AKT基因沉默對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖及Fas、Fas L、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

劉曼，胡明英，王曉莉，李敏

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261041；2濰坊市人民醫(yī)院；3嘉祥縣人民醫(yī)院)

?

AKT基因沉默對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖及Fas、Fas L、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

劉曼1，胡明英2，王曉莉1，李敏3

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261041；2濰坊市人民醫(yī)院；3嘉祥縣人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)基因沉默對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3增殖及細(xì)胞中Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、空白載體組與實(shí)驗(yàn)組。空白載體組加入脂質(zhì)體、不轉(zhuǎn)染AKT siRNA，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染AKT siRNA，對(duì)照組不給予任何干預(yù)措施。轉(zhuǎn)染24 h后觀察各組細(xì)胞增殖情況，采用免疫熒光雙重標(biāo)記法檢測(cè)各組細(xì)胞中的Fas、FasL、Caspase-3蛋白。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度低于對(duì)照組、空白載體組，且細(xì)胞突起減少，胞體折光性減弱，細(xì)胞變圓離壁。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度為27.31%±1.22%，空白載體組、對(duì)照組分別為89.56%±2.17%、92.01%±3.22%，實(shí)驗(yàn)組與空白載體組、對(duì)照組相比，P均<0.05；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為31.17%±1.38%，空白載體組、對(duì)照組增殖率分別為183.77%±4.22%、181.56%±3.77%，實(shí)驗(yàn)組與空白載體組、對(duì)照組相比，P均<0.01。實(shí)驗(yàn)組Fas、FasL、Caspase-3蛋白陽性表達(dá)率分別為18.62%±0.78%、85.69%±1.34%、74.22%±2.11%，空白載體組分別為14.01%±0.12%、58.67%±1.33%、43.24%±1.02%，對(duì)照組分別為16.06%±0.03%、32.77%±1.07%、38.01%±0.92%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Caspase-3、FasL蛋白陽性表達(dá)率與空白載體組、對(duì)照組相比，P均<0.05。結(jié)論 AKT基因沉默后，SKOV3細(xì)胞增殖受到抑制，且細(xì)胞中FasL、Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)。

關(guān)鍵詞：卵巢癌；SKOV3細(xì)胞；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；Fas蛋白；FasL蛋白；RNA干擾技術(shù)

目前卵巢癌的治療以手術(shù)、化療、放療為主，但療效不理想，5年生存率在25%~30%[1]。RNA干擾(RNAi)技術(shù)通過短雙鏈RNA(dsRNA)特異降解靶基因從而阻斷靶基因表達(dá)，在腫瘤治療方面有很好的應(yīng)用前景[2]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號(hào)通路是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化調(diào)節(jié)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3，4]。2013年10月~2014年9月，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成AKT基因的靶向siRNA，觀察AKT基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)的影響，為卵巢癌的基因治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，McCoy5A培養(yǎng)基(北京博潤(rùn)萊特公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(Trypsin，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)，正常山羊血清工作液(北京中杉金橋公司)，TritonX-100(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗小鼠Fas單克隆抗體(武漢博士德生物公司)，小鼠抗山羊FasL單克隆抗體(武漢博士德生物公司)，小鼠抗山羊Caspase-3單克隆抗體(武漢博士德生物公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組SKOV3細(xì)胞體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清、90%的Mc-coy5A、青霉素100 μL/mL、鏈霉素100 μL/mL的培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。將細(xì)胞懸液以5×104/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞融合80%~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為對(duì)照組、空白載體組、實(shí)驗(yàn)組。

1.3AKT siRNA的制備及轉(zhuǎn)染化學(xué)合成靶向AKT的siRNA序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)與合成。AKT siRNA按說明書稀釋配置。實(shí)驗(yàn)組加入AKT siRNA 與Lipofectamin2000混合液500 μL；對(duì)照組加入Mc-coy5A培養(yǎng)液500 μL；空白載體組加入只含Lipofectamin2000的Mc-coy5A培養(yǎng)液500 μL。各組轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4細(xì)胞增殖觀察取各組已爬好片的24孔板，通過去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，激光共聚顯微鏡拍照。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取10個(gè)視野，激光共聚顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均值。用公式計(jì)算細(xì)胞密度及細(xì)胞增殖率：細(xì)胞密度=單位面積平均細(xì)胞數(shù)；細(xì)胞增殖率=單位面積平均細(xì)胞數(shù)/單位面積接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5SKOV3細(xì)胞中Fas、FasL、Caspase-3蛋白檢測(cè)取爬好片的24孔板，去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，含0.1%TritonX-100的PBS透膜30 min，PBS沖洗3次，進(jìn)口山羊血清封閉液37 ℃下封閉30 min；棄封閉液，添加一抗(分別為兔抗Fas的一抗、小鼠抗FasL的一抗、小鼠抗活性Caspase-3的一抗)，4 ℃冰箱過夜；次日取出，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，分別避光滴加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠及FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次；DAPI封片，正置熒光顯微鏡拍照。計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，0為陰性(-)、<25%為弱陽性(+)、25%~75%為中陽性(++)、>75%為強(qiáng)陽性(+++)。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖情況比較對(duì)照組、空白載體組細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞突起明顯，胞體折光度好。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞突起減少，胞體折光性減弱，細(xì)胞變圓離壁。見圖1。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度為27.31%±1.22%,空白載體組、對(duì)照組分別為89.56%±2.17%、92.01%±3.22%，實(shí)驗(yàn)組與空白載體組、對(duì)照組相比，P均<0.05；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為31.17%±1.38%，空白載體組、對(duì)照組增殖率分別為183.77%±4.22%、181.56%±3.77%，實(shí)驗(yàn)組與空白載體組、對(duì)照組相比，P均<0.01。

注：A為對(duì)照組；B為空白載體組；C為實(shí)驗(yàn)組。

圖1各組細(xì)胞增殖情況

2.2各組細(xì)胞中Caspase-3、Fas、FasL蛋白表達(dá)比較實(shí)驗(yàn)組Fas、FasL、Caspase-3蛋白陽性表達(dá)率分別為18.62%±0.78%、85.69%±1.34%、74.22%±2.11%，空白載體組分別為14.01%±0.12%、58.67%±1.33%、43.24%±1.02%，對(duì)照組分別為16.06%±0.03%、32.77%±1.07%、38.01%±0.92%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Caspase-3、FasL蛋白陽性表達(dá)率與空白載體組、對(duì)照組相比，P均<0.05。

3討論

PI3K/AKT信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在正常組織中PI3K/AKT信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，但如果被過度激活則可刺激蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖，進(jìn)而引發(fā)腫瘤[5]。雖然關(guān)于PI3K/AKT信號(hào)通路的研究較多，但該通路在腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不明確[6]。近年來，基因治療得到很大發(fā)展，即把正?；蚧蛑亟M后的具有治療作用的基因?qū)氲疆惓＜?xì)胞的DNA中，抑制致病、致癌基因的表達(dá)并修復(fù)缺陷及損傷基因[7]。目前，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路已成為多種腫瘤治療研究中的熱點(diǎn)[8]。

RNAi技術(shù)可導(dǎo)致目的基因表達(dá)下調(diào)，選擇性地沉默目的基因[9,10]。我們課題組通過RNAi技術(shù)沉默AKT基因表達(dá)[11]，觀察干擾后卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)情況，分析卵巢癌基因治療的機(jī)制[12]。Fas蛋白屬于TNF受體家族，其配基為FasL[13]。Fas/FasL凋亡通路是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、衰老細(xì)胞的主要途徑之一[14]。研究[15]表明，卵巢癌中Fas蛋白陽性表達(dá)率低于良性卵巢腫瘤，該蛋白表達(dá)增加可啟動(dòng)凋亡受體途徑[16]。Caspase-3蛋白是Caspase家族中最重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，在細(xì)胞凋亡早期被激活。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染AKT siRNA后，細(xì)胞增殖受到抑制，F(xiàn)asL、Caspase-3蛋白陽性表達(dá)率增高，提示抑制AKT基因表達(dá)后，PI3K/AKT信號(hào)通路作用受到影響，激活細(xì)胞凋亡程序，抑制細(xì)胞增殖，這些作用可能與調(diào)節(jié)FasL、Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。關(guān)于沉默AKT基因表達(dá)后調(diào)控Fas蛋白表達(dá)、激活凋亡受體途徑的具體機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 祝穎,王旭.RNAi技術(shù)應(yīng)用于婦科腫瘤治療的研究進(jìn)展[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2009,16(5):100-102.

[2] 梁玉林,胡明英,王小莉,等.RNA沉默PI3K、AKT基因?qū)θ寺殉睸KOV3細(xì)胞增殖和凋亡研究的比較[J].青島醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,4(1):1-3.

[3] 曾慧敏.PI3K/AKT通路與腫瘤治療[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2008,15(1):82-85.

[4] Liu X, Sempere LF, Galimberti F, et al. Uncovering growth-suppressive MicroRNAs in lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2009,15(4):1177-1183.

[5] 胡明英,畢學(xué)輝,劉曉文,等.RNA干擾沉默AKT基因?qū)β殉舶㏒KOV3細(xì)胞增值與凋亡影響研究[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(24):1869-1873.

[6] 劉穎,吳金如,高元?jiǎng)?Fas、FasL在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與腫瘤免疫和細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào),2011,32(1):86-91.

[7] Nakata W, Hayakawa Y, Nakagawa H, et al. Anti-tumor activity of the proteasom inhibitor bortezomib in gastric cancer[J]. Int J Oncol, 2011,39(6):1526-1529.

[8] 李震東,馬清涌,羅羽宏.Fas/FasL介導(dǎo)的Caspase-3活化與急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國(guó)病理生理雜志,2009,25(6):1197-1201.

[9] 王曉天.P38MAPK介導(dǎo)的Fas/Fasl凋亡信號(hào)通路在大鼠抗GBM腎炎中的作用[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2012,28(12):979-985.

[10] 張小芳,李守霞.RNA干擾技術(shù)的研究及進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(18):3040-3043.

[11] Ramachandran PV, Ignacimuthu S. RNA interferences as aplausi-bleanticancer the rapeutic tool[J]. Asian Pac T Cancer Prev, 2012,13(6):2445-2452.

[12] 魯艷明,銀鐸,孟麗榮,等.siRNA干擾XIAP基因?qū)β殉舶㏒KOV3細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(7):506-508, 520.

[13] Frias C, Pampalona J, Genesca A, et al. Telomere dysfunction and genome instability[J]. Front Biosci, 2012,17(11):2181-2196.

[14] 張興民,蔣明,鄭德先,等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人滑膜細(xì)胞增生與fas和Bcl-2基因的表達(dá)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1998,78(3):175-179.

[15] 張媛媛,蘇海燕,秦蘇萍,等.Fas/FasL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在大鼠抗腎炎中的作用[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(14):2122-2127.

[16] 臧穎,陳秋英,李玉瑩,等.NF- KappaB、p38MAPK和JNK通路在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷引起的大鼠病理性疼痛中的作用及機(jī)制[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(6):645-651.

(收稿日期：2015-10-07)

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)07-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.010

通信作者：胡明英(E-mail: humying001@sina.com)