植酸酮對宮頸癌細(xì)胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

王侃，高曉麗，田文艷，岳天孚

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

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植酸酮對宮頸癌細(xì)胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

王侃，高曉麗，田文艷，岳天孚

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

摘要：目的觀察植酸酮對宮頸癌細(xì)胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)Caski細(xì)胞株(含HPV16)與Hela細(xì)胞株(含HPV18)，將所有細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組和對照組，每組均包含Caski細(xì)胞和Hela細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組分別加入含58.6、117、586、5 860 mg/L植酸酮的培養(yǎng)液，對照組加入不含植酸酮的培養(yǎng)液。各組培養(yǎng)72 h后，采用real-time PCR法分別檢測HPV16/18 E6/E7 mRNA，采用Western blotting法檢測E6/E7蛋白。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組同一型別細(xì)胞中E6/E7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量低于對照組，且實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組E6/E7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，Caski細(xì)胞中E6/E7 mRNA相對表達(dá)量低于Hela細(xì)胞(P均<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)同一型別細(xì)胞中，E6 mRNA相對表達(dá)量低于E7 mRNA(P均<0.05)。結(jié)論 植酸酮可下調(diào)人宮頸癌細(xì)胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)，且作用呈劑量依賴性；植酸酮對HPV16 E6/E7 mRNA的抑制作用強(qiáng)于HPV18 E6/E7 mRNA，并可能以抑制E6 mRNA表達(dá)為主導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：植酸酮；人乳頭瘤病毒16；人乳頭瘤病毒18；E6蛋白；E7蛋白；宮頸癌；Caski細(xì)胞株；Hela細(xì)胞株

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要原因[1~3]。植酸酮是一種植物提取物，前期研究[4, 5]發(fā)現(xiàn)，植酸酮治療高危型HPV感染合并CIN Ⅰ有顯著療效，并能有效抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長。HPV基因整合進(jìn)人類宮頸細(xì)胞后，E6、E7蛋白表達(dá)失控，并與致癌基因p53、Rb相互作用，發(fā)揮致癌作用[6~8]。研究[9]表明，Caski細(xì)胞株和Hela細(xì)胞株分別整合了HPV16、HPV18基因，且不存在交叉。本研究觀察了不同濃度植酸酮對宮頸癌Caski細(xì)胞株(含HPV16)與Hela細(xì)胞株(含HPV18)中E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，為植酸酮抗HPV治療宮頸病變提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑Hela細(xì)胞由南開大學(xué)生命科學(xué)院劉新奇教授實(shí)驗(yàn)室惠贈，腺癌細(xì)胞，含HPV18基因；Caski細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所惠贈，鱗癌細(xì)胞，含HPV16基因；植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型(植酸酮1號)由天津賢博醫(yī)療科技有限公司惠贈。MTT購自上海生工生物工程股份有限公司，總RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司，辣根過氧化物酶、羊抗鼠免疫球蛋白二抗、鼠源性HPV18 E7 單克隆抗體購自Santa cruz biotechnology公司，鼠源性HPV16 E6+HPV18 E6 單克隆抗體、鼠源性HPV16 E7 單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2Caski、Hela細(xì)胞培養(yǎng)及植酸酮用藥方法取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞及Caski細(xì)胞，分別置于DMEM(完全高糖)培養(yǎng)基及RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。將所有細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組和對照組，每組均包含Caski細(xì)胞和Hela細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組分別加入含58.6、117、586、5 860 mg/L植酸酮的培養(yǎng)液，對照組加入不含植酸酮的培養(yǎng)液，各組均設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后進(jìn)行相關(guān)基因和蛋白檢測。

1.3各組細(xì)胞中HPV16/18 E6/E7 mRNA檢測提取各組總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)Genbank里的基因數(shù)據(jù)，使用Primer Premier6和Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物序列。內(nèi)參為β-actin。設(shè)定對照基因表達(dá)量為100，以目的基因占對照基因相對百分含量代表目的基因表達(dá)量。

1.4各組細(xì)胞中HPV16/18 E6/E7蛋白檢測裂解細(xì)胞，離心，留取樣本用BCA法測定蛋白濃度，制備分離膠、濃縮膠，上樣，電泳。將電泳后凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，ECL顯色曝光。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組同一型別細(xì)胞中E6/E7 mRNA相對表達(dá)量低于對照組，且實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組E6/E7 mRNA相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，Caski細(xì)胞中E6/E7 mRNA相對表達(dá)量低于Hela細(xì)胞(P均<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)同一型別細(xì)胞中，E6 mRNA相對表達(dá)量低于E7 mRNA(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組同一型別細(xì)胞中E6/E7蛋白相對表達(dá)量低于對照組，且實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組E6/E7蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組細(xì)胞中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與對照組同一型別細(xì)胞相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組同一型別細(xì)胞相比，#P<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組同一型別細(xì)胞相比，△P<0.05；與實(shí)驗(yàn)3組同一型別細(xì)胞相比，☆P<0.05；與同組內(nèi)Caski細(xì)胞相比，＊P<0.05；與同組、同一型別細(xì)胞中E7 mRNA表達(dá)量相比，※P<0.05。

3討論

宮頸癌已經(jīng)明確為感染性疾病，HPV疫苗的開發(fā)為宮頸癌的防治開辟了新的途徑。但對于已經(jīng)感染HPV者，目前尚無療效確切的藥物。植酸酮婦科清洗裝置分為1號和2號兩種，前者主要用于清除HPV，后者主要用于治療后的養(yǎng)護(hù)及鞏固療效。植酸酮婦科清洗裝置的活性成分為植物提取素，含植酸、硅酮、黃酮等。我們前期研究[4,5]表明，植酸酮婦科清洗裝置2號治療高危型HPV感染合并CIN Ⅰ療效顯著，且該藥對含HPV16基因的Caski細(xì)胞株和含HPV18基因的Hela細(xì)胞株有增殖抑制作用，作用呈劑量依賴性。

目前認(rèn)為HPV主要通過E6、E7蛋白發(fā)揮致癌作用。HPV誘發(fā)宮頸癌可分為三個過程：HPV DNA整合到宿主細(xì)胞DNA中，E6、E7表達(dá)失控，E6、E7蛋白發(fā)揮致癌作用[10~12]。HPV基因整合進(jìn)人類宮頸細(xì)胞后，E6、E7基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的蛋白是病毒復(fù)制至關(guān)重要的分子。在HPV導(dǎo)致的宮頸細(xì)胞惡變過程中，E6、E7蛋白還與p53、Rb之間存在相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞代謝，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[13~15]。

本研究以不同濃度植酸酮作用于Caski細(xì)胞株、Hela細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)植酸酮對宮頸癌細(xì)胞中E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)均有抑制作用，且作用呈劑量依賴性；各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，Caski細(xì)胞中E6/E7 mRNA相對表達(dá)量低于Hela細(xì)胞；各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)同一型別細(xì)胞中，E6 mRNA相對表達(dá)量低于E7 mRNA。上述結(jié)果提示，植酸酮對宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制作用可能是通過下調(diào)HPV16/18 E6/E7基因及蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。研究[16]表明，將E6基因轉(zhuǎn)染到上皮細(xì)胞內(nèi)，可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，E6基因本身即有較強(qiáng)的致癌作用。本實(shí)驗(yàn)中，植酸酮對HPV16基因的抑制作用強(qiáng)于HPV18基因，并可能以抑制E6 mRNA表達(dá)為主。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，植酸酮對人宮頸癌細(xì)胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表達(dá)有抑制作用，且作用呈劑量依賴性；植酸酮對不同型別宮頸癌細(xì)胞株中HPV E6、E7 mRNA的抑制作用也存在差異。然而，由于體內(nèi)和體外環(huán)境差異巨大，植酸酮在體內(nèi)的作用是否與體外實(shí)驗(yàn)相同，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effect of phytic acid ketone on expression of HPV16/18 E6/E7 mRNA and protein in human cervical cancer cell line

WANGKan,GAOXiaoli,TIANWenyan,YUETianfu

(TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of phytic acid ketone on expression of HPV 16/18 E6/E7 mRNA and protein in human cervical cancer cells. MethodsThe Caski cells (containing HPV16) and Hela cells (containing HPV18) were cultivated in vitro and then divided into the experimental groups 1, 2, 3, 4 and the control group (each group contained Caski cell line and Hela cell line). The experimental groups 1, 2, 3, 4 were respectively treated with different concentrations of phytic acid ketone (58.6 mg/L, 117 mg/L, 586 mg/L, 5 860 mg/L) for 72 h. The levels of HPV16/18 E6/E7 mRNA were determined with real-time PCR. Western blotting was used to measure the expression levels of E6 and E7 proteins. ResultsE6/E7 mRNA and protein expression in the same type of cells of the experimental groups 1, 2, 3 and 4 was lower than that of the control group, and the E6/E7 mRNA and protein expression showed a decreasing tendency in the experimental groups 1, 2, 3 and 4 (all P<0.05). In each experimental group, E6/E7 mRNA expression in Caski cells was lower than that in Hela cells (all P<0.05).In the same type of cells of the experiential groups, the E6 mRNA expression was lower than that of E7 mRNA (all P<0.05). ConclusionsPhytic acid ketone could down-regulate the expression of E6/E7 mRNA and protein in human cervical cancer lines, which was in a dose-dependent manner. The inhibitory effect of phytic acid ketone on HPV16 E6/E7 mRNA was stronger than that on HPV18 E6/E7 mRNA and the suppression of E6 probably played a leading role.

Key words:phytic acid ketone; human papillomavirus 16; human papillomavirus 18; E6 protein; E7 protein; cervical carcinoma; Caski cell line; Hela cell line

(收稿日期：2015-12-01)

中圖分類號：R711.74

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)07-0010-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.004

通信作者簡介：岳天孚(1951-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail: yuetianfu163@163.com

作者簡介：第一王侃(1983-)，男，碩士，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail: waking119@hotmail.com