gene transfection was nearly 150 times higher than that of normal HEK293 cells and blank carrier HEK293 cells according to the Western blot.Conclusions Stable recombinant cell line over-expressing ABCC2 was successfully generated. The cell line could be useful in the confirmation of substrate drugs of multidrug resistance protein 2(MRP2)and the transport mechanism in vitro.

Key words:ABCC2 gene;over-expression;lentiviral vector;HEK293 cell

(收稿日期：2015-10-09，修回日期：2015-11-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.007

作者簡(jiǎn)介：魏丹蕓，女，碩士研究生通信作者：張洪，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病藥物的藥劑學(xué)和藥理學(xué)，E-mail:zhanghongwhu@163.com