10種中草藥提取物對烤煙白粉病菌的抑制活性

周建云，刁朝強(qiáng)＊，廖 勇，譚 建，黃 寧，聶忠揚(yáng)，桑維鈞，石春發(fā)

（1．貴州省煙草公司貴陽市公司，貴州貴陽550002；2．貴州大學(xué)，貴州貴陽550025）

10種中草藥提取物對烤煙白粉病菌的抑制活性

周建云1，刁朝強(qiáng)1＊，廖 勇1，譚 建1，黃 寧1，聶忠揚(yáng)1，桑維鈞2，石春發(fā)2

（1．貴州省煙草公司貴陽市公司，貴州貴陽550002；2．貴州大學(xué)，貴州貴陽550025）

為有效挖掘植物源殺菌劑資源，以烤煙白粉病菌為供試菌種，采用菌絲生長速率法研究10種中草藥提取物的抑制活性，并在此基礎(chǔ)上選取抑菌活性較強(qiáng)的幾種提取物進(jìn)行毒力測定。結(jié)果表明：10種中草藥通過3種提取法得到的提取物均對烤煙白粉病菌有抑制作用。其中，蛇床子醇提物的抑制率最高，達(dá)100%；其次是蛇床子鹽提物和黃藥子水提物，分別為94．36%和87．57%。蛇床子醇提物、蛇床子鹽提物和肉豆蔻醇提物的室內(nèi)毒力EC50分別為57．54mg／L、110．00mg／L和225．39mg／L，以蛇床子醇提物的抑制效果最佳。

白粉??；中草藥；提取物；毒力測定

近幾年，白粉病已成為貴陽煙區(qū)危害烤煙的主要病害之一，其大量發(fā)生導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收，給煙農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病在苗期和大田前期有零星發(fā)生，每年6—7月烤煙正處于旺長期前后，如遇陰雨寡照天氣，白粉病將大量爆發(fā)且很快流行蔓延［13］，烤煙下部葉甚至中部葉感染白粉菌，輕則降低煙葉品質(zhì)，重則失去烘烤價值。采烤的發(fā)病葉片在調(diào)制過程中病斑仍會繼續(xù)擴(kuò)大，葉片薄如紙狀易破碎呈糊片，缺乏彈性，喪失經(jīng)濟(jì)價值［4］。

防治烤煙白粉病常用方法有選育抗病品種、改進(jìn)栽培措施及化學(xué)農(nóng)藥防治。目前，國內(nèi)烤煙品種對白粉病抗性較弱，化學(xué)農(nóng)藥防治雖見效快、價格低，但農(nóng)藥殘留將對煙葉品質(zhì)安全造成嚴(yán)重影響。生物殺菌劑多為微生物和植物源殺菌劑，其中，微生物殺菌劑主要有農(nóng)用抗生素、細(xì)菌殺菌劑、真菌殺菌劑和病毒殺菌劑等［5－8］；植物源殺菌劑則采用植物汁液、干粉、提取物或經(jīng)分離得到的有效成分制成具有農(nóng)藥活性的制劑［9－11］，其使用對人畜安全、無污染、低毒、低殘留，因此，生物農(nóng)藥已成為農(nóng)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，植源殺菌劑也越來越為人們所重視。目前，采用中草藥提取植物源殺菌劑防治白粉病的研究已有文獻(xiàn)報道［12－16］，主要集中于黃瓜等作物的白粉病防治，未見植物源殺菌劑防治烤煙白粉病的研究報道。為有效挖掘防治烤煙白粉病菌的植物源殺菌劑資源應(yīng)用于烤煙生產(chǎn)，筆者采用菌絲生長速率法研究10種中草藥不同提取法（鹽提法、醇提法和水提法）提取物的抑制活性，并在此基礎(chǔ)上選取抑菌活性較強(qiáng)的幾種提取物進(jìn)行毒力測定。

1材料與方法

1．1供試材料

1．1．1中藥材10種中藥材原料（表1），從貴陽市中藥材市場采購。

1．1．2病原菌 烤煙白粉病菌（Powdery mildew）采自貴陽主產(chǎn)煙區(qū)感染白粉病的煙株，經(jīng)接種保存于貴州大學(xué)植物病理教研室恒溫培養(yǎng)箱。

表1 10種供試中草藥名錄及提取部位Table 1 List and extracted part of the ten tested herbal medicines

1．1．3化學(xué)藥劑15%三唑酮WP，四川迪美生物科技有限公司生產(chǎn)。

1．1．4培養(yǎng)基及其他 水瓊脂培養(yǎng)基（20g瓊脂粉＋1 000mL水），60mm培養(yǎng)皿、無菌水、無菌操作臺、電子天平、藥管、高壓滅菌鍋及移液槍等。

1．2試驗(yàn)方法

1．2．1中草藥提取物提取方法 取中草藥10g浸泡于45mL裝好水、生理鹽水或無水乙醇等帶塞的250mL滅菌錐形瓶中（稀釋10倍，原藥濃度以0．1 g／mL計(jì)），置于恒溫水浴搖床中進(jìn)行震蕩，至藥劑完全混合后（約60min），離心5min（5 000轉(zhuǎn)／min），用4層滅菌紗布將上清液過濾，并置于滅菌試管中備用。

1．2．2試驗(yàn)設(shè)計(jì)1）提取物對烤煙白粉病菌孢子萌發(fā)的影響。真菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)（水瓊脂法）。將配制好的水瓊脂培養(yǎng)基置入60mm培養(yǎng)皿中制成平板，將10種中草藥提取物配制成400×液，用移液槍分別吸取每種提取物1mL浸漬于對應(yīng)培養(yǎng)皿平板（保持平板濕潤）后接種煙草白粉菌分生孢子，將培養(yǎng)皿封閉好放置于25℃的光照培養(yǎng)箱中（12h光照、12h黑暗）培養(yǎng)24h，然后用10×10倍顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，以孢子芽管長度大于分生孢子寬作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每個處理重復(fù)3個以上視野，調(diào)查孢子萌發(fā)數(shù)，總數(shù)不得少于200個。分別記錄萌發(fā)數(shù)和調(diào)查孢子總數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率（R）。

式中，Ng為孢子萌發(fā)數(shù)，Nt為調(diào)查孢子總數(shù)。

2）提取物對烤煙白粉病菌的毒力測定。選取白粉菌孢子萌發(fā)率最低的幾種中草藥提取物，即抑制效果較好的提取物進(jìn)行不同濃度毒力測定，從中篩選最佳濃度，為大田試驗(yàn)示范提供基礎(chǔ)依據(jù)。將其配制成50mg／L、100mg／L、250mg／L、500mg／L和1 000mg／L 5個濃度，用移液槍分別吸取每個濃度提取物1mL浸漬于對應(yīng)培養(yǎng)皿平板后接種煙草白粉菌分生孢子，將培養(yǎng)皿封閉好放置于25℃的光照培養(yǎng)箱中（12h光照、12h黑暗）培養(yǎng)24h，然后用10×10倍顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。其余步驟同上。分別記錄萌發(fā)數(shù)和調(diào)查孢子總數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率、校正孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)相對抑制率。將孢子萌發(fā)抑菌率轉(zhuǎn)換成抑菌幾率值（y），殺菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)值（x），根據(jù)殺菌劑質(zhì)量濃度對數(shù)與抑菌幾率值，采用回歸法求得不同殺菌劑對供試菌株的毒力回歸方程y＝ax＋b，并計(jì)算毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)r和EC50。

式中，Re為處理校正孢子萌發(fā)率，Rt為處理孢子萌發(fā)率，R0為空白對照孢子萌發(fā)率，I為孢子萌發(fā)相對抑制率。

1．3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2．1 10種中草藥提取物對烤煙白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制效果

從表2可知，10種中草藥不同提取法提取物對烤煙白粉病菌均有不同程度的抑制作用。

1）鹽提法。10種中草藥鹽提取物對烤煙白粉病菌孢子萌發(fā)均存在不同程度的抑制作用。其中，蛇床子鹽提取物的萌發(fā)率最低，僅5．64%；其次是白術(shù)，為11．25%；第3是肉豆蔻，為12．43%。萌發(fā)率超過15%的有6種，以益母草最高，為34．69%。表明，蛇床子、白術(shù)及肉豆蔻鹽提取物對烤煙白粉病菌的抑制效果較好。

2）醇提法。10種中草藥醇提取物對烤煙白粉病菌孢子萌發(fā)均存在不同程度的抑制效果。其中，蛇床子醇提取物的萌發(fā)率最低，為0；其次是肉豆蔻，為4．19%；第3是白術(shù)，為12．41%。萌發(fā)率超過15%的有7種，以益母草最高，為48．38%。表明，蛇床子、白術(shù)及肉豆蔻醇提取物對烤煙白粉病菌的抑制效果較好。

3）水提法。10種中草藥水提取物對烤煙白粉病菌孢子萌發(fā)均存在不同程度的抑制效果。其中，黃藥子水提取物的萌發(fā)率最低，為12．43%；其次是白術(shù)和肉豆蔻，均為13．83%；第3是蛇床子，為14．30%。萌發(fā)率超過15%的有6種，以益母草最高，為25．31%。表明，黃藥子、蛇床子、白術(shù)及肉豆蔻水提取物對烤煙白粉病菌的抑制效果較好。

綜上可知，10種中草藥不同提取物400×稀釋液，除蛇床子鹽提取物、蛇床子醇提取物和肉豆蔻醇提取物萌發(fā)率小于或接近5%外，其余提取物的萌發(fā)率均高于10%。因此，選取此3種提取物進(jìn)一步進(jìn)行白粉病菌抑制作用及室內(nèi)毒力測定。

2．2不同濃度中草藥提取物對烤煙白粉病菌孢子的毒力測定

由表3可知，不同濃度提取物通過空白對照校正后均對白粉病菌孢子萌發(fā)存在不同程度的抑制作用，且隨著濃度增加3種提取物對孢子萌發(fā)抑制作用增強(qiáng)。其中，3種提取物濃度為1 000．0mg／L時，其白粉病菌孢子萌發(fā)率分別為7．65%、5．51% 和3．42%。

表2 10種中草藥不同提取法提取物處理烤煙白粉病菌孢子的萌發(fā)率Table 2 Germination rate of tobacco powdery mildew spores treated with ten herbal medicine extracts by different extraction methods

由表4可知，蛇床子鹽提物濃度為50．0～1 000．0mg／L時，其抑制率為42．19%～92．35%；相同濃度下，蛇床子醇提物的抑制率為75．20%～94．40%，肉豆蔻醇提物的抑制率為67．01%～96．58%。表明，蛇床子醇提物隨濃度提高其抑制率增幅最小，其次為肉豆蔻醇提物，蛇床子鹽提物的增幅最大。采用回歸法得3種提取物對烤煙白粉病菌的毒力回歸方程分別為y蛇床子鹽提物＝2．475 3＋1．236 7x、y蛇床子醇提物＝3．7 1 3 6＋0．7 3 0 9 x和y肉豆蔻醇提物＝0．230 3＋2．027 2x，其相關(guān)系數(shù)均達(dá)0．9以上，表明，各濃度與孢子萌發(fā)率呈較好的線性關(guān)系。3種提取物的EC50依次為醇提蛇床子（57．54mg／L）＜鹽提蛇床子（110．00mg／L）＜醇提肉豆蔻（225．39mg／L）。

表3 3種中草藥提取物不同濃度處理烤煙白粉病菌孢子的萌發(fā)率Table 3 Germination rate of tobacco powdery mildew spores treated with different concentrations of the three herbal medicine extracts

表4 3種中草藥提取物不同濃度對烤煙白粉病菌的毒力Table 4 Toxicity of various concentrations of three herbal medicine extracts against tobacco powdery mildew

3結(jié)論與討論

10種中草藥不同提取法提取物對烤煙白粉病菌均有不同程度的抑制作用。其中，鹽提取物以蛇床子的抑制效果最好，抑制率達(dá)94．36%；其次為白術(shù)，達(dá)88．75%；醇提取物以蛇床子的抑制效果最好，抑制率達(dá)100%；其次是肉豆蔻，達(dá)95．81%；水提取物以黃藥子抑制效果最好，抑制率達(dá)87．57%；其次為白術(shù)和肉豆蔻，均達(dá)86．17%。

試驗(yàn)選取抑制率在95%左右的蛇床子鹽提取物、蛇床子醇提取物和肉豆蔻醇提取物等3種提取物進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，隨著提取物濃度的提高，抑制率均有所提高。其中，以蛇床子醇提物的毒力最高，其EC50為57．54mg／L。3種提取物建立的毒力方程其相關(guān)系數(shù)均達(dá)0．9以上，表明各濃度與孢子萌發(fā)率呈較好的線性關(guān)系。

該試驗(yàn)結(jié)果僅為室內(nèi)毒力測定效果，不能完全代表對烤煙白粉病菌的抑制作用，還需進(jìn)行田間活體煙株防治試驗(yàn)加以驗(yàn)證。但本次試驗(yàn)篩選的結(jié)果對防治烤煙白粉病菌提供了理論依據(jù)，也為今后進(jìn)一步篩選中草藥防治白粉病奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：王 海）

Inhibitory Activity of Ten Herbal Medicine Extracts Against Powdery Mildew of Flue－cured Tobacco

ZHOU Jianyun1，DIAO Chaoqiang1＊，LIAO Yong1，TAN Jian1，HUANG Ning1，NIE Zhongyang1，SANG Weijun2，SHI Chunfa2

（1．Guiyang Branch Compangy，Guizhou Tobacco Company，Guiyang，Guizhou550002；2．Guizhou University，Guiyang，Guizhou550025，China）

For excavating botanical fungicide resources effectively，the inhibition activity of ten herbal medicine extracts was studied by mycelial growth rate method with tobacco powdery mildew as the test object，on this basis，the toxicity test of some extracts with stronger inhibition activity was conducted．Results：All the ten herbal medicine extracts with three different extraction methods inhibited tobacco powdery mildew．The inhibition rate of alcohol extract of Cnidium monnieri was the highest（100%），followed by salt extract of C．monnieri and water extract of Dioscorea bulbifera（94．36%and 87．57% respectively）．The indoor toxicity EC50of alcohol extract of C．monnieri，salt extract of C．monnieri and myristyl alcohol extract were respectively 57．54mg／L，110．00mg／L and 225．39mg／L．Alcohol extract of C．monnieri was of the best inhibition effect．

powdery mildew；herbal medicine；extracts；toxicity test

S572．435；S482．2＋92

A

1001－3601（2016）11－0465－0065－04

2016－09－28；2016－10－19修回

中國煙草總公司貴州省公司項(xiàng)目“貴陽市煙草白粉病防控體系建設(shè)與技術(shù)集成研究”（201309）

周建云（1980－），男，農(nóng)藝師，從事烤煙營養(yǎng)研究與推廣工作。E－mail：zhhee2005＠126．com

＊通訊作者：刁朝強(qiáng)（1968－），男，高級農(nóng)藝師，從事烤煙生產(chǎn)技術(shù)研究與推廣工作。E－mail：dcq2120＠163．com