2-甲氧基雌二醇對惡性黑素瘤種植性腫瘤的體內抑制作用

胡彩霞,江紹乾,張國強,馮　佳,田　菲,高順強*(.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 0500;.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院消化內科，河北 石家莊 05008;.河北省邢臺市人民醫(yī)院皮膚科,河北 邢臺 054000)

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·論著·

2-甲氧基雌二醇對惡性黑素瘤種植性腫瘤的體內抑制作用

胡彩霞1,江紹乾1,張國強1,馮佳2,田菲3,高順強1*(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 050011;2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院消化內科，河北 石家莊 050082;3.河北省邢臺市人民醫(yī)院皮膚科,河北 邢臺 054000)

[摘要]目的探討2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)對惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)細胞在小鼠體內生長的抑制作用。方法應用噻唑藍[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]方法檢測2-ME對黑素瘤B16細胞的抑制作用。構建BALB/c小鼠的惡性黑素瘤細胞種植性腫瘤模型，分為3組，每組6只。治療組(2-ME組)每只小鼠尾靜脈注射50 mg/ kg 2-ME，陽性藥物組[環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)組]每只小鼠尾靜脈注射20 mg/kg CTX，陰性對照組(Nacl組)注射相同體積的生理鹽水， 2 d/次，共14 d，每3 d測量腫瘤體積，實驗結束后稱量腫瘤質量；免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)方法對腫瘤組織Gadd45b和C-myc蛋白的表達變化進行分析，HE染色對治療組和陰性對照組小鼠的腫瘤組織、肺組織、肝組織和脾組織進行形態(tài)分析。結果2-ME對黑素瘤B16細胞具有明顯的抑制作用，且對B16細胞的抑制作用呈時間和劑量依賴性。CTX組和2-ME組腫瘤體積和腫瘤質量均小于Nacl組(P<0.01)，但CTX組與2-ME組之間腫瘤體積和腫瘤質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IHC實驗結果表明，與對照組相比，2-ME組小鼠腫瘤組織中C-myc蛋白表達水平明顯升高，Gadd45b蛋白表達水平明顯降低。HE染色結果顯示，2-ME組小鼠和對照組小鼠的肝及脾均無明顯的組織形態(tài)改變，而3/6的對照組小鼠發(fā)生肺組織轉移，2-ME組肺臟無明顯改變。結論2-ME對黑素瘤B16荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用，其機制可能與調節(jié)C-myc和Gadd45b基因表達有關。

[關鍵詞]痣和黑素瘤；雌二醇；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.011

惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)惡性程度高，具備高侵襲性及增殖能力，腫瘤細胞易發(fā)生淋巴及血行轉移且預后差。MM占全部腫瘤患者的2%左右，占皮膚惡性腫瘤的第3位，其發(fā)病年增長率為3%～5%[1]。李薇薇等[2]研究1983—2010年70例皮膚黑素瘤，近10年病例占87.1%，近5年占70%?？梢娫谥袊谒亓霭l(fā)病率呈增長趨勢。2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是一種甾體激素類化合物，為17β-雌二醇非極性的內源性代謝產物，本實驗前期研究結果顯示2-ME體外對惡性黑素瘤B16細胞具有明顯的生長抑制作用，并且2-ME可誘導黑素瘤細胞發(fā)生凋亡[3]。為進一步研究2-ME在體內對黑素瘤細胞的作用，本研究選擇2-ME行小鼠體內抑瘤實驗，以期探索將2-ME作為黑素瘤治療藥物的可能。

1材料與方法

1.1實驗動物BALB/c型小鼠18只，5～6周齡，20～22 g，均為雌性，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[生產許可證編號：SCXK(京)2012-0001]，在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)(在無特異病原菌級條件下飼養(yǎng))。本研究均經醫(yī)院動物管理使用委員會和倫理委員會批準。

1.2實驗材料2-ME產自美國Cayman公司(貨號13021，批號0433445-9，純度≥95%)；胎牛血清產自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI 1640和胰蛋白酶產自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)產自天津市永大化學試劑開發(fā)中心；Gadd45b、C-myc抗體購自美國bioworld公司；噻唑藍[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]產自美國Sigma公司； SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3細胞培養(yǎng)小鼠黑素瘤B16細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶消化細胞傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4實驗方法

1.4.1細胞活力檢測應用MTT法測定2-ME對細胞增殖的抑制作用，設置陰性對照組(僅有單細胞懸液)和實驗組，陰性對照組加入等體積的含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基，實驗組使2-ME終濃度分別為10、20、40 μmol/L并做標記，培養(yǎng) 24、48、72 h后用酶標儀于波長 570 nm 處測定吸光度(optical delnsity，OD)值，抑制率 CI(%)=(1-試驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4.2小鼠種植性腫瘤模型的建立、干預及標本處理于BALB/c型小鼠右肩胛皮下注射處于對數(shù)生長期的B16細胞0.2 mL(含2×105細胞)，當腫瘤體積增長到約0.1 cm3時，將小鼠隨機分為3組，每組6只。治療組(2-ME組)每只小鼠尾靜脈注射2-ME(50 mg/kg)，陽性藥物組[環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)組]每只小鼠尾靜脈注射CTX(20 mg/kg)，陰性對照組(Nacl組)小鼠注射相同體積的生理鹽水，2 d/次，共14 d。觀察腫瘤的生長情況，按公式計算腫瘤體積=(1/2×長×寬2)。22 d后處死小鼠并稱量瘤體質量。

1.4.3免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)檢測細胞蛋白將2-ME組及0.9%生理鹽水組小鼠腫瘤制成石蠟切片，按鏈霉菌抗生素蛋白過氧化物酶鏈接法(strptavidin-perosidase,SP)免疫組織化學試劑盒說明書所述方法檢測C-myc、Gadd45b蛋白的表達情況。C-myc、Gadd45b抗體按 1∶100 稀釋，生物素化山羊抗兔二抗和辣根過氧物酶標記的鏈酶卵白素(三抗)為試劑盒中的原液。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑顯色后，終止顯色，用蘇木精染色，分化及中性樹膠封片，光鏡下觀察結果。

1.4.4HE染色檢測細胞形態(tài)變化將2-ME組及0.9%生理鹽水組小鼠腫瘤組織、肝、肺和脾組織制成石蠟切片，封片后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.5統(tǒng)計學方法應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗、q檢驗和重復測量設計資料的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.12-ME對惡性黑素瘤B16細胞增殖的抑制作用以10、20、40 μmol/L濃度的2-ME處理 B16 細胞作為實驗組，與陰性對照組在24、48、72 h的OD值進行比較。結果表明：不同濃度的2-ME對黑色素瘤B16細胞的增殖的抑制作用差異有統(tǒng)計學意義(F=920.783，P< 0.05)；在培養(yǎng)24、48、72 h后2-ME對黑色素瘤B16細胞的增殖的抑制作用存在差異，具有統(tǒng)計學意義(F=6 245.727，P< 0.05)；藥物濃度和培養(yǎng)時間之間存在交互作用(F=1 199.587，P< 0.05)。

2.22-ME體內抑制腫瘤的形成與Nacl組相比，2-ME能夠明顯抑制腫瘤細胞在體內的生長。腫瘤細胞接種7 d后，Nacl組小鼠的腫瘤體積開始增加，生長速度較快，而2-ME組及CTX組小鼠腫瘤體積增長緩慢。實驗結束后，CTX組和2-ME組腫瘤體積和腫瘤質量均小于Nacl組(P<0.01)，但CTX組與2-ME組之間腫瘤體積和腫瘤質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表13組腫瘤體積和腫瘤質量比較

Table 1Comparisons of average volume and weight of

tumor tissue among three groups

組別腫瘤體積(cm3)腫瘤質量(mg)Nacl組 2.931±0.308 0.812±0.110 CTX組 1.209±0.301*0.343±0.048*2-ME組0.971±0.063*0.302±0.042*F73.63960.203P0.0000.000

*P<0.05與Nacl組比較(q檢驗)

2.32-ME體內調控Gadd45b和C-myc蛋白的表達對2-ME組和Nacl組荷瘤小鼠腫瘤組織進行免疫組織化學染色。C-myc蛋白陽性染色定位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀分布。Gadd45b蛋白陽性染色定位于細胞漿，呈棕黃色顆粒分布。Nacl組Gadd45b在腫瘤細胞中無或微量表達，2-ME組Gadd45b在腫瘤細胞中大量表達，Nacl組C-myc在腫瘤細胞大量表達，部分呈彌漫性強染色，2-ME組C-myc在腫瘤細胞中微量表達。與Nacl組相比，2-ME有降低 C-myc蛋白表達水平，升高 Gadd45b蛋白表達水平的趨勢。見圖1。

2.42-ME對小鼠肝、肺、脾及腫瘤組織形態(tài)的影響對2-ME組和Nacl組荷瘤小鼠的肝、肺、脾組織及腫瘤組織進行HE染色。結果顯示：2-ME組腫瘤組織的瘤細胞密度較稀，間質較多，可見壞死、凋亡的細胞，含色素顆粒細胞較Nacl組明顯增多，小鼠肝、肺及脾組織結構清晰，染色均一；與2-ME組相比，Nacl組可見數(shù)量多且排列緊密體積較大的瘤細胞，細胞核異型性明顯，部分腫瘤細胞呈巢狀排列，小鼠的肝及脾組織未見明顯的組織病理學改變，而Nacl組3/6肺組織中出現(xiàn)少量轉移灶。表明2-ME對小鼠可能沒有潛在的毒性，且能抑制黑素瘤的轉移。見圖2。

3討論

2-ME是一種甾體激素類化合物，為17β-雌二醇非極性的內源性代謝產物。后者是存在人類體內的天然雌激素，在細胞色素p450酶的作用下，17β-雌二醇被羥基化成為2-脫氫雌二醇，進一步被兒茶酚胺氧位甲基轉移酶甲基化形成 2-ME。大量的體內外實驗結果顯示2-ME具有多種生物學功能[4-5]。目前的研究結果顯示，其抗腫瘤的作用機制包括：①調控低氧誘導因子1和抑制血管生成，2-ME的抗血管新生機制除直接作用于內皮細胞誘導其凋亡、抑制其增殖外, 還與其對腫瘤細胞分泌的促血管新生因子的影響有關；②抑制微管蛋白聚合；③抑制有絲分裂和誘導凋亡；④可以減少超氧化物歧化酶活性，發(fā)揮抗腫瘤作用。并且2-ME在多種荷瘤動物模型實驗中表現(xiàn)出顯著的抑制腫瘤生長的作用，其中包括 Meth-A 肉瘤、非雌激素依賴的( MDA-MB-435)乳腺癌、宮頸癌多發(fā)性骨髓瘤和HCT-116裸鼠的移植瘤模型[6]。在小鼠的乳腺癌動物模型中，2-ME體內抗腫瘤活性被加以評估，用2-ME每天100 mg/kg聯(lián)合環(huán)磷酰胺腹膜途徑給藥，持續(xù)21 d，結果抑瘤率達82%[7]。但迄今為止，國內外2-ME對MM體內外抑瘤效果的研究報道很少。

本研究結果顯示：在2-ME藥物治療組的小鼠MM瘤體的平均質量和體積較Nacl組瘤體明顯減小，差異均有統(tǒng)計學意義，表明2-ME能夠抑制小鼠黑色素移植瘤的生長；2-ME處理組小鼠肝、脾、肺組織結構清晰，染色均一，而Nacl組3/6出現(xiàn)了肺組織的轉移，這說明2-M對小鼠可能不存在潛在的毒性作用，且可抑制MM的轉移。

人類C-myc為原癌基因，定位于第8染色體q24上，其結構包括3個外顯子和2個內含子，該基因表達的蛋白定位于細胞核內，是細胞增殖、分化和凋亡的重要調節(jié)因子[8]。由于C-myc具有促進細胞增殖和抑制分化的作用，C-myc的異常表達有促使細胞惡性轉化的潛能。既往的研究中發(fā)現(xiàn)，C-myc蛋白在多種人類癌癥細胞中都存在過度的表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[9]。本研究結果顯示，與Nacl組相比，2-ME處理組的蛋白表達水平明顯下降。提示2-ME能夠通過降低C-myc的表達水平達到抑制腫瘤細胞的增殖的目的。具體的調控機制仍不明確，需進一步實驗研究驗證。

Gadd45b屬于生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45基因家族，該基因家族是在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉歸過程中新發(fā)現(xiàn)的基因家族，屬于抑癌基因p53和BRCA1的下游靶基因。其基因編碼的蛋白是抑制細胞生長和細胞凋亡過程中的重要介導者, 具有調控細胞的增生、監(jiān)測細胞周期、誘導細胞凋亡、調節(jié)控制細胞的負性生長等DNA損傷修復途徑相關的功能[10]。Gadd45b表達或功能異常導致p53介導的DNA損傷修復途徑異?；蜃钄?，而既往研究表明p53蛋白分布與黑素瘤病理學類型、病理分級和分期、淋巴結轉移以及預后相關[11]，而且Gadd45b參與了NF-κB和C-Jun氨基末端激酶之間的通路, 它通過抑制JNK通路抑制細胞凋亡[12]。 本研究結果發(fā)現(xiàn)Gadd45b表達水平在應用2-ME后較Nacl組有明顯升高，進而使Gadd45b發(fā)揮其抑制細胞增殖的作用，促使癌細胞凋亡。

綜上所述，2-ME對小鼠黑素瘤種植性腫瘤的治療有效，并且Gadd45b及C-myc基因在腫瘤形成的過程中發(fā)揮了重要作用，但其具體作用機制尚不明確，需要進一步探討，以便盡早為MM的治療提供新的治療思路和方法。(本文圖見封三)

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(本文編輯：劉斯靜)

Inhibition effects of 2-methoxyestradiol on melanoma xenograft tumor in vivo

HU Cai-xia1, JIANG Shao-qian1, ZHANG Guo-qiang1,FENG Jia2, TIAN Fei3, GAO Shun-qiang1*

(1.Department of Dermatology, the Forth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang050011， China； 2.Department of Gastroenterology, the Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082， China；3.Department of Dermatology, the People，s Hospital of Xingtai City, Hebei Province， Xingtai 054000， China)

[Abstract]ObjectiveTo study the inhibition effects of 2-methoxyestradiol(2-ME) on malignant melanoma(MM) cells in BALB/c mice xenograft tumor.MethodsThe inhibition effects of 2-ME on MM cells were measured by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT). Building BALB/c mice xenograft tumor model, BALB/c mice were divided into three groups with six mice in each group. Treatment group and negative control group were treated with 2-ME(50 mg/kg) and equally volume normal saline respectively every two days, for a 14-days duration and calculated the average volume every three days. Positive drug group were treated with CTX(20 mg/kg). After experiment ended, the tumor weight were calculated. The expression levels of C-myc and Gadd45b in tumor were detected by immunohistochemical. Morphological changes of tumor tissue, lung, liver and spleen tissues were observed by HE staining. Results2-ME had obvious inhibitory effect on melanoma cells and the inhibitory effect in a dose-time dependent manner. Compared with the Nacl group, the volume and weight of tumor tissues in CTX group and 2-ME group were reduced remarkably(P<0.01), but there was no statistical signifieance between the CTX group and the 2-ME group(P>0.05). Comparing to control group, the expression levels of C-myc were decreased, while Gadd45b were increased. No obvious morphological changes were found in liver and spleen tissues in treatment group and in control group, but there were lung metastasis in 3 of 6 mice. Conclusion2-ME had inhibitory effect on BALB/c mice xenograft tumor, and the mechanism may be related to modulating gadd45b and C-myc genes expression.

[Key words]nevi and melanomas; estradiol; mice

[中圖分類號]R739.5

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0289-05

[作者簡介]河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20130252) 胡彩霞(1982-),女,河北衡水人,河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院主治醫(yī)師,醫(yī)學碩士,從事黑素瘤診治及激光美容研究。*通訊作者。E-mail:gshunqiang@medmail.com.cn

[收稿日期]2015-07-02；[修回日期]2015-09-25